Name: microelectrode array recording of sinoatrial node firing rate to identify intrinsic cardiac pacemaking defects in mice
Uploaded: 2021-07-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice at JoVE.com

这项工作由国家卫生研究院资助，赠款编号为R01NS100954和R01NS099188。

这里描述的所有实验程序都是根据国家卫生研究院（NIH）的指导方针进行的，该指南是经南方卫理公会大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的。
1. 涂层多电极阵列 （MEA） 用于录制
<ol><li>制作 25 mM 护套缓冲器。<ol>
<li>溶解 0.953 g Na2B4O7+10 H2O 在 80 mL 蒸馏水中。</li>
		<li>将 pH 值调整到 8.4 与 HCl，然后添加蒸馏水到最终体积 100 mL。</li>
	<...

练习和掌握 SAN 解剖过程势在必行，因为组织是脆弱的，健康组织是成功记录的必要条件。在 SAN 解剖过程中，正确的方向对于获得适当的组织区域至关重要。然而，心脏的原始方向很容易在解剖过程中丢失，这使这一努力复杂化。因此，为了确保正确的左右方向，应对阿丽亚进行目视检查。通常，右中庭往往更透明，而左中庭通常更暗，颜色更红25，48。</s...

心脏是一个复杂的器官，由心脏内在和外在的影响，如那些起源于大脑的影响。中性节点（SAN）是心脏中一个定义区域，容纳心脏起搏器细胞（也称为中腹细胞，或SA细胞），负责启动和延续哺乳动物心跳1，2。内在心率是由心脏起搏器细胞驱动的，不受其他心脏或神经幽默的影响，但传统的心率测量在人类和活的动物，如心电图，反映了心脏起搏器和神经对心脏的影响。对SA细胞最显著的神经影响来自自主神经系统，它不断调节发射模式，以满足身体的生理要求3。支持这个想法，同情和寄生虫预测可以在SAN4附近找到。内在心脏神经系统（ICNS）是另一个重要的神经影响，其中结石丛，特别是在右侧，内侧和调节SAN5，6的活动。
了解制步缺陷在临床上很重要，因为功能障碍可能是许多心脏疾病的基础，并导致其他并发症的风险。病窦综合征（SSS）是一类疾病，其特征是鼻节点功能障碍，妨碍了适当的步调7，8。SSS可以呈现鼻窦心动过速，鼻窦暂停，鼻窦逮捕，鼻窦退出块，交替的胸膜和心动过速9，并可能导致并发症，包括增加脑卒中和突然死亡的风险8，10。那些患有布鲁加达综合征，一种以心室颤动为特征的心脏疾病，心脏骤死的风险增加，如果他们也有合并性SA功能障碍11，12，则患心律失常事件的风险更大。心房功能障碍也可能有超出心脏的生理后果。例如，由于脑溢血13，SSS被观察到会引发患者的癫痫发作。
为了识别中性起搏缺陷，需要通过测量 SAN 的活动来确定内在心率，而不受自主神经系统或幽默因素的影响。临床上，这可以通过药理自主封锁14来近似，但同样的技术也可以应用于哺乳动物模型研究内在心脏功能15，16。虽然这种方法可以阻断大部分促成的神经影响，并允许进行体内心脏检查，但它并不能完全消除对心脏的所有外在影响。另一种用于研究动物模型内在心脏功能的研究技术是使用Langendorff香灌心脏的孤立心脏记录，这通常涉及使用电图、起搏或史诗多电极阵列17、18、19、20进行测量。虽然这项技术更具体于心脏功能，因为它涉及从身体去除心脏，测量可能仍然受机械-电力自动调节机制的影响，可能会影响内在心率测量21。孤立的心脏记录也可能仍然受到自主调节的影响，通过ICNS5，6，22，23。此外，在孤立的心脏接近20时，维持与生理相关的心脏温度（对心脏功能测量至关重要）可能很困难。研究 SAN 功能的更直接的方法是专门分离 SAN 组织并测量其活性。这可以通过SAN条（孤立的SAN组织）或孤立的SAN心脏起搏器细胞24，25完成。两者都需要高度的技术培训，因为 SAN 是一个非常小且定义高度明确的区域，并且细胞隔离构成更大的挑战，因为分离如果执行不当，可能会损害细胞的整体健康。此外，这些技术需要专家的电生理技能，以便使用单个记录微电极从组织或细胞成功记录。
在此协议中，我们描述了一种使用微电极阵列 （MEA） 进行体外记录 SAN 的技术，以获得内在心率测量。这种方法的优点是使缺乏密集电生理技能的研究人员能够获得高度特定的电生理记录。MEA以前曾用于研究心肌细胞主要培养物中心肌细胞功能26、27、28、29、30、31、32、心表33、34、35、36、37、38、39和组织整体坐骑40， 41，42，43，44，45，46，47。先前的工作也已完成，以检查现场潜力在SAN组织41，42。在这里，我们提供了一种方法，使用MEA记录和分析穆林内在SAN发射率。我们还描述了如何利用这项技术来测试药物对SAN内在燃烧率的药理学影响，提供一个样本实验，显示4-氨基苯丙胺（4-AP）的效果，一种电压门K+通道阻滞剂。使用定义的解剖地标，我们可以准确地记录 SAN，而无需执行其他方法所需的广泛组织解剖或细胞隔离。虽然 MEA 的成本高得令人望而却步，但录音提供了非常具体和可靠的制进度度，可用于大量的临床和生理研究应用。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Aminopyridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A78403-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 gauge syringe needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-5A</td>
			<td>Used for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 gauge syringe needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-6C</td>
			<td>Used for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm Petri Dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-105G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500mL Pyrex Bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1C</td>
			<td>Used to store solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Pyrex Bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td>Used to store solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (95% O2, 5% CO2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Scissors, 4&#34;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition PC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920x1080</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Jenco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #2 Laminectomy Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11223-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Chamber</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>49WF30</td>
			<td>Used for mouse euthanization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harp Anchor Kit</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>&#160;SHD-22CL/15 WI 64-0247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>SA48-4</td>
			<td>Used for pH balancing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram</td>
			<td>NDC 63739-953-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Motic</td>
			<td>AE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light for Dissection Microscope</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td>MI150DG 660000391014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208337-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MED64 Head Amplifier</td>
			<td>MED64</td>
			<td>MED-A64HE1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MED64 Main Amplifier</td>
			<td>MED64</td>
			<td>MED-A64MD1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MED64 Perfusion Cap</td>
			<td>MED64</td>
			<td>MED-KCAP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MED64 Perfusion Pipe Holder Kit</td>
			<td>MED64</td>
			<td>MED-KPK02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MED64 ThermoConnector</td>
			<td>MED64</td>
			<td>MED-CP04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh</td>
			<td>&#160;Warner Instruments</td>
			<td>640246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode array (MEA)</td>
			<td>Alpha Med Scientific</td>
			<td>MED-R515A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobius Software</td>
			<td>WitWerx Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Specific software for the MED64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>S320-500</td>
			<td>Used for pH balancing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>Ultigiene</td>
			<td>NDC 50989-885-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1751733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-298</td>
			<td>1/8&#39;&#39; Interior Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgruard Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14074-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipets (3mL graduated)</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microelectrode array recording of sinoatrial node firing rate to identify intrinsic cardiac pacemaking defects in mice

