Name: large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

M.B., IMPRS-PPG 'Birincil Metabolizma ve Bitki Büyümesi' tarafından desteklenmektedir. A.R.F. ve S.A., AB Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı, proje PlantaSYST (SGA-CSA No. 739582 FPA No. 664620) ve proje INCREASE (GA 862862) finansal desteğini kabul eder.

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Hem GC-MS hem de LC-MS, çeşitli metabolit sınıflarının karmaşık karışımlarının profilini çıkarmak için yaygın olarak kullanılan araçlardır. Büyük veri kümelerinin bu araçlarla işlenmesi, doğal olarak, sonuçların yorumlanmasına müdahale eden ve önyargılı olan analitik varyasyon gibi biyolojik olmayan bir varyasyonla ilişkilidir. Bu protokol, biyolojik olmayan kökenin varyasyonunu ortadan kaldırmak ve büyük ölçekli "omik" çalışmaları yürütmek için kapsamlı metabolik profilleme için sağlam ve yüksek verimli bir ekstraksiyon boru hattı sunmaktadır. Bu protokolde kullanılan hacimler ve konsantrasyonlar, farklı dokulardaki baklagil türleri için ayarlanmıştır. Bununla birlikte, bu parametreler biraz değiştirilebilir ve diğer bitki türlerinden büyük ölçekli metabolik örnekler için de kullanılabilir.
Daha önce açıklanan15 MTBE bazlı ekstraksiyon, türevlenmiş metabolitleri, yarı polar metabolitleri ve lipitleri analiz etmek için kullanılabilir. Bu, bu protokolün kapsamı dışında kalan protein ve bitki hormonu ekstraksiyonları39 için genişletilebilir. Diğer ekstraksiyon protokolleri diklorometan: etanol karışımları40,41'e dayanır. Bu ekstraksiyon protokollerinden MTBE: metanol ekstraksiyon protokolü, mevcut kloroform bazlı ekstraksiyon protokolleri42'ye uygun ve daha az tehlikeli bir alternatif sağlar ve polar ve lipit fazları arasında bir interfaz olarak bir protein peleti ile sonuçlanmaz. Ayrıca, MTBE yöntemleri çeşitli biyolojik örnekler için çeşitli çalışmalarda zaten kullanılmıştır43,44,45.
Bu protokol, çok sayıda numuneyi işlerken potansiyel varyasyona yol açabilecek birkaç önemli adımı tartışmaktadır, örneğin, hasatsırasında 12,13, ekstraksiyon14 ve randomizasyon46. Ayrıca, bu protokolde tartışılmamış olan ve yüksek kaliteli metabolomik veriler sağlamak için göz önünde bulundurulması gereken ek konular vardır, örneğin, matris etkisi ve iyon bastırma14.
QC tabanlı normalleştirme yöntemlerinin gücü, doğal olarak her partideki QC numunelerinin sayısına bağlıdır. Daha önce de belirtildiği gibi, sayının arttırılması gücü artıracak olsa da, QC'lerin parti içi varyasyonu, Şekil 3'te gösterildiği gibi, bu analitik sistemlerdeki partiler arası varyasyona kıyasla nispeten marjinaldir. Genel olarak, rastgele orman (SERRF) kullanarak sistemik hata giderme