Name: large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

MB stöds av IMPRS-PMPG "Primary Metabolism and Plant Growth". A.R.F. och S.A. erkänner det ekonomiska stödet från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020, projektet PlantaSYST (SGA-CSA nr 739582 enligt FPA nr 664620) och projektet INCREASE (GA 862862).

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.

Både GC-MS och LC-MS är allmänt använda verktyg för profilering av komplexa blandningar av olika metabolitklasser. Att hantera stora datamängder med dessa verktyg är i sig förknippat med en icke-biologisk variation, t.ex. analytisk variation, som stör och snedvrider tolkningen av resultaten. Detta protokoll presenterar en robust extraktionspipeline med hög genomströmning för omfattande metabolisk profilering för att eliminera variation av icke-biologiskt ursprung och genomföra storskaliga "omics" -studier. Volymerna och koncentrationerna som användes i detta protokoll justerades för baljväxtarter i olika vävnader. Dessa parametrar kan dock modifieras något och användas för storskaliga metaboliska prover från andra växtarter också.
De tidigare15 beskrivna MTBE-baserade extraktionerna kan användas för att analysera derivatiserade metaboliter, halvpolära metaboliter och lipider. Detta kan utökas för protein- och växthormonextraktioner39, som inte omfattades av detta protokoll. Andra extraktionsprotokoll bygger på diklormetan:etanolblandningar40,41. Av dessa extraktionsprotokoll ger MTBE: metanolextraktionsprotokollet ett gynnsamt och mindre farligt alternativ till de befintliga kloroformbaserade extraktionsprotokollen42 och resulterar inte i en proteinpellets som en interfas mellan polar- och lipidfaserna. Vidare har MTBE-metoder redan använts i flera studier för olika biologiska prover 43,44,45.
Detta protokoll diskuterar flera viktiga steg som kan leda till potentiell variation vid hantering av ett stort antal prover, t.ex. under skördav 12,13, extraktion14 samt randomisering46. Dessutom finns det ytterligare frågor som inte har diskuterats i detta protokoll som måste beaktas för att säkerställa högkvalitativa metabolomiska data, t.ex. matriseffekt och jonundertryckning14.
Kraften hos QC-baserade normaliseringsmetoder beror i sig på antalet QC-prover i varje sats. Som tidigare nämnts, även om en ökning av antalet skulle öka effekten, är variationen inom batchen av QC: erna relativt marginell jämfört med variationen mellan satser i dessa analytiska system, vilket illustreras i figur 3. Sammantaget finns det andra QC-baserade normaliseringsmetoder, såsom systemisk felborttagning med slumpmässig skog (SERRF), som har visat sig överträffa de flesta andra normaliseringsmetoder som batch-wise-ratio, normalisering med ett optimalt urval av flera interna standarder (NOMIS) och probabilistisk kvotnormalisering (PQN)47 . SERRF förlitar sig dock på flera QC-prover i varje sats, t.ex. vart tionde prov, vilket inte är möjligt vid hantering av ett stort antal prover. Den största fördelen med QC-baserad normalisering jämfört med andra datadrivna eller interna standardbaserade metoder är att den behåller den väsentliga biologiska variationen samtidigt som den tillgodoser oönskad teknisk variation28. Läsarna kan hänvisa till denna recension om hanteringen av variant28.
Ett huvudproblem i GWAS är frekvensen av falska positiva resultat, som främst härrör från kopplingen mellan kausala och icke-kausala platser48,49. För det andra korrigerar de konservativa statistiska korrigeringsmetoderna, t.ex. Bonferroni och FDR, för antalet oberoende tester, vilket inte är lika med antalet analyserade SNP i GWAS på grund av kopplingen mellan närliggande SNP50,51 Därför är det faktiska antalet oberoende tester ofta lägre. Ett annat sätt att minska den konservativa statistiska tröskeln skulle vara att minska antalet testade SNP som används för GWAS baserat på länkningsförfall över definierade genomiska regioner52. Den GWAS-integrerade metabolomikplattformen med hög genomströmning som beskrivs i detta protokoll har ett brett spektrum av applikationer. I synnerhet kommer det att underlätta förbättringar i växtförädling genom att ändra metabolit/ lipidkompositionen för industriellt och näringsmässigt önskade nivåer. Sammantaget har metabolomik gett en djupgående inblick i den genetiska arkitekturen hos en uppsjö av metaboliter och metabolisk diversifiering som inträffade under grödans domesticering under de senaste decennierna, vilket indikerar den stora potentialen för metabolomikassocierad avel53. De molekylärbiologiska metoderna för nedströms QTL-validering inkluderar generering av CRISPR / Cas9-mutantlinjer54, T-DNA-insättningslinjer55, stabila och / eller övergående överuttryckslinjer56, VIGS, ex vivo metabolomikmetoder57 bredvid det konventionella tillvägagångssättet för att generera kors F2-populationer samt korsvalidering i olika populationer.
Genom att utföra den nödvändiga korrigeringen för de analytiska variationerna som beskrivs ovan kan flera integrerade tillvägagångssätt utföras utöver GWAS, såsom metabolit-metabolit, metabolit-lipidkorrelationsanalys, korrelationsanalys till fenomeniska data för att belysa mer komplexa egenskaper och / eller samuttrycksanalys för att ytterligare riva upp grunden för biologiska system58.

