Name: large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

M.B. поддерживается IMPRS-PMPG «Первичный метаболизм и рост растений». A.R.F. и S.A. признают финансовую поддержку Программы исследований и инноваций ЕС Horizon 2020, проекта PlantaSYST (SGA-CSA No 739582 под FPA No 664620) и проекта INCREASE (GA 862862).

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Как GC-MS, так и LC-MS являются широко используемыми инструментами для профилирования сложных смесей различных классов метаболитов. Обработка больших наборов данных с помощью этих инструментов по своей сути связана с небиологической вариацией, например, аналитической вариацией, которая мешает и искажает интерпретацию результатов. Этот протокол представляет собой надежный и высокопроизводительный экстракционный конвейер для всестороннего метаболического профилирования для устранения вариаций небиологического происхождения и проведения крупномасштабных исследований «омики». Объемы и концентрации, используемые в этом протоколе, были скорректированы для видов бобовых в различных тканях. Однако эти параметры могут быть слегка изменены и использованы для крупномасштабных метаболических образцов других видов растений.
Ранее15 описанных экстракций на основе МТБЭ могут быть использованы для анализа дериватизированных метаболитов, полуполярных метаболитов и липидов. Это может быть расширено для экстракции белка и растительных гормонов39, которые были вне сферы действия этого протокола. Другие протоколы экстракции основаны на смесях дихлорметана:этанола40,41. Из этих протоколов экстракции протокол МТБЭ:метанол обеспечивает благоприятную и менее опасную альтернативу существующим протоколам экстракции42 на основе хлороформа и не приводит к образованию белковой гранулы в виде интерфазы между полярной и липидной фазами. Кроме того, методы МТБЭ уже использовались в нескольких исследованиях для различных биологических образцов 43,44,45.
В этом протоколе обсуждается несколько важных шагов, которые могут привести к потенциальному изменению при обработке большого количества образцов, например, во время сбора12,13, экстракции14, а также рандомизации46. Кроме того, существуют дополнительные вопросы, которые не обсуждались в настоящем протоколе, которые должны быть рассмотрены для обеспечения высококачественных метаболомных данных, например, матричный эффект и подавление ионов14.
Мощность методов нормализации на основе КК по своей сути зависит от количества образцов КК в каждой партии. Как упоминалось ранее, хотя увеличение числа увеличит мощность, внутрисерийное изменение КК относительно незначительно по сравнению с межсерийным изменением в этих аналитических системах, как показано на рисунке 3. В целом, существуют и другие методы нормализации на основе контроля качества, такие как системное удаление ошибок с использованием случайного леса (SERRF), которые, как было показано, превосходят большинство других методов нормализации, таких как пакетное соотношение, нормализация с использованием оптимального выбора нескольких внутренних стандартов (NOMIS) и вероятностная нормализация коэффициентов (PQN)47. . Тем не менее, SERRF полагается на несколько образцов QC в каждой партии, например, каждый десятый образец, что неосуществимо при обработке большого количества образцов. Основное преимущество нормализации на основе КК по сравнению с другими методами, основанными на данных или внутренними стандартами, заключается в том, что она сохраняет существенные биологические вариации, приспосабливаясь к нежелательным техническим вариациям28. Читатели могут обратиться к этому обзору по обращению с вариантом28.
Одной из основных проблем в GWAS является частота ложных срабатываний, которые возникают в основном из-за связи причинно-следственных и непричинных сайтов48,49. Во-вторых, консервативные подходы статистической коррекции, например, Бонферрони и Рузвельта, корректируют количество независимых тестов, которое не равно количеству анализируемых SNP в GWAS из-за связи между ближайшими SNP 50,51 Поэтому фактическое количество независимых тестов часто ниже. Другим способом снижения консервативного статистического порога могло бы стать уменьшение числа тестируемых SNP, используемых для GWAS, на основе распада связей над определенными геномнымиобластями 52. GwAS-интегрированная высокопроизводительная метаболомическая платформа, описанная в этом протоколе, имеет широкий спектр применений. В частности, это будет способствовать улучшению селекции сельскохозяйственных культур путем изменения состава метаболитов/липидов в соответствии с промышленными и питательными потребностями. В целом, метаболомика дала глубокое понимание генетической архитектуры множества метаболитов и метаболической диверсификации, которые произошли во время одомашнивания сельскохозяйственных культур за последние десятилетия, что указывает на огромный потенциал метаболомики-ассоциированной селекции53. Молекулярно-биологические подходы к последующей валидации QTL включают генерацию мутантных линий54 CRISPR/Cas9, линий вставкиТ-ДНК 55, стабильных и/или преходящих линий сверхэкспрессии56, VIGS, подходов ex vivo метаболомики57 рядом с традиционным подходом к генерации кросс-популяций F2, а также перекрестную валидацию в разных популяциях.
Выполняя необходимую коррекцию аналитических вариаций, как описано выше, в дополнение к GWAS может быть выполнено несколько интегрированных подходов, таких как метаболит-метаболит, метаболит-липидный корреляционный анализ, корреляционный анализ к феномическим данным, чтобы пролить свет на более сложные признаки, и/или анализ коэкспрессии для дальнейшего разгадывания основы биологических систем58.

