Name: large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

M.B. cuenta con el apoyo del IMPRS-PMPG 'Metabolismo Primario y Crecimiento de las Plantas'. A.R.F. y S.A. reconocen el apoyo financiero del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la UE, el proyecto PlantaSYST (SGA-CSA No. 739582 bajo FPA No. 664620) y el proyecto INCREASE (GA 862862).

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Tanto GC-MS como LC-MS son herramientas ampliamente utilizadas para perfilar mezclas complejas de varias clases de metabolitos. El manejo de grandes conjuntos de datos con estas herramientas está inherentemente asociado con una variación no biológica, por ejemplo, la variación analítica, que interfiere y sesga la interpretación de los resultados. Este protocolo presenta una tubería de extracción robusta y de alto rendimiento para perfiles metabólicos integrales para eliminar la variación del origen no biológico y realizar estudios "ómicos" a gran escala. Los volúmenes y concentraciones utilizados en este protocolo se ajustaron para las especies de leguminosas en diferentes tejidos. Sin embargo, estos parámetros también pueden modificarse ligeramente y utilizarse para muestras metabólicas a gran escala de otras especies de plantas.
Las15 extracciones basadas en MTBE descritas anteriormente se pueden usar para analizar metabolitos derivados, metabolitos semipolares y lípidos. Esto se puede ampliar para las extracciones de proteínas y hormonas vegetales39, que estaban fuera del alcance de este protocolo. Otros protocolos de extracción se basan en mezclas diclorometano:etanol40,41. De estos protocolos de extracción, el protocolo de extracción MTBE:metanol proporciona una alternativa favorable y menos peligrosa a los protocolos de extracción existentes a base de cloroformo42 y no da como resultado un pellet de proteína como interfase entre las fases polar y lipídica. Además, los métodos MTBE ya se han utilizado en varios estudios para diversas muestras biológicas 43,44,45.
Este protocolo discute varios pasos cruciales que podrían conducir a una variación potencial mientras se maneja una gran cantidad de muestras, por ejemplo, durante la cosecha12,13, la extracción14, así como la aleatorización46. Además, hay cuestiones adicionales que no se han discutido en este protocolo que deben considerarse para garantizar datos metabolómicos de alta calidad, por ejemplo, el efecto de matriz y la supresión de iones14.
El poder de los métodos de normalización basados en el control de calidad depende inherentemente del número de muestras de control de calidad en cada lote. Como se mencionó anteriormente, aunque aumentar el número aumentaría la potencia, la variación intra-lote de los QC es relativamente marginal en comparación con la variación entre lotes en estos sistemas analíticos, como se ilustra en la Figura 3. En general, existen otros métodos de normalización basados en el control de calidad, como la eliminación de errores sistémicos mediante bosque aleatorio (SERRF), que han demostrado superar a la mayoría de los otros métodos de normalización, como la relación por lotes, la normalización mediante una selección óptima de múltiples estándares internos (NOMIS) y la normalización probabilística del cociente (PQN)47 . Sin embargo, SERRF se basa en múltiples muestras de control de calidad en cada lote, por ejemplo, cada décima muestra, lo que no es factible mientras se maneja un gran número de muestras. La principal ventaja de la normalización basada en el control de calidad sobre otros métodos basados en datos o basados en estándares internos es que conserva la variación biológica esencial al tiempo que acomoda la variación técnica no deseada28. Los lectores pueden consultar esta revisión sobre el manejo de la variación28.
Un problema principal en GWAS es la tasa de falsos positivos, que se originan principalmente debido a la vinculación de sitios causales y no causales48,49. En segundo lugar, los enfoques conservadores de corrección estadística, por ejemplo, Bonferroni y FDR, corrigen el número de pruebas independientes, que no es igual al número de SNP ensayados en GWAS debido a la vinculación entre SNP próximos50,51 Por lo tanto, el número real de pruebas independientes es a menudo menor. Otra forma de reducir el umbral estadístico conservador sería reducir el número de SNP probados utilizados para GWAS basados en la desintegración de enlaces en regiones genómicas definidas52. La plataforma de metabolómica de alto rendimiento integrada en GWAS descrita en este protocolo tiene una amplia gama de aplicaciones. En particular, facilitará las mejoras en el mejoramiento de cultivos al cambiar la composición de metabolitos / lípidos para los niveles deseados industrial y nutricionalmente. En general, la metabolómica ha proporcionado una visión profunda de la arquitectura genética de una gran cantidad de metabolitos y diversificación metabólica que ocurrieron durante la domesticación de cultivos en las últimas décadas, lo que indica el vasto potencial de la reproducción asociada a la metabolómica53. Los enfoques biológicos moleculares para la validación QTL aguas abajo incluyen la generación de líneas mutantes CRISPR/Cas954, líneas de inserción de ADN-T55, líneas de sobreexpresión estables y/o transitorias56, VIGS, enfoques metabolómicos ex vivo 57 junto al enfoque convencional en la generación de poblaciones F2 cruzadas, así como validación cruzada en diferentes poblaciones.
Al realizar la corrección necesaria para las variaciones analíticas descritas anteriormente, se pueden realizar varios enfoques integrados además de GWAS, como el análisis de correlación metabolito-metabolito, metabolito-lípido, el análisis de correlación con datos fenómicos para arrojar luz sobre rasgos más complejos y / o el análisis de coexpresión para desentrañar aún más la base de los sistemas biológicos58.