Storskaliga "omics" -metoder har möjliggjort analys av komplexa biologiska system 1,2,3 och ytterligare förståelse av kopplingen mellan genotyper och de resulterande fenotyperna4. Metabolomik med ultrahögprestanda flytande kromatografi-masspektrometri (UHPLC-MS) och GC-MS möjliggjorde detektion av en uppsjö av metabolitfunktioner, varav endast vissa kommenteras till en viss grad, vilket resulterar i en hög andel okända metaboliter. Komplexa interaktioner kan utforskas genom att kombinera storskalig metabolomik med den underliggande genotypiska variationen hos en mångfaldig population5. Hantering av stora provuppsättningar är emellertid i sig förknippad med analytiska variationer, vilket snedvrider utvärderingen av metabolisk varians för ytterligare nedströmsprocesser. Specifikt baseras stora frågor som leder till analytiska variationer på maskinprestanda och instrumentell drift över tid6. Integrationen av batch-till-batch-variation är utmanande och särskilt problematisk när man analyserar storskaliga strukturerade växtpopulationer. Flera normaliseringsprocedurer föreslogs för att korrigera för icke-biologiska variationer, t.ex. användningen av interna, externa och isotopmärkta interna standarder för att korrigera för analytiska fel, varav var och en i sig är förknippad med kända problem och fallgropar 7,8,9,10.
Förutom analytisk variation varierar valet av extraktionsprotokoll i allmänhet beroende på analysmetoden. I slutändan är det önskvärt att minska material- och arbetskraftskostnaderna samt nödvändigheten av att använda flera alikvoter av samma prov för olika analytiska processer genom att utföra fasseparationsbaserade extraktionsmetoder. Dessa metoder introducerades först med användning av kloroform: metanol / vattenlösningsmedel för att fraktionera polära och hydrofoba föreningar11.
Detta protokoll beskriver en snabb pipeline med hög genomströmning för en multi-omics-plattform för att profilera både polära metaboliter och lipider i baljväxtarter. Vidare visar den hur dessa datamängder kan korrigeras på lämpligt sätt för analytisk variation och normaliseras innan genotypisk information integreras för att detektera metabolit quantitative trait loci (QTL) genom att utföra GWAS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>FAME solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovitexin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>38953-85-4</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignoceric Acid Methylester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2442-49-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamin -hydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>593-56-6</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl laurate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-82-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl myristate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>124-10-7</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl palmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-39-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl stearate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-61-8</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-caprat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>110-42-9</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcaprylat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-11-5</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyldocosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>929-77-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyleicosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1120-28-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-hexacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5802-82-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-octacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55682-92-3</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-pelargonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1731-84-6</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>24589-78-4</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>110-86-1</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribitol</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>22566-17-2</td>
			<td>Internal standard for derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triacontanoic Acid Methyl Ester</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>629-83-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &#181;m</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>123-3832</td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS system</td>
			<td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Balls, Stainless Steel</td>
			<td>OPS DIAGNOSTICS</td>
			<td>GBSS 196-2500-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Q Exactive Focus (Q Exactive&#8482; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&#8482; 
			Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinding mixer mill</td>
			<td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetAlign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MzMine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;data.table&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;fujiplot&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pleiotrpoic map</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;genetics&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;Ime4&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BLUPs calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;LDheatmap&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LD plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;MASS&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;rMVP&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GWAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 4.0.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS Genedata</td>
			<td>Expressionist</td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization

Både gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS) och vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) används ofta metabolomikmetoder för att detektera och kvantifiera hundratusentals metabolitfunktioner. Tillämpningen av dessa tekniker på ett stort antal prover är dock föremål för mer komplexa interaktioner, särskilt för genomomfattande associeringsstudier (GWAS). Detta protokoll beskriver ett optimerat metaboliskt arbetsflöde, som kombinerar en effektiv och snabb provberedning med analys av ett stort antal prover för baljväxtgrödor. Denna något modifierade extraktionsmetod utvecklades ursprungligen för analys av växt- och djurvävnader och är baserad på extraktion i metyltert-butyleter: metanollösningsmedel för att möjliggöra infångning av polära och lipidmetaboliter. Dessutom tillhandahåller vi en steg-för-steg-guide för att minska analytiska variationer, vilket är viktigt för utvärdering av metabolisk varians med hög genomströmning i GWAS.

Framgångsrika metabolomics GWAS-experiment bör börja med en korrekt experimentell design, följt av provinsamling, extraktion, datainsamling och bearbetning, som illustreras i figur 1. I detta protokoll användes MTBE-metoden15 för att extrahera och analysera hundratals metaboliter som tillhör flera sammansatta klasser. Kromatografi beror mycket på egenskaperna hos den använda kolonnen samt elueringsbuffertblandningar. Figur 2 visar kromatogram av QC-prover, vilket indikerar elueringsmönstret för några större lipidklasser i detta analytiska system. De tillämpade gradienterna för varje plattform anges i tabell 1. Stor vikt lades vid att hantera systemfel i storskaliga experiment. Att utföra storskalig metabolomik är i sig förknippat med systemfel. För demonstration analyserade vi lipidomiska data över flera vanliga bönarter. Kompletterande tabell 1 tillhandahåller de extraherade råa lipidomiska data som erhållits efter kromatogrambehandling med hjälp av programvaran som anges i materialförteckningen. Att följa detta protokoll gjorde det möjligt för oss att kringgå stora problem vid hantering av omics-data, särskilt vid hantering av stora provuppsättningar. Normaliseringsförfarandet ger en noggrann korrigering av batchvisa analysfel, vilket visas i figur 3. Även om en ökning av antalet QC-prover skulle öka normaliseringens kraft, är detta inte alltid genomförbart på grund av kostnads- och tidsbegränsningar. För metabolomik med hög genomströmning GWAS med icke-riktade metaboliska egenskaper är det viktigt att illustrera högre antal egenskapsmarkörassociationer på lämpligt sätt. En pleiotrop karta38 som kombinerar flera GWAS-resultat kan användas för att markera de genomiska regioner som flera egenskaper är kopplade till (figur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg"> Figur 1: Flödesschema över metabolomikbaserade GWAS i växter. Flera steg från den experimentella designen upp till detekteringen av QTL visas i den vänstra panelen. I den högra panelen visas flera figurer för att stödja flera steg som nämns i den vänstra panelen. Med utgångspunkt från den högra toppen visas (1) en föreslagen sekvens av prover för LC-MS, (2) för- och efternormaliserade poängdiagram för PCA, inklusive en representativ funktionsfördelning före och efter bearbetning, med rött som indikerar QC-provintensiteter, och (3) en Manhattan-plot med signifikanta associationer till vilka LD- och haplotypfördelningar genererades. Förkortningar: GWAS = genomomfattande associeringsstudier; QTL = kvantitativ egenskap loci; PCA = analys av huvudkomponent; QC = kvalitetskontroll; LD = obalans i koppling; MS = masspektrometri; LC-MS = vätskekromatografi-masspektrometri; GC-MS = gaskromatografi-masspektrometri; LOESS = lokalt uppskattad spridningsplotsutjämning; MLM/MLMM = blandad linjär modell/multi-locus mixed-model. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg"> Figur 2: Kromatogrambehandling. Två QC-kromatogram (bastopp; lipiddata) från olika satser visar den batchvisa variationen för vissa lipidklasser i de sammanslagna QC-proverna. Fyra stora lipidklasser indikeras med sina respektive elueringsfönster i det interna LC-MS-systemet. Kromatogrammen exporterades från MzMine21. Förkortningar: QC = kvalitetskontroll; LC-MS = vätskekromatografi-masspektrometri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg"> Figur 3: Korrigering av systematiska fel. Huvudkomponentanalys av förvärvade lipidomiska data, pre- (vänster, rådata) och efterkorrigering för systemfel (höger, batch loess). De nedre panelerna