gibi diğer QC tabanlı normalleştirme yöntemleri de vardır; bunların, toplu olarak oran, çoklu iç standartların (NOMIS) optimal seçimi kullanılarak normalleştirme ve olasılıksal bölüm normalleştirme (PQN)47 gibi diğer normalleştirme yöntemlerinden daha iyi performans gösterdiği gösterilmiştir. . Bununla birlikte, SERRF her partide birden fazla QC örneğine dayanır, örneğin, her onuncu numune, bu da çok sayıda numuneyi işlerken mümkün değildir. QC tabanlı normalleştirmenin diğer veri odaklı veya dahili standart tabanlı yöntemlere göre temel avantajı, istenmeyen teknik varyasyonları barındırırken temel biyolojik varyasyonu korumasıdır28. Okuyucular,varyasyon 28'in ele alınmasıyla ilgili bu incelemeye başvurabilirler.
GWAS'daki ana sorunlardan biri, çoğunlukla nedensel ve nedensel olmayan sitelerin bağlantısından kaynaklanan yanlış pozitiflerin oranıdır48,49. İkincisi, muhafazakar istatistiksel düzeltme yaklaşımları, örneğin Bonferroni ve FDR, bağımsız testlerin sayısı için doğrudur, bu da yakın SNP'ler arasındaki bağlantı nedeniyle GWAS'taki tahlil edilmiş SNP'lerin sayısına eşit değildir50,51 Bu nedenle, bağımsız testlerin gerçek sayısı genellikle daha düşüktür. Konservatif istatistiksel eşiği azaltmanın bir başka yolu, tanımlanmış genomik bölgeler üzerindeki bağlantı bozunumuna dayanarak GWAS için kullanılan test edilmiş SNP'lerin sayısını azaltmak olacaktır52. Bu protokolde açıklanan GWAS ile entegre yüksek verimli metabolomik platformu çok çeşitli uygulamalara sahiptir. Özellikle, metabolit / lipit bileşimini endüstriyel ve besleyici olarak istenen seviyeler için değiştirerek mahsul ıslahındaki gelişmeleri kolaylaştıracaktır. Genel olarak, metabolomik, son on yıllarda mahsulün evcilleştirilmesi sırasında meydana gelen çok sayıda metabolitin ve metabolik çeşitliliğin genetik mimarisi hakkında derinlemesine bir fikir vermiş ve metabolomikle ilişkili ıslahın engin potansiyelini göstermiştir53. Aşağı akış QTL doğrulaması için moleküler biyolojik yaklaşımlar, CRISPR / Cas9 mutant hatlarının 54, T-DNA yerleştirme hatlarının 55, kararlı ve / veya geçici aşırı ekspresyon hatlarının56, VIGS, ex vivo metabolomik yaklaşımların57 üretilmesini, çapraz F2 popülasyonlarının üretilmesinde geleneksel yaklaşımın yanı sıra farklı popülasyonlarda çapraz doğrulamayı içerir.
Yukarıda tarif edildiği gibi analitik varyasyonlar için gerekli düzeltmeyi yaparak, GWAS'a ek olarak, metabolit-metabolit, metabolit-lipid korelasyon analizi, daha karmaşık özelliklere ışık tutmak için fenomik verilere korelasyon analizi ve / veya biyolojik sistemlerin temelini daha da çözmek için birlikte ekspresyon analizi gibi çeşitli entegre yaklaşımlar gerçekleştirilebilir58.