Los enfoques "ómicos" a gran escala han permitido el análisis de sistemas biológicos complejos 1,2,3 y una mayor comprensión del vínculo entre los genotipos y los fenotipos resultantes4. La metabolómica utilizando cromatografía líquida de ultra alto rendimiento-espectrometría de masas (UHPLC-MS) y GC-MS permitió la detección de una gran cantidad de características de metabolitos, de las cuales solo algunas están anotadas hasta cierto punto, lo que resulta en una alta proporción de metabolitos desconocidos. Las interacciones complejas se pueden explorar combinando la metabolómica a gran escala con la variación genotípica subyacente de una población diversa5. Sin embargo, el manejo de grandes conjuntos de muestras está inherentemente asociado con variaciones analíticas, distorsionando la evaluación de la varianza metabólica para procesos posteriores. Específicamente, los principales problemas que conducen a variaciones analíticas se basan en el rendimiento de la máquina y la deriva instrumental a lo largo del tiempo6. La integración de la variación de lote a lote es desafiante y especialmente problemática cuando se analizan poblaciones de plantas estructuradas a gran escala. Se sugirieron múltiples procedimientos de normalización para corregir las variaciones no biológicas, por ejemplo, el uso de estándares internos, externos e internos marcados con isótopos para corregir errores analíticos, de los cuales cada uno está inherentemente asociado con problemas y trampas conocidos 7,8,9,10.
Además de la variación analítica, la elección de los protocolos de extracción generalmente varía según el método analítico. En última instancia, se desea reducir los costos de material y mano de obra, así como la necesidad de utilizar varias alícuotas de la misma muestra para diversos procesos analíticos mediante la realización de métodos de extracción basados en la separación de fases. Estos métodos se introdujeron por primera vez utilizando cloroformo: disolventes de metanol/agua para fraccionar compuestos polares e hidrófobos11.
Este protocolo describe una tubería rápida de alto rendimiento para una plataforma multiómica para perfilar tanto metabolitos polares como lípidos en especies de leguminosas. Además, muestra cómo esos conjuntos de datos pueden corregirse adecuadamente para la variación analítica y normalizarse antes de integrar información genotípica para detectar loci de rasgos cuantitativos de metabolitos (QTL) mediante la realización de GWAS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>FAME solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovitexin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>38953-85-4</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignoceric Acid Methylester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2442-49-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamin -hydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>593-56-6</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl laurate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-82-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl myristate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>124-10-7</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl palmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-39-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl stearate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-61-8</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-caprat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>110-42-9</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcaprylat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-11-5</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyldocosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>929-77-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyleicosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1120-28-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-hexacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5802-82-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-octacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55682-92-3</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-pelargonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1731-84-6</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>24589-78-4</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>110-86-1</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribitol</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>22566-17-2</td>
			<td>Internal standard for derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triacontanoic Acid Methyl Ester</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>629-83-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &#181;m</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>123-3832</td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS system</td>
			<td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Balls, Stainless Steel</td>
			<td>OPS DIAGNOSTICS</td>
			<td>GBSS 196-2500-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Q Exactive Focus (Q Exactive&#8482; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&#8482; 
			Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinding mixer mill</td>
			<td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetAlign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MzMine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;data.table&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;fujiplot&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pleiotrpoic map</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;genetics&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;Ime4&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BLUPs calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;LDheatmap&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LD plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;MASS&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;rMVP&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GWAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 4.0.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS Genedata</td>
			<td>Expressionist</td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization

Tanto la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) como la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) son enfoques metabolómicos ampliamente utilizados para detectar y cuantificar cientos de miles de características de metabolitos. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas a un gran número de muestras está sujeta a interacciones más complejas, particularmente para estudios de asociación de todo el genoma (GWAS). Este protocolo describe un flujo de trabajo metabólico optimizado, que combina una preparación de muestras eficiente y rápida con el análisis de un gran número de muestras para especies de cultivos de leguminosas. Este método de extracción ligeramente modificado se desarrolló inicialmente para el análisis de tejidos vegetales y animales y se basa en la extracción en metil terc-butil éter: disolvente de metanol para permitir la captura de metabolitos polares y lipídicos. Además, proporcionamos una guía paso a paso para reducir las variaciones analíticas, que son esenciales para la evaluación de alto rendimiento de la varianza metabólica en GWAS.

Los experimentos exitosos de GWAS de metabolómica deben comenzar con un diseño experimental adecuado, seguido de la recolección, extracción, adquisición de datos y procesamiento de muestras, como se ilustra en la Figura 1. En este protocolo, se utilizó el método MTBE15 para extraer y analizar cientos de metabolitos pertenecientes a varias clases de compuestos. La cromatografía depende en gran medida de las propiedades de la columna utilizada, así como de las mezclas tampón de elución. La Figura 2 muestra cromatogramas de muestras de control de calidad, lo que indica el patrón de elución de algunas de las principales clases de lípidos en este sistema analítico. Los gradientes aplicados para cada plataforma se dan en la Tabla 1. Se hizo especial hincapié en el manejo de los errores sistémicos en experimentos a gran escala. La realización de metabolómica a gran escala está inherentemente asociada con errores sistémicos. Para la demostración, analizamos los datos lipidómicos de varias especies de frijoles comunes. La Tabla Suplementaria 1 proporciona los datos lipidómicos en bruto extraídos obtenidos después del procesamiento del cromatograma utilizando el software indicado en la Tabla de Materiales. Seguir este protocolo nos permitió eludir los principales problemas en el tratamiento de datos ómicos, especialmente al manejar grandes conjuntos de muestras. El procedimiento de normalización produce una corrección precisa de los errores analíticos por lotes, como se demuestra en la Figura 3. Aunque aumentar el número de muestras de control de calidad aumentaría la potencia de la normalización, esto no siempre es factible debido a las limitaciones de costo y tiempo. Para los GWAS metabolómicos de alto rendimiento con características metabólicas no dirigidas, es esencial ilustrar adecuadamente un mayor número de asociaciones rasgo-marcador. Un mapa pleiotrópico38 que combine múltiples resultados de GWAS podría usarse para resaltar las regiones genómicas a las que están vinculados varios rasgos (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de flujo del GWAS basado en metabolómica en plantas. Varios pasos desde el diseño experimental hasta la detección de QTL se muestran en el panel izquierdo. En el panel derecho, se muestran varias figuras para admitir varios pasos mencionados en el panel izquierdo. Comenzando desde la parte superior derecha, (1) se muestra una secuencia sugerida de muestras para LC-MS, (2) gráficos de puntuación pre y post-normalizados de PCA, incluyendo una distribución representativa de características pre y post-procesamiento, con intensidades de muestra de QC que indican rojo, y (3) un gráfico de Manhattan con asociaciones significativas a las que se generaron distribuciones de LD y haplotipos. Abreviaturas: GWAS = estudios de asociación de todo el genoma; QTL = loci de rasgos cuantitativos; PCA = análisis de componentes principales; QC = control de calidad; LD = desequilibrio de enlace; MS = espectrometría de masas; LC-MS = cromatografía líquida-espectrometría de masas; GC-MS = cromatografía de gases-espectrometría de masas; LOESS = suavizado de diagramas de dispersión estimado localmente; MLM/MLMM = modelo lineal mixto/modelo mixto multilocus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg"> Figura 2: Procesamiento de cromatogramas. Dos cromatogramas de control de calidad (pico base; datos de lípidos) de diferentes lotes demuestran la variación por lotes para ciertas clases de lípidos en las muestras de control de calidad agrupadas. Cuatro clases principales de lípidos están indicadas con sus respectivas ventanas de elución en el sistema LC-MS interno. Los cromatogramas se exportaron desde MzMine21. Abreviaturas: QC = control de calidad; LC-MS = cromatografía líquida-espectrometría de masas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg"> Figura 