illustrerar funktionsfördelningen (Cluster_00005) över proverna (n = 650) och batcherna (n = 10) före (vänster) och efter (höger) korrigering för analytisk variation. Förkortningar: PCA = huvudkomponentanalys; QC = kvalitetskontroll; LOESS = lokalt uppskattad spridningsplotsutjämning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg"> Figur 4: Pleiotropisk karta som illustrerar de kombinerade GWAS-resultaten. Den pleiotropa kartan belyser regioner i hela genomet som är associerade med flera egenskaper. Siffrorna på de yttre ringarna indikerar motsvarande kromosomer. Varje cirkel representerar ett individuellt drag med dess signifikant associerade SNP. Färgerna representerar olika sammansatta klasser (grå = sammansatt klass 1; grön = sammansatt klass 2; lila = sammansatt klass 3; gul = sammansatt klass 4). Vid inter-sammansatta klassassociationer med samma genomiska region markeras gener. Den inre grå cirkeln visar summan av alla signifikanta SNP som är associerade med en specifik genomisk position. Föreningarna som visas i denna figur genereras artificiellt endast för illustration. Förkortningar: GWAS = genomomfattande associeringsstudier; SNP = en-nukleotidpolymorfismer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">UHPLC-MS-inställningar för lipider</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tid [min]</td>
			<td>Eluent A till B [%]*</td>
			<td colspan="3">Information</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>45% A</td>
			<td colspan="3">Elueringsmedel A: 1% 1MNH4-acetat, 0,1% ättiksyra i vatten (UHPLC-kvalitet)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>lg 45% - 25% A</td>
			<td colspan="3">Elueringsmedel B: 1% 1MNH4-acetat, 0,1% ättiksyra i acetonitril/ 2-propanol 7: 3 (UHPLC-kvalitet)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>lg 25% - 11% A</td>
			<td colspan="3">
Flödeshastighet: 400 μl / min</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>lg 11% - 0% A</td>
			<td colspan="3">
Injektionsvolym: 2 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>cw 0% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.50-19.51</td>
			<td>0% - 45% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.51-24.00</td>
			<td>eq 45%</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">UHPLC-MS/MS-inställningar för polära och halvpolära metaboliter</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tid [min]</td>
			<td>Eluent A och B [%]*</td>
			<td colspan="3">Information</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>99% A</td>
			<td colspan="3">Elueringsmedel A: 0,1% myrsyra i vatten (UHPLC-kvalitet)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>lg 99% -60% A</td>
			<td colspan="3">Elueringsmedel B: 0,1% myrsyra i acetonitril (UHPLC-klass)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>lg 60% - 30% A</td>
			<td colspan="3">
Flödeshastighet: 400 μl / min</td>
		</tr>
<tr>
<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>Lg 30% - 1% A</td>
			<td colspan="3">
Injektionsvolym: 3 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>cw 1% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>lg 1% - 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>eq 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">GC-MS-inställningar för derivatiserade metaboliter</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tid [min]</td>
			<td>Temperatur [°C]</td>
			<td colspan="3">Information</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">
Bärgas: Helium</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>Lg 80 - 330</td>
			<td colspan="3">
Flödeshastighet: 2 ml / min</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>cw 330</td>
			<td colspan="3">
Temperaturgradient: 15 °C/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>24.66</td>
			<td>snabb kylning</td>
			<td colspan="3">
Injektionsvolym: 1 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Gradientinställningar för var och en av analysplattformarna7. Förkortningar: lg = linjär gradient; cw = kolonntvätt; eq = jämvikt; UHPLC-MS = ultrahögprestanda flytande kromatografi-masspektrometri; UHPLC-MS/MS = ultrahögprestanda flytande kromatografi-tandem masspektrometri; GC-MS = gaskromatografi-masspektrometri. * = procentvärde motsvarar elueringsmedel A; återstående procentvärde motsvarar elueringsmedel B.
Kompletterande tabell 1: Rå lipidomikdata. Anger toppintensiteterna för vart och ett av de identifierade klustren över varje prov. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