Крупномасштабные «омические» подходы позволили проанализировать сложные биологические системы 1,2,3 и понять связь между генотипами и результирующими фенотипами4. Метаболомика с использованием сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (UHPLC-MS) и GC-MS позволила обнаружить множество признаков метаболитов, из которых только некоторые аннотированы в определенной степени, что приводит к высокой доле неизвестных метаболитов. Сложные взаимодействия могут быть изучены путем объединения крупномасштабной метаболомики с лежащей в основе генотипической вариацией разнообразной популяции5. Однако обработка больших наборов образцов по своей сути связана с аналитическими вариациями, искажающими оценку метаболической дисперсии для дальнейших последующих процессов. В частности, основные проблемы, приводящие к аналитическим изменениям, основаны на производительности машины и инструментальном дрейфе во времени6. Интеграция вариантов от партии к партии является сложной и особенно проблематичной при анализе крупномасштабных структурированных популяций растений. Было предложено несколько процедур нормализации для исправления небиологических вариаций, например, использование внутренних, внешних и изотопных внутренних стандартов для исправления аналитических ошибок, каждая из которых по своей сути связана с известными проблемами и подводными камнями 7,8,9,10.
В дополнение к аналитическим вариациям, выбор протоколов экстракции обычно варьируется в зависимости от аналитического метода. В конечном счете, желательно снизить материальные и трудовые затраты, а также необходимость использования нескольких аликвот одного и того же образца для различных аналитических процессов путем выполнения методов экстракции на основе разделения фаз. Эти методы были впервые введены с использованием хлороформа: метанола/водных растворителей для фракционирования полярных и гидрофобных соединений11.
Этот протокол описывает быстрый высокопроизводительный конвейер для мультиомической платформы для профилирования как полярных метаболитов, так и липидов в бобовых видах. Кроме того, он показывает, как эти наборы данных могут быть соответствующим образом скорректированы для аналитического изменения и нормализованы перед интеграцией генотипической информации для обнаружения локусов количественных признаков метаболитов (QTL) путем выполнения GWAS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>FAME solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovitexin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>38953-85-4</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignoceric Acid Methylester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2442-49-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamin -hydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>593-56-6</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl laurate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-82-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl myristate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>124-10-7</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl palmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-39-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl stearate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-61-8</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-caprat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>110-42-9</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcaprylat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-11-5</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyldocosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>929-77-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyleicosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1120-28-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-hexacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5802-82-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-octacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55682-92-3</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-pelargonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1731-84-6</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>24589-78-4</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>110-86-1</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribitol</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>22566-17-2</td>
			<td>Internal standard for derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triacontanoic Acid Methyl Ester</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>629-83-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &#181;m</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>123-3832</td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS system</td>
			<td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Balls, Stainless Steel</td>
			<td>OPS DIAGNOSTICS</td>
			<td>GBSS 196-2500-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Q Exactive Focus (Q Exactive&#8482; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&#8482; 
			Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinding mixer mill</td>
			<td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetAlign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MzMine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;data.table&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;fujiplot&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pleiotrpoic map</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;genetics&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;Ime4&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BLUPs calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;LDheatmap&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LD plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;MASS&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;rMVP&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GWAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 4.0.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS Genedata</td>
			<td>Expressionist</td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization

Как газовая хроматография-масс-спектрометрия (GC-MS), так и жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS) являются широко используемыми метаболомическими подходами для обнаружения и количественной оценки сотен тысяч признаков метаболитов. Однако применение этих методов к большому количеству образцов подвержено более сложным взаимодействиям, особенно для общегеномных ассоциативных исследований (GWAS). Этот протокол описывает оптимизированный метаболический рабочий процесс, который сочетает в себе эффективную и быструю пробоподготовку с анализом большого количества образцов на бобовые культуры. Этот слегка модифицированный метод экстракции был первоначально разработан для анализа тканей растений и животных и основан на экстракции в метил-трет-бутиловый эфир: растворитель метанола, позволяющий захватывать полярные и липидные метаболиты. Кроме того, мы предоставляем пошаговое руководство по сокращению аналитических вариаций, которые необходимы для высокопроизводительной оценки метаболической дисперсии в GWAS.

Успешные эксперименты по метаболомике GWAS должны начинаться с правильного экспериментального проектирования, за которым следует сбор образцов, извлечение, сбор и обработка данных, как показано на рисунке 1. В этом протоколе метод15 МТБЭ использовался для извлечения и анализа сотен метаболитов, принадлежащих к нескольким классам соединений. Хроматография сильно зависит от свойств используемой колонки, а также элюционных буферных смесей. На рисунке 2 показаны хроматограммы образцов QC, указывающие на картину элюирования некоторых основных классов липидов в этой аналитической системе. Применяемые градиенты для каждой платформы приведены в таблице 1. Большое внимание уделялось обработке системных ошибок в крупномасштабных экспериментах. Выполнение крупномасштабной метаболомики по своей сути связано с системными ошибками. Для демонстрации мы проанализировали липидомические данные по нескольким распространенным видам бобов. В дополнительной таблице 1 приведены извлеченные необработанные липидомные данные, полученные после обработки хроматограммы с использованием программного обеспечения, указанного в Таблице материалов. Следование этому протоколу позволило нам обойти основные проблемы при работе с омическими данными, особенно при обработке больших наборов выборок. Процедура нормализации приводит к точной коррекции пакетных аналитических ошибок, как показано на рисунке 3. Хотя увеличение количества образцов контроля качества увеличит мощность нормализации, это не всегда осуществимо из-за ограничений по стоимости и времени. Для высокопроизводительной метаболомики GWAS с нецелевыми метаболическими особенностями важно соответствующим образом проиллюстрировать более высокое количество ассоциаций признаков-маркеров. Плейотропная карта38, объединяющая несколько результатов GWAS, может быть использована для выделения геномных областей, с которыми связаны несколько признаков (рисунок 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg"> Рисунок 1: Блок-схема ГВАС на основе метаболомики в растениях. Несколько шагов, начиная от экспериментального проектирования до обнаружения QTL, показаны на левой панели. На правой панели показано несколько рисунков, поддерживающих несколько шагов, упомянутых на левой панели. Начиная с правого верха, (1) показана предложенная последовательность образцов для LC-MS, (2) графики PCA до и после нормализации, включая репрезентативное распределение признаков до и после обработки, с красным цветом, указывающим интенсивность выборки QC, и (3) манхэттенский график со значительными ассоциациями, к которым были сгенерированы распределения LD и гаплотипов. Сокращения: GWAS = общегеномные ассоциативные исследования; QTL = количественные локусы признаков; PCA = анализ главных компонентов; QC = контроль качества; LD = неравновесие связи; MS = масс-спектрометрия; LC-MS = жидкостная хроматография-масс-спектрометрия; GC-MS = газовая хроматография-масс-спектрометрия; LOESS = локально оцененное сглаживание диаграммы рассеяния; MLM/MLMM = смешанная линейная модель/мультилокусная смешанная модель. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg"> Рисунок 2: Обработка хроматограммы. Две хроматограммы КК (базовый пик; липидные данные) из разных партий демонстрируют вариации по партиям для определенных классов липидов в объединенных образцах КК. Четыре основных класса липидов обозначены соответствующими элюционными окнами в собственной системе LC-MS. Хроматограммы были экспортированы из MzMine21. Сокращения: QC = контроль качества; LC-MS = жидкостная хроматография-масс-спектрометрия. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg"> Рисунок 3: Исправление систематической ошибки. Принципиально-компонентный анализ полученных липидомных данных, пре- (левые, необработанные данные) и посткоррекция системных ошибок (правый, пакетный лёсс). Нижние панели иллюстрируют распределение признаков (Cluster_00005) по образцам (n=650) и партиям (n=10) до (слева) и после (справа) для аналитического изменения. Сокращения: PCA = анализ главных компонентов; QC = контроль качества; LOESS = локально оцененное сглаживание диаграммы рассеяния. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg"> Рисунок 4: Плейотропная карта, иллюстрирующая объединенные результаты GWAS. Плейотропная карта выделяет области во всем геноме, которые связаны с несколькими признаками. Цифры на внешних кольцах указывают на соответствующие хромосомы. Каждый круг представляет собой индивидуальную черту со своими значительно связанными SNP. Цвета представляют различные составные классы (серый = составной класс 1; зеленый = составной класс 2; фиолетовый = составной класс 3; желтый = составной класс 4). В случае межсоединенных классовых ассоциаций с одной и той же геномной областью выделяют гены. Внутренний серый круг показывает сумму всех значимых SNP, связанных с определенным геномным положением. Ассоциации, показанные на этом рисунке, искусственно генерируются только для иллюстрации. Сокращения: GWAS = общегеномные ассоциативные исследования; SNP = однонуклеотидные полиморфизмы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">Настройки UHPLC-MS для липидов</td>
		</tr>
<tr>
<td>Время [мин]</td>
			<td>Элюент от А до В [%]*</td>
			<td colspan="3">Информация</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>45% А</td>
			<td colspan="3">Элюент A: 1% 1M NH 4-ацетат, 0,1% уксусной кислоты в воде (марка UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>lg 45% - 25% A</td>
			<td colspan="3">Элюент B: 1% 1M NH 4-ацетат, 0,1% уксусной кислоты в ацетонитриле / 2-пропаноле 7: 3 (класс UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>lg 25% - 11% A</td>
			<td colspan="3">
Расход: 400 мкл/мин</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>lg 11% - 0% A</td>
			<td colspan="3">
Объем впрыска: 2 мкл</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>cw 0% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.50-19.51</td>
			<td>0% - 45% А</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.51-24.00</td>
			<td>экв. 45%</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Настройки UHPLC-MS/MS для полярных и полуполярных метаболитов</td>
		</tr>
<tr>
<td>Время [мин]</td>
			<td>Элюенты A и B [%]*</td>
			<td colspan="3">Информация</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>99% А</td>
			<td colspan="3">Элюент А: 0,1% муравьиной кислоты в воде (класс UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>lg 99% -60% A</td>
			<td colspan="3">Элюент B: 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (класс UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>lg 60% - 30% A</td>
			<td colspan="3">
Расход: 400 мкл/мин</td>
		</tr>
<tr>
<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>lg 30% - 1% A</td>
			<td colspan="3">
Объем впрыска: 3 мкл</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>cw 1% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>lg 1% - 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>экв. 99% А</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Настройки GC-MS для производных метаболитов</td>
		</tr>
<tr>
<td>Время [мин]</td>
			<td>Температура [°C]</td>
			<td colspan="3">Информация</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">
Газ-носитель: Гелий</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>лг 80 - 330</td>
			<td colspan="3">
Расход: 2 мл/мин</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>cw 330</td>
			<td colspan="3">
Температурный градиент: 15 °C/мин</td>
		</tr>
<tr>
<td>24.66</td>
			<td>быстрое охлаждение</td>
			<td colspan="3">
Объем впрыска: 1 мкл</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Градиентные настройки для каждой из аналитических платформ7. Сокращения: lg = линейный градиент; cw = мойка колонны; eq = равновесие; UHPLC-MS = сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия; UHPLC-MS/MS = сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия; GC-MS = газовая хроматография-масс-спектрометрия. * = процентное значение соответствует элюенту А; оставшееся процентное значение соответствует элюенту B.
Дополнительная таблица 1: Необработанные липидомические данные. Указывает пиковые интенсивности для каждого из обнаруженных кластеров над каждым образцом. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