3: Corrección del error sistemático. Análisis de componentes principales de los datos lipidómicos adquiridos, pre- (izquierda, datos en bruto) y post-corrección de errores sistémicos (derecha, batch loess). Los paneles inferiores ilustran la distribución de características (Cluster_00005) sobre las muestras (n = 650) y lotes (n = 10) pre - (izquierda) y post (derecha) - corrección para la variación analítica. Abreviaturas: PCA = análisis de componentes principales; QC = control de calidad; LOESS = suavizado de diagramas de dispersión estimado localmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg"> Figura 4: Mapa pleiotrópico que ilustra los resultados combinados de GWAS. El mapa pleiotrópico destaca regiones en todo el genoma que están asociadas con varios rasgos. Los números en los anillos externos indican los cromosomas correspondientes. Cada círculo representa un rasgo individual con sus SNP significativamente asociados. Los colores representan diferentes clases de compuestos (gris = clase compuesta 1; verde = clase compuesta 2; púrpura = clase compuesta 3; amarillo = clase compuesta 4). En el caso de asociaciones de clases intercompuestos con la misma región genómica, se destacan los genes. El círculo gris interno muestra la suma de todos los SNP significativos asociados con una posición genómica específica. Las asociaciones que se muestran en esta figura se generan artificialmente solo para ilustración. Abreviaturas: GWAS = estudios de asociación de todo el genoma; SNP = polimorfismos de un solo nucleótido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">Configuración uhplc-MS para lípidos</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiempo [min]</td>
			<td>Eluyente A a B [%]*</td>
			<td colspan="3">Información</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>45% A</td>
			<td colspan="3">Eluyente A: 1% 1M NH4-Acetato, 0.1% ácido acético en agua (grado UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>lg 45% - 25% A</td>
			<td colspan="3">Eluyente B: 1% 1M NH4-Acetato, 0.1% ácido acético en acetonitrilo/2-propanol 7:3 (grado UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>lg 25% - 11% A</td>
			<td colspan="3">
Caudal: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>lg 11% - 0% A</td>
			<td colspan="3">
Volumen de inyección: 2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>cw 0% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.50-19.51</td>
			<td>0% - 45% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.51-24.00</td>
			<td>eq 45%</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Ajustes UHPLC-MS/MS para metabolitos polares y semipolares</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiempo [min]</td>
			<td>Eluyente A y B [%]*</td>
			<td colspan="3">Información</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>99% A</td>
			<td colspan="3">Eluyente A: 0,1% de ácido fórmico en agua (grado UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>lg 99% -60% A</td>
			<td colspan="3">Eluyente B: ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo (grado UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>lg 60% - 30% A</td>
			<td colspan="3">
Caudal: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>lg 30% - 1% A</td>
			<td colspan="3">
Volumen de inyección: 3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>cw 1% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>lg 1% - 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>eq 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Configuración de GC-MS para metabolitos derivatizados</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiempo [min]</td>
			<td>Temperatura [°C]</td>
			<td colspan="3">Información</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">
Gas portador: Helio</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>lg 80 - 330</td>
			<td colspan="3">
Caudal: 2 mL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>cw 330</td>
			<td colspan="3">
Gradiente de temperatura: 15 °C/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>24.66</td>
			<td>enfriamiento rápido</td>
			<td colspan="3">
Volumen de inyección: 1 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Ajustes de gradiente para cada una de las plataformas analíticas7. Abreviaturas: lg = gradiente lineal; cw = lavado de columnas; eq = equilibrar; UHPLC-MS = cromatografía líquida de ultra alto rendimiento-espectrometría de masas; UHPLC-MS/MS = cromatografía líquida de ultra alto rendimiento-espectrometría de masas en tándem; GC-MS = cromatografía de gases-espectrometría de masas. * = valor porcentual corresponde al eluyente A; el valor porcentual restante corresponde al eluyente B.
Tabla suplementaria 1: Datos de lipidómica cruda. Indica las intensidades máximas para cada uno de los clústeres detectados en cada muestra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