Büyük ölçekli "omik" yaklaşımlar, karmaşık biyolojik sistemlerinanalizini 1,2,3 ve genotipler ile ortaya çıkan fenotipler arasındaki bağlantının daha iyi anlaşılmasını sağlamıştır4. Ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (UHPLC-MS) ve GC-MS kullanan metabolomikler, yalnızca bazılarına belirli bir dereceye kadar açıklama eklenmiş olan çok sayıda metabolit özelliğinin tespit edilmesini sağladı ve bu da bilinmeyen metabolitlerin yüksek oranda ortaya çıkmasına neden oldu. Karmaşık etkileşimler, büyük ölçekli metabolomiklerin farklı bir popülasyonun altta yatan genotipik varyasyonu ile birleştirilmesiyle araştırılabilir5. Bununla birlikte, büyük numune setlerinin işlenmesi doğal olarak analitik varyasyonlarla ilişkilidir ve daha sonraki aşağı akış prosesleri için metabolik varyansın değerlendirilmesini bozar. Özellikle, analitik değişikliklere yol açan başlıca sorunlar, makine performansına ve zaman içindeki enstrümantal sapmaya dayanmaktadır6. Partiden partiye varyasyonun entegrasyonu, büyük ölçekli yapılandırılmış bitki popülasyonlarını analiz ederken zorlu ve özellikle sorunludur. Biyolojik olmayan varyasyonları düzeltmek için çoklu normalleştirme prosedürleri önerilmiştir, örneğin, her biri doğal olarak bilinen problemler ve tuzaklarla ilişkili olan analitik hataları düzeltmek için iç, dış ve izotop etiketli iç standartların kullanılması 7,8,9,10.
Analitik varyasyona ek olarak, ekstraksiyon protokollerinin seçimi genellikle analitik yönteme bağlı olarak değişir. Nihayetinde, faz ayırma tabanlı ekstraksiyon yöntemleri uygulanarak malzeme ve işçilik maliyetlerinin yanı sıra çeşitli analitik prosesler için aynı numunenin birkaç alikotunun kullanılması gerekliliğinin azaltılması istenmektedir. Bu yöntemler ilk olarak kloroform kullanılarak tanıtıldı: polar ve hidrofobik bileşikleri fraksiyone etmek için metanol / su çözücüleri11.
Bu protokol, baklagil türlerinde hem kutupsal metabolitlerin hem de lipitlerin profilini çıkarmak için çok omik bir platform için hızlı bir yüksek verimli boru hattını tanımlar. Ayrıca, bu veri kümelerinin analitik varyasyon için uygun şekilde nasıl düzeltilebileceğini ve GWAS gerçekleştirerek metabolit kantitatif özellik lokuslarını (QTL) tespit etmek için genotipik bilgileri entegre etmeden önce normalleştirilebileceğini gösterir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>FAME solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovitexin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>38953-85-4</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignoceric Acid Methylester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2442-49-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamin -hydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>593-56-6</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl laurate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-82-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl myristate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>124-10-7</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl palmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-39-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl stearate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-61-8</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-caprat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>110-42-9</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcaprylat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-11-5</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyldocosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>929-77-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyleicosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1120-28-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-hexacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5802-82-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-octacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55682-92-3</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-pelargonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1731-84-6</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>24589-78-4</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>110-86-1</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribitol</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>22566-17-2</td>
			<td>Internal standard for derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triacontanoic Acid Methyl Ester</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>629-83-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &#181;m</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>123-3832</td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS system</td>
			<td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Balls, Stainless Steel</td>
			<td>OPS DIAGNOSTICS</td>
			<td>GBSS 196-2500-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Q Exactive Focus (Q Exactive&#8482; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&#8482; 
			Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinding mixer mill</td>
			<td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetAlign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MzMine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;data.table&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;fujiplot&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pleiotrpoic map</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;genetics&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;Ime4&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BLUPs calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;LDheatmap&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LD plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;MASS&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;rMVP&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GWAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 4.0.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS Genedata</td>
			<td>Expressionist</td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization

Hem gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) hem de sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS), yüz binlerce metabolit özelliğini tespit etmek ve ölçmek için yaygın olarak kullanılan metabolomik yaklaşımlardır. Bununla birlikte, bu tekniklerin çok sayıda örneğe uygulanması, özellikle genom çapında ilişkilendirme çalışmaları (GWAS) için daha karmaşık etkileşimlere tabidir. Bu protokol, verimli ve hızlı bir numune hazırlamayı baklagil mahsulü türleri için çok sayıda numunenin analizi ile birleştiren optimize edilmiş bir metabolik iş akışını açıklamaktadır. Bu hafifçe modifiye edilmiş ekstraksiyon yöntemi başlangıçta bitki ve hayvan dokularının analizi için geliştirilmiştir ve metil tert-bütil eterde ekstraksiyona dayanmaktadır: polar ve lipit metabolitlerinin yakalanmasına izin vermek için metanol çözücü. Ek olarak, GWAS'taki metabolik varyansın yüksek verimli değerlendirilmesi için gerekli olan analitik varyasyonları azaltmak için adım adım bir kılavuz sunuyoruz.

Başarılı metabolomik GWAS deneyleri, uygun bir deneysel tasarımla başlamalı, ardından Şekil 1'de gösterildiği gibi örnek toplama, ekstraksiyon, veri toplama ve işleme ile devam etmelidir. Bu protokolde, MTBE yöntem15, çeşitli bileşik sınıflarına ait yüzlerce metaboliti çıkarmak ve analiz etmek için kullanılmıştır. Kromatografi, kullanılan kolonun özelliklerine ve elüsyon tampon karışımlarına büyük ölçüde bağlıdır. Şekil 2, QC örneklerinin kromatogramlarını göstererek, bu analitik sistemdeki bazı ana lipit sınıflarının elüsyon paternini göstermektedir. Her platform için uygulanan gradyanlar Tablo 1'de verilmiştir. Büyük ölçekli deneylerde sistemik hataların ele alınmasına güçlü bir vurgu yapıldı. Büyük ölçekli metabolomiklerin gerçekleştirilmesi doğal olarak sistemik hatalarla ilişkilidir. Gösterim için, birkaç yaygın fasulye türündeki lipidomik verileri analiz ettik. Ek Tablo 1, Malzeme Tablosunda belirtilen yazılım kullanılarak kromatogram işleminden sonra elde edilen ekstrakte edilmiş ham lipidomik verileri sağlar. Bu protokolü takip etmek, özellikle büyük örnek kümelerini işlerken, omik verilerle uğraşırken önemli sorunları aşmamızı sağladı. Normalleştirme prosedürü, Şekil 3'te gösterildiği gibi, toplu analitik hataların doğru bir şekilde düzeltilmesini sağlar. QC numunelerinin sayısının arttırılması normalleştirmenin gücünü artıracak olsa da, maliyet ve zaman kısıtlamaları nedeniyle bu her zaman mümkün değildir. Hedeflenmemiş metabolik özelliklere sahip yüksek verimli metabolomik GWAS için, daha fazla sayıda özellik-belirteç ilişkisini uygun şekilde göstermek önemlidir. Çoklu GWAS sonuçlarını birleştiren bir pleiotropik harita38, çeşitli özelliklerin bağlantılı olduğu genomik bölgeleri vurgulamak için kullanılabilir (Şekil 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg"> Şekil 1: Bitkilerde metabolomik tabanlı GWAS'ın akış şeması. Deneysel tasarımdan başlayarak QTL'nin tespitine kadar olan birkaç adım sol panelde gösterilmektedir. Sağ panelde, sol panelde belirtilen birkaç adımı desteklemek için birden fazla şekil gösterilmiştir. Sağ üstten başlayarak, (1) LC-MS için önerilen bir örnek dizisi, (2) PCA'nın normalleştirilme öncesi ve sonrası skor grafikleri, temsili bir özellik dağılımı ön ve son işlem dahil, QC örnek yoğunluklarını gösteren kırmızı ve (3) LD ve haplotip dağılımlarının oluşturulduğu önemli ilişkilere sahip bir Manhattan grafiği. Kısaltmalar: GWAS = genom çapında ilişkilendirme çalışmaları; QTL = nicel özellik lokusları; PCA = ana bileşen analizi; QC = kalite kontrol; LD = bağlantı dengesizliği; MS = kütle spektrometrisi; LC-MS = sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi; GC-MS = gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi; LOESS = yerel olarak tahmin edilen dağılım grafiği yumuşatma; MLM/MLMM = karışık doğrusal model/çok merkezli karma model. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg"> Şekil 2: Kromatogram işleme. Farklı partilerden iki QC kromatogramı (baz pik; lipit verileri), havuza alınmış QC numunelerindeki belirli lipit sınıfları için parti bazında varyasyonu göstermektedir. Dört ana lipid sınıfı, şirket içi LC-MS sistemindeki ilgili elüsyon pencereleri ile belirtilmiştir. Kromatogramlar MzMine21'den ihraç edildi. Kısaltmalar: QC = kalite kontrol; LC-MS = sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg"> Şekil 3: Sistematik hatanın düzeltilmesi. Edinilmiş lipidomik verilerin temel bileşen analizi, sistemik hatalar için ön (sol, ham veriler) ve düzeltme sonrası (sağ, toplu loess). Alt paneller, analitik varyasyon için numuneler (n = 650) ve partiler (n = 