В этом протоколе мы представляем оптимизированный рабочий процесс, который сочетает в себе эффективную и быструю пробоподготовку многих образцов. Кроме того, мы предоставляем пошаговое руководство по сокращению аналитических вариаций для высокопроизводительной оценки метаболических исследований GWAS.

Крупномасштабные мультиомные исследования геномных ассоциаций (Mo-GWAS): руководство по подготовке и нормализации образцов

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Исследование большей популяции сопровождается машинной вариацией, которая, таким образом, является фактической вариацией, происходящей из природного разнообразия. Здесь мы демонстрируем метод уменьшения технических вариаций для последующего анализа интеграции. К преимуществам данного метода относится экстракция на основе разделения лица, обеспечивающая анализ различных метаболитов на соответствующей аналитической платформе, при одновременном устранении системной ошибки и сохранении биологической дисперсии.Как только генотипическая и фенотипическая информация получена, этот метод может быть применен к любому разнообразному естественному населению в любом царстве жизни. Для начала берут 20-миллилитровые уборочные трубки, добавляют два пятимиллиметровых и два металлических шарика диаметром восемь миллиметров для гомогенизации и маркировку трубок. Затем заполните дьюар жидким азотом, сразу после обрезки соберите свежие образцы листьев и корневых тканей в жидком азоте путем мгновенной заморозки.Храните собранные биологические образцы при температуре 80 градусов цельсия для дальнейшей обработки. Предварительно охладите держатели трубок жидким азотом. Далее измельчаем ткани при 25 герцах в течение одной минуты до получения однородного порошка.Повторите замораживание и измельчение, если ткань не однородно измельчена. Взвесьте 50 миллиграммов свежего растительного материала в предварительно охлаждаемых двухмиллиметровых микроцентрифужных трубках с безопасным замком, гарантирующих, что растительный материал остается замороженным во время процесса взвешивания. Добавьте один миллилитр предварительно охлажденной экстракционной смеси от 1 до 50 миллиграммов аликвоты образца и кратковременно вихните трубку, прежде чем держать на льду.Инкубируйте образцы на орбитальном шейкере в 800 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, а затем обрабатывайте ультразвуком в охлаждаемой льдом ванне для обработки ультразвуком в течение 10 минут. Используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить 500 микролитров экстракционной смеси в образцы и перемешать экстракты путем короткого вихря, затем центрифугировать смесь в 11, 200 раз G в течение 5 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования перенесут 500 микролитров отделенной верхней липидсодержащей фазы в предварительно маркированную 1,5-миллилитровую безопасную блокировочную микроцентрифужную трубку, удаляют остальную часть верхней фазы.В отдельных, 1,5-миллилитровых безопасных запорных микроцентрифужных трубках передают 150 микролитров нижней полуполярной фазы четыре GCMS и 300 микролитров полуполярной фазы четырех U-H-P-L-C MS анализа. Используйте вакуумный концентратор для выпаривания растворителя, чтобы сконцентрировать все экстрагированные фракции без нагревания и хранить высушенные фракции при 20 градусах Цельсия. Для подготовки образца к сверхвысокой производительности жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии или H-P-L-C MS повторно суспендируют высушенные полуполярные фракции в 180 микролитрах смеси метанола и воды.Затем обрабатывают ультразвуком полуполярную фазу в течение 2 минут с последующим центрифугированием в 11, 200 раз G в течение одной минуты. После центрифугирования переложите 90 микролитров супернатанта в стеклянный флакон и введите два микролитра экстрактов в разлитый образец LCMS. Выполняют фракционирование метаболитов на перевернутой колонне фазы С18, удерживаемой при 40 градусах Цельсия, и потоке 400 микролитров в минуту с постепенным изменением сточных вод А и В, получают масс-спектры исследуемой заготовки и контроль качества образцов в режиме отрицательной ионизации с диапазоном масс 102 1500 масс к заряду.