I detta protokoll presenterar vi ett optimerat arbetsflöde som kombinerar en effektiv och snabb provberedning av många prover. Dessutom tillhandahåller vi en steg-för-steg-guide för att minska analytiska variationer för utvärdering med hög genomströmning av metaboliska GWAS-studier.

Storskaliga Multi-omics Genome-wide Association Studies (Mo-GWAS): Riktlinjer för provberedning och normalisering

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Att undersöka större population kommer med en maskindriven variation, som genom detta den faktiska variationen härstammar från naturlig mångfald. Här demonstrerar vi en metod för att minska den tekniska variationen för nedströms integrationsanalys. Fördelarna med denna teknik innefattar en ansiktsseparationsbaserad extraktion, som ger analys av olika metaboliter på respektive analytisk plattform, samtidigt som det systemiska felet avlägsnas och den biologiska variansen bibehålls.När den genotypiska och fenotypiska informationen har erhållits kan denna metod tillämpas på alla olika naturliga befolkningar i alla liv riken. För att börja ta 20-milliliter skördrör, tillsätt två fem millimeter och två metallpärlor med åtta millimeter diameter för homogenisering och märk rören. Fyll sedan upp en dewar med flytande kväve, omedelbart efter att ha klippt skörda färska blad- och rotvävnadsprover i flytande kväve genom blixtfrysning.Förvara de skördade biologiska proverna vid 80 grader celsius för vidare bearbetning. Förkyl rörhållarna i flytande kväve. Slipa sedan vävnaderna vid 25 hertz i en minut för att erhålla ett homogent pulver.Upprepa frysning och slipning om vävnaden inte är homogent slipad. Väg 50 milligram färskt växtmaterial i ett förkylt märkt två millimeter säkert låsmikrocentrifugrör som säkerställer att växtmaterialet förblir fryst under vägningsprocessen. Tillsätt en ml förkyld extraktionsblandning på 1 till 50 mg alikvot av provet och vispa röret en kort stund innan det läggs på is.Inkubera proverna på en orbital shaker vid 800 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius, följt av ultraljudsbehandling i ett iskylt ultraljudsbehandling bad i 10 minuter. Använd en flerkanalig pipett för att tillsätta 500 mikroliter extraktionsblandning också till proverna och blanda extrakten genom kort virvelbildning och centrifugera sedan blandningen vid 11 200 gånger G i 5 minuter vid fyra grader celsius. Efter centrifugering, överför 500 mikroliter av den separerade övre lipidinnehållande fasen till ett förmärkt 1,5 ml säkert låsmikrocentrifugrör, avlägsnade resten av den övre fasen.I separata, 1,5-milliliter säkra låsmikrocentrifugrör överför 150 mikroliter av den nedre halvpolära fas fyra GCMS och 300 mikroliter av den halvpolära fas fyra U-H-P-L-C MS-analysen. Använd en vakuumkoncentrator för lösningsmedelsindunstning för att koncentrera alla extraherade fraktioner utan uppvärmning och förvara de torkade fraktionerna vid 20 grader celsius. För att bereda provet för ultrahög prestanda suspenderar vätskekromatografi, masspektrometri eller H-P-L-C MS de torkade halvpolära fraktionerna i 180 mikroliter av en blandning av metanol och vatten.Sedan sonikera den halvpolära fasen i 2 minuter, följt av centrifugering vid 11 200 gånger G i en minut. Efter centrifugering överför 90 mikroliter av supernatanten till en injektionsflaska av glas och injicera två mikroliter av extrakten i det upphällda LCMS-provet. Utför metabolitfraktioneringen på en omvänd fas C18-kolonn som hålls vid 40 grader celsius, och ett flöde på 400 mikroliter per minut med gradvisa förändringar av avloppsvatten A och B, förvärva masspektra för testämnet och kvalitetskontrollprover i