10) öncesi (solda) ve sonrası (sağda) düzeltmeler üzerindeki özellik (Cluster_00005) dağılımını gösterir. Kısaltmalar: PCA = ana bileşen analizi; QC = kalite kontrol; LOESS = yerel olarak tahmin edilen dağılım grafiği yumuşatma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg"> Şekil 4: Kombine GWAS sonuçlarını gösteren pleiotropik harita. Pleiotropik harita, tüm genomda çeşitli özelliklerle ilişkili bölgeleri vurgulamaktadır. Dış halkalardaki sayılar karşılık gelen kromozomları gösterir. Her çember, önemli ölçüde ilişkili SNP'leri ile bireysel bir özelliği temsil eder. Renkler farklı bileşik sınıflarını temsil eder (gri = bileşik sınıf 1; yeşil = bileşik sınıf 2; mor = bileşik sınıf 3; sarı = bileşik sınıf 4). Aynı genomik bölgeye sahip bileşikler arası sınıf ilişkileri durumunda, genler vurgulanır. İç gri daire, belirli bir genomik pozisyonla ilişkili tüm önemli SNP'lerin toplamını gösterir. Bu şekilde gösterilen ilişkilendirmeler yapay olarak yalnızca örnek olarak oluşturulmuştur. Kısaltmalar: GWAS = genom çapında ilişkilendirme çalışmaları; SNP'ler = tek nükleotid polimorfizmleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">Lipitler için UHPLC-MS ayarları</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zaman [min]</td>
			<td>Eluent A'dan B'ye [%]*</td>
			<td colspan="3">Bilgi</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>%45 A</td>
			<td colspan="3">Eluent A: %1 1M NH4-Asetat, suda %0,1 asetik asit (UHPLC sınıfı)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>lg %45 - %25 A</td>
			<td colspan="3">Elüent B: %1 1M NH4-Asetat, asetonitril/2-propanol 7:3 içinde %0,1 asetik asit (UHPLC sınıfı)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>lg %25 - %11 A</td>
			<td colspan="3">
Akış hızı: 400 μL/dak</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>lg %11 - %0 A</td>
			<td colspan="3">
Enjeksiyon hacmi: 2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>cw %0 A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.50-19.51</td>
			<td>%0 - %45 A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.51-24.00</td>
			<td>eq %45</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Polar ve yarı kutupsal metabolitler için UHPLC-MS/MS ayarları</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zaman [min]</td>
			<td>Eluent A ve B [%]*</td>
			<td colspan="3">Bilgi</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>%99 A</td>
			<td colspan="3">Elüent A: Suda% 0.1 formik asit (UHPLC sınıfı)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>lg %99 -%60 A</td>
			<td colspan="3">Eluent B: Asetonitrilde% 0.1 formik asit (UHPLC sınıfı)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>lg %60 - %30 A</td>
			<td colspan="3">
Akış hızı: 400 μL/dak</td>
		</tr>
<tr>
<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>lg %30 - %1 A</td>
			<td colspan="3">
Enjeksiyon hacmi: 3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>cw %1 A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>lg %1 - %99 A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>eq %99 A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Türevlenmiş metabolitler için GC-MS ayarları</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zaman [min]</td>
			<td>Sıcaklık [°C]</td>
			<td colspan="3">Bilgi</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">
Taşıyıcı gaz: Helyum</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>lg 80 - 330</td>
			<td colspan="3">
Akış hızı: 2 mL/dak</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>cw 330</td>
			<td colspan="3">
Sıcaklık gradyanı: 15 °C/dak</td>
		</tr>
<tr>
<td>24.66</td>
			<td>hızlı soğutma</td>
			<td colspan="3">
Enjeksiyon hacmi: 1 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Analitik platformların her biri için gradyan ayarları7. Kısaltmalar: lg = doğrusal gradyan; cw = sütun yıkama; eq = denge; UHPLC-MS = ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi; UHPLC-MS/MS = ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi; GC-MS = gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi. * = yüzde değeri eluent A'ya karşılık gelir; kalan yüzde değeri, B elüentine karşılık gelir.
Ek Tablo 1: Ham lipidomik veriler. Her örnek üzerinde algılanan kümelerin her biri için tepe yoğunluklarını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Bu protokolde, birçok numunenin verimli ve hızlı bir şekilde numune hazırlamasını birleştiren optimize edilmiş bir iş akışı sunuyoruz. Ek olarak, metabolik GWAS çalışmalarının yüksek verimli değerlendirilmesi için analitik varyasyonları azaltmak için adım adım bir kılavuz sunuyoruz.