Для полуполярных образцов метаболитов запустите объединенный образец QC в зависимой от данных тандемной масс-спектрометрии в отрицательном и положительном режимах ионизации. Используйте полученные масс-спектры для аннотации. Выполните нормализацию набора данных, проверив распределение внутреннего стандарта.Нормализуйте данные, корректируя для сигнала один или несколько внутренних стандартов. Затем скорректируйте пиковые интенсивности, полученные из хроматограммы, по точному весу образца. Для коррекции дрейфа интенсивности между многосерийными сериями выполните методы коррекции на основе КК, такие как локально оцененное сглаживание диаграммы рассеяния с использованием R.Перед выполнением общегеномных ассоциативных исследований или GWAS отфильтруйте генотипические данные для второстепенных частот аллелей менее 5% и отсутствующей частоты более 10% с использованием кисточки.Это позволит избежать низкочастотного смещения. Чтобы устранить смещение, возникающее из-за факторов окружающей среды, используйте пакет R LME four и рассчитайте лучшие линейные, непредвзятые прогнозы или блочки для каждого нормализованного признака по сравнению с экспериментальными повторениями. Используйте капли каждого признака по отдельности для выполнения GWAS с пакетом rMVP в R.Липидомические данные по нескольким распространенным видам бобов показаны на основе необработанных базовых пиковых хроматограмм двух образцов QC из разных партий.Наблюдалось изменение интенсивности сигнала для определенных классов липидов. Системная ошибка была более очевидной, когда анализ основных компонентов выполнялся на необработанных данных. Процедура нормализации, включая локально оцененное сглаживание диаграммы рассеяния, привела к кластеризации образцов QC.При рассечении на отдельные кластеры машинные ошибки в седьмой и восьмой партиях стали очевидными до нормализации, которая была исправлена. Постнормированные и трансформированные отдельные метаболомические кластеры использовались для GWAS, получая несколько ассоциаций маркеров признаков. В репрезентативном анализе различные классы соединений выделены разными цветами, в то время как маркеры, связанные с несколькими классами соединений, обозначены его ближайшим геном.Нормализация и преобразование данных являются одним из наиболее важных шагов. Убедитесь, что была выполнена надлежащая коррекция для исправления системной ошибки, и обеспечьте нормальность распределения. Выполняя коррекцию аналитической вариации, можно выполнить несколько интеграционных подходов, таких как метаболический корреляционный анализ и интеграция в феномические данные, чтобы пролить свет на сложные признаки.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Геном широкий количественная оценка перевода в многообещающий дрожжей рибосома профилирования

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

На основе плиты крупномасштабного культивирования Caenorhabditis elegans: Пробоподготовка для изучения метаболические изменения при сахарном диабете

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Образец Подготовки для зонда Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Без этикетки Иммунопрецитис Масса Спектромтертрия Рабочий процесс для крупномасштабного ядерного взаимодействия Профилирование

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Пример ы подготовки к протеомики объекта представления и последующего анализа данных

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Конвейер пробоподготовки микрокристаллов на лучевой линии VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Подготовка высокотемпературных сеток для отбора проб для крио-ЭМ

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Пробоподготовка и относительное количественное определение с использованием восстановительного метилирования аминов для исследований пептидомики

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Пробоподготовка липидным монослойным методом для электронно-кристаллографических исследований

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...