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Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

En este protocolo, presentamos un flujo de trabajo optimizado, que combina una preparación de muestras eficiente y rápida de muchas muestras. Además, proporcionamos una guía paso a paso para reducir las variaciones analíticas para la evaluación de alto rendimiento de los estudios metabólicos GWAS.

Estudios de asociación multiómica a gran escala de todo el genoma (Mo-GWAS): Directrices para la preparación y normalización de muestras

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

La investigación de una población más grande viene con una variación impulsada por máquinas, que por esto la variación real se origina en la diversidad natural. Aquí demostramos un método para reducir la variación técnica para el análisis de integración aguas abajo. Las ventajas de esta técnica incluyen una extracción basada en la separación de rostros, proporcionando el análisis de varios metabolitos en la plataforma analítica respectiva, al tiempo que elimina el error sistémico y mantiene la varianza biológica.Una vez obtenida la información genotípica y fenotípica, este método se puede aplicar a cualquier población natural diversa en cualquier reino de la vida. Para comenzar a tomar tubos de cosecha de 20 mililitros, agregue dos perlas de metal de cinco milímetros y dos de ocho milímetros de diámetro para homogeneizar y etiquetar los tubos. Luego, llene un dewar con nitrógeno líquido, inmediatamente después de cortar, coseche muestras de hojas y tejidos radiculares frescos en nitrógeno líquido mediante congelación instantánea.Almacene las muestras biológicas cosechadas a 80 grados centígrados para su posterior procesamiento. Preenfríe los soportes de tubos en nitrógeno líquido. A continuación, muele los tejidos a 25 hercios durante un minuto para obtener un polvo homogéneo.Repita la congelación y la molienda si el tejido no está molido homogéneamente. Pesar 50 miligramos de material vegetal fresco en tubos de microcentrífuga de bloqueo seguro de dos milímetros preenfriados que garantizan que el material vegetal permanezca congelado durante el proceso de pesaje. Agregue un mililitro de mezcla de extracción preenfriada de 1 a 50 miligramos de alícuota de la muestra y vórtice el tubo brevemente antes de mantenerlo en hielo.Incubar las muestras en un agitador orbital a 800 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, seguido de sonicación en un baño de sonicación refrigerado por hielo durante 10 minutos. Use una pipeta multicanal para agregar 500 microlitros de mezcla de extracción también a las muestras y mezcle los extractos mediante un breve vórtice, luego centrífique la mezcla a 11, 200 veces G durante 5 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, transfiera 500 microlitros de la fase superior separada que contiene lípidos a un tubo de microcentrífuga de bloqueo seguro de 1,5 mililitros premarcado, elimine el resto de la fase superior.En tubos de microcentrífuga de bloqueo seguro de 1,5 mililitros transfieren 150 microlitros de la fase semipolar inferior cuatro GCMS y 300 microlitros del análisis semipolar de fase cuatro U-H-P-L-C MS. Utilice un concentrador de vacío para la evaporación del disolvente para concentrar todas las fracciones extraídas sin calentar y almacenar las fracciones secas a 20 grados centígrados. Para preparar la muestra para un rendimiento ultra alto, la cromatografía líquida, la espectrometría de masas o H-P-L-C MS vuelven a suspender las fracciones semipolares secas en 180 microlitros de una mezcla de metanol y agua.Luego sonicar la fase semipolar durante 2 minutos, seguida de centrifugación a 11, 200 veces G durante un minuto. Después de la centrifugación, transfiera 90 microlitros del sobrenadante a un vial de vidrio e inyecte dos microlitros de los extractos en la muestra LCMS vertida. Realizar el fraccionamiento de metabolitos sobre una columna invertida de Fase C18 mantenida a 40 grados centígrados, y un caudal de 400 microlitros por minuto con cambios graduales de efluente A y B, adquirir los espectros de masas de la prueba en blanco y muestras de control de calidad en modo de ionización negativa con un rango de masa de 102 1500 relación masa/carga.Para las