Büyük Ölçekli Multi-omik Genom Çapında İlişkilendirme Çalışmaları (Mo-GWAS): Numune Hazırlama ve Normalleştirme Kılavuzları

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Daha büyük popülasyonu araştırmak, doğal çeşitlilikten kaynaklanan gerçek varyasyon olan makine güdümlü bir varyasyonla birlikte gelir. Burada, aşağı akış entegrasyon analizi için teknik çeşitliliği azaltmaya yönelik bir yöntem gösteriyoruz. Bu tekniğin avantajları, ilgili analitik platformda çeşitli metabolitlerin analizini sağlarken, sistemik hatayı ortadan kaldırırken ve biyolojik varyansı korurken, yüz ayırma tabanlı bir ekstraksiyonu içerir.Genotipik ve fenotipik bilgi elde edildikten sonra, bu yöntem herhangi bir yaşam krallığındaki herhangi bir farklı doğal popülasyona uygulanabilir. 20 mililitrelik hasat tüpleri almaya başlamak için, tüpleri homojenize etmek ve etiketlemek için iki adet beş milimetre ve iki adet sekiz milimetre çapında metal boncuk ekleyin. Ardından, taze yaprak ve kök dokusu örneklerini flaş dondurma yoluyla sıvı azotta hasat ettikten hemen sonra sıvı azotla bir dewar doldurun.Hasat edilen biyolojik numuneleri daha fazla işlem için 80 santigrat derecede saklayın. Tüp tutucuları sıvı azotla önceden soğutun. Daha sonra, homojen bir toz elde etmek için dokuları bir dakika boyunca 25 hertz'de öğütün.Doku homojen bir şekilde öğütülmemişse dondurmayı ve taşlamayı tekrarlayın. 50 miligram taze bitki malzemesini, tartım işlemi sırasında bitki malzemesinin donmuş kalmasını sağlamak için önceden soğutulmuş etiketli iki milimetre güvenli kilitli mikrosantrifüj tüplerinde tartın. Numunenin 1 ila 50 miligram alikotu olan bir mililitre önceden soğutulmuş ekstraksiyon karışımı ekleyin ve buz üzerinde tutmadan önce tüpü kısa bir süre vorteksleyin.Örnekleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 800 kez G'de bir yörüngesel çalkalayıcıda inkübe edin, ardından 10 dakika boyunca buz soğutmalı bir sonikasyon banyosunda sonikasyon yapın. Numunelere 500 mikrolitre ekstraksiyon karışımı eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın ve ekstraktları kısa bir girdap ile karıştırın, ardından karışımı dört santigrat derecede 5 dakika boyunca 11.200 kez G'de santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, ayrılmış üst lipit içeren fazın 500 mikrolitresini önceden etiketlenmiş 1,5 mililitrelik güvenli kilitli mikrosantrifüj tüpüne aktarın, üst fazın geri kalanını çıkarın.Ayrı olarak, 1,5 mililitrelik güvenli kilit mikrosantrifüj tüpleri, alt yarı kutupsal faz dört GCMS'nin 150 mikrolitresini ve yarı kutupsal faz dört U-H-P-L-C MS analizinin 300 mikrolitresini aktarır. Ekstrakte edilen tüm fraksiyonları ısıtmadan konsantre etmek ve kurutulmuş fraksiyonları 20 santigrat derecede saklamak için solvent buharlaşması için bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın. Numuneyi ultra yüksek performansa hazırlamak için, sıvı kromatografisi, kütle spektrometrisi veya H-P-L-C MS, kurutulmuş yarı kutupsal fraksiyonları 180 mikrolitre metanol ve su karışımında yeniden askıya alın.Daha sonra yarı kutupsal fazı 2 dakika boyunca sonikleştirin, ardından bir dakika boyunca 11.200 kez G'de santrifüjleme yapın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantın 90 mikrolitresini bir cam şişeye aktarın ve ekstraktların iki mikrolitresini dökülen LCMS örneğine enjekte edin. Metabolit fraksiyonasyonunu, 40 santigrat derecede tutulan ters bir Faz C18 sütununda ve atık su A ve B'nin kademeli değişimleriyle dakikada 400 mikrolitrelik bir akış üzerinde gerçekleştirin, 