negativt joniseringsläge med ett massintervall på 102 1500 mass-laddningsförhållande.För de halvpolära metaboliterna, kör ett poolat QC-prov i databeroende tandemmasspektrometri i negativa och positiva joniseringslägen. Använd de erhållna masspektra för anteckningen. Utför normaliseringen av datauppsättningen genom att kontrollera fördelningen av den interna standarden.Normalisera data genom att korrigera för signalen för en eller flera interna standarder. Korrigera sedan toppintensiteterna erhållna från kromatogrammet över den exakta provvikten. För att korrigera intensitetsavdriften över flera batchserier, utför QC-baserade korrigeringsmetoder som lokalt uppskattad spridningsplotutjämning med R.Innan du utför genomomfattande associeringsstudier eller GWAS, filtrera genotypiska data för mindre allelfrekvenser mindre än 5% och en saknad hastighet på mer än 10% med tofs.Detta kommer att undvika lågfrekvent bias. För att eliminera bias som härrör från miljöfaktorerna använder du R-paketet LME four och beräknar de bästa linjära, opartiska förutsägelserna eller blopsen för varje normaliserad funktion över de experimentella repetitionerna. Använd blops av varje funktion individuellt för att utföra GWAS med rMVP-paketet i R.Lipidomiska data för flera vanliga bönarter visas baserat på de råa bastoppskromatogrammen för två QC-prover från olika satser.En variation i signalintensiteterna observerades för vissa lipidklasser. Systemfelet var tydligare när huvudkomponentanalysen utfördes på rådata. Normaliseringsförfarandet, inklusive den lokalt uppskattade spridningsplotsutjämningen, ledde till klustring av QC-proverna.Vid dissekering i de enskilda klustren blev maskindrivna fel i batch sju och åtta tydliga före normaliseringen, vilket korrigerades bort. De postnormaliserade och transformerade individuella metabolomiska klustren användes för GWAS, vilket gav flera egenskapsmarkörassociationer. I den representativa analysen markeras olika sammansatta klasser i olika färger, medan markörerna associerade med flera sammansatta klasser indikeras med dess närmaste gen.Datanormalisering och omvandling är ett av de viktigaste stegen. Se till att korrekt korrigering har utförts för att korrigera för systemfel och säkerställa normalitet i distributionen. Genom att utföra korrigeringen för den analytiska variationen kan flera integrationsmetoder utföras, såsom metabolisk korrelationsanalys och integration i fenomeniska data för att belysa komplexa egenskaper.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide kvantifiering av översättning i spirande jäst av Ribosomen profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Tallrik-baserade storskalig odling av Caenorhabditis elegans: provberedning för studie av metabola förändringar i Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Provberedning för probe electrospray jonisering Masspektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri immunoprecipitation masspektrometri arbetsflöde för storskalig nukleär Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Provberedning för Proteomics Facility Submission och efterföljande dataanalys

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En provförberedande pipeline för mikrokritaler vid VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Beredning av högtemperaturprovgaller för kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Provberedning och relativ mängd med reduktiv metylering av aminer för peptidomikstudier

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Provberedning med lipidmonalayermetod för elektronkristallkroografiska studier

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...