muestras de metabolitos semipolares, ejecute una muestra de control de calidad agrupada en espectrometría de masas en tándem dependiente de datos en modos de ionización negativa y positiva. Utilice los espectros de masas obtenidos para la anotación. Realice la normalización del conjunto de datos comprobando la distribución del estándar interno.Normalice los datos corrigiendo la señal de estándares internos únicos o múltiples. A continuación, corrija las intensidades máximas obtenidas del cromatograma sobre el peso exacto de la muestra. Para corregir la deriva de intensidad a través de series de lotes múltiples, realice métodos de corrección basados en el control de calidad, como el suavizado de diagramas de dispersión estimado localmente utilizando R.Antes de realizar estudios de asociación de todo el genoma o GWAS, filtre los datos genotípicos para frecuencias de alelos menores inferiores al 5% y una tasa faltante de más del 10% utilizando borlas.Esto evitará el sesgo de baja frecuencia. Para eliminar el sesgo originado por los factores ambientales, utilice el paquete R LME cuatro y calcule las mejores predicciones o blops lineales e imparciales para cada característica normalizada sobre las repeticiones experimentales. Use blops de cada característica individualmente para realizar GWAS con el paquete rMVP en R.Los datos lipidómicos de varias especies de frijoles comunes se muestran en función de los cromatogramas de pico de base cruda de dos muestras de control de calidad de diferentes lotes.Se observó una variación en las intensidades de la señal para ciertas clases de lípidos. El error sistémico fue más evidente cuando se realizó el análisis del componente principal sobre los datos brutos. El procedimiento de normalización, incluido el suavizado de diagramas de dispersión estimado localmente, condujo a la agrupación de las muestras de control de calidad.Al diseccionar en los grupos individuales, los errores impulsados por la máquina en los lotes siete y ocho se hicieron evidentes antes de la normalización, que se corrigió. Los grupos metabolómicos individuales postnorados y transformados se utilizaron para GWAS, dando lugar a varias asociaciones de marcadores de rasgos. En el análisis representativo, las diferentes clases de compuestos se resaltan en diferentes colores, mientras que los marcadores asociados con múltiples clases de compuestos se indican con su gen más cercano.La normalización y transformación de datos es uno de los pasos más importantes. Asegúrese de que se ha realizado la corrección adecuada para corregir el error sistémico y garantizar la normalidad en la distribución. Al realizar la corrección de la variación analítica, se pueden realizar varios enfoques de integración, como el análisis de correlación metabólica y la integración en datos fenómicos para arrojar luz sobre rasgos complejos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Investigación

Bioquímica

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Base de placa de cultivo a gran escala de elegans de Caenorhabditis: preparación de muestras para el estudio de alteraciones metabólicas en la Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Preparación de muestras para espectrometría de masas de ionización por electrospray de sonda

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Flujo de trabajo de espectrometría de masas de inmunoprecipitación sin etiquetas para la generación de perfiles de interactome nuclear a gran escala

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Preparación de muestras TMT para la presentación de instalaciones proteómicas y análisis de datos posteriores

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Una tubería de preparación de muestras para microcristales en vmXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Preparación de rejillas de muestra de alta temperatura para crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Preparación de muestras y cuantificación relativa mediante metilación reductiva de aminas para estudios de peptidómica

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Preparación de muestras utilizando un método de monocapa lipídica para estudios cristalográficos de electrones

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...