102 1500 kütle / şarj oranı kütle aralığına sahip negatif iyonizasyon modunda test boş ve kalite kontrol numunelerinin kütle spektrumlarını elde edin.Yarı kutupsal metabolit numuneleri için, negatif ve pozitif iyonizasyon modlarında veriye bağımlı tandem kütle spektrometrisinde havuzlanmış bir QC örneği çalıştırın. Ek açıklama için elde edilen kütle spektrumlarını kullanın. İç standardın dağılımını kontrol ederek veri kümesinin normalleştirilmesini gerçekleştirin.Tek veya birden fazla dahili standardın sinyalini düzelterek verileri normalleştirin. Ardından, kromatogramdan elde edilen tepe yoğunluklarını tam numune ağırlığı üzerinden düzeltin. Çok partili seriler arasındaki yoğunluk sürüklenmesini düzeltmek için, R.Genom çapında ilişkilendirme çalışmaları veya GWAS yapmadan önce, genotipik verileri% 5'ten daha az küçük alel frekansları ve% 10'dan fazla eksik bir oran için püskül kullanarak yerel olarak tahmin edilen dağılım grafiği düzgünleştirme gibi QC tabanlı düzeltme yöntemleri gerçekleştirin.Bu, düşük frekanslı önyargıyı önleyecektir. Çevresel faktörlerden kaynaklanan önyargıyı ortadan kaldırmak için R paketi LME dördünü kullanın ve deneysel tekrarlar üzerinden normalleştirilmiş her özellik için en iyi doğrusal, tarafsız tahminleri veya blopları hesaplayın. R'deki rMVP paketiyle GWAS'yi gerçekleştirmek için her özelliğin bloplarını ayrı ayrı kullanın.Birkaç yaygın fasulye türündeki lipidomik veriler, farklı partilerden iki QC örneğinin ham baz tepe kromatogramlarına dayanarak gösterilir.Bazı lipit sınıfları için sinyal yoğunluklarında bir değişiklik gözlendi. Sistemik hata, ham veriler üzerinde ana bileşen analizi yapıldığında daha belirgindi. Yerel olarak tahmin edilen dağılım grafiği yumuşatma da dahil olmak üzere normalleştirme prosedürü, QC örneklerinin kümelenmesine yol açtı.Tek tek kümelere diseksiyon yapılırken, yedinci ve sekizinci gruptaki makine güdümlü hatalar, normalleştirmeden önce netleşti ve düzeltildi. GWAS için normalleştirilmiş ve dönüştürülmüş bireysel metabolomik kümeler kullanıldı ve çeşitli özellik belirteçleri ilişkilerinde bulundu. Temsili analizde, farklı bileşik sınıfları farklı renklerde vurgulanırken, çoklu bileşik sınıflarıyla ilişkili belirteçler en yakın geni ile gösterilir.Veri normalleştirme ve dönüştürme en önemli adımlardan biridir. Sistemik hatayı düzeltmek için uygun düzeltmenin yapıldığından emin olun ve dağıtımda normalliği sağlayın. Analitik varyasyon için düzeltme yapılarak, metabolik korelasyon analizi ve karmaşık özelliklere ışık tutmak için fenomik verilere entegrasyon gibi çeşitli entegrasyon yaklaşımları gerçekleştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Large-scale tarımı plaka tabanlı Caenorhabditis elegans: diyabet metabolik değişiklikler çalışma için numune hazırlama

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probuelektrosprey Iyonizasyon Kütle Spektrometresi için Örnek Hazırlama

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Proteomik Tesis Gönderimi ve Müteakip Veri Analizi için TMT Örnek Hazırlama

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Cryo-EM için Yüksek Sıcaklık Numune Izgaralarının Hazırlanması

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Peptidomik Çalışmalar için Aminlerin Indirgeyici Metilasyonunu Kullanarak Numune Hazırlama ve Göreli Nicellik

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Elektron Kristalografik Çalışmaları için Lipid Monolayer Yöntemi Kullanılarak Numune Hazırlama

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...