位于右中庭的中天节点（SAN）包含心脏的心脏起搏器细胞，该区域功能障碍可导致心动过速或心动过速。心脏起搏缺陷的可靠识别需要通过在很大程度上防止自主神经系统的影响来测量内在心率，而自主神经系统可以掩盖心率缺陷。分析内在心脏起搏器功能的传统方法包括药物诱导的自主封锁，以测量 体内 心率，分离心脏记录测量内在心率，以及中性心脏起搏器细胞的中性条带或单细胞贴片夹记录，以测量自发行动的潜在发射率。然而，这些更传统的技术在技术上可能具有挑战性，而且难以执行。在这里，我们提出了一种新的方法，通过执行微电极阵列（MEA）记录从小鼠的全安装中天节点制剂来测量内在心脏发射速率。MEA 由多个微电极组成，这些微电极以网格状模式排列，用于记录 体外 细胞外场电位。与以往记录内在心率的方法相比，此处描述的方法具有相对更快、更简单、更精确的综合优势，同时允许简单的药理学审讯。

在让组织在盘子中适应15分钟后，记录了10个一分钟的痕迹。我们当前的协议记录了一个多小时的活动，但我们在未在此处未显示的未发布数据中记录了 ≥4 h 的稳定发射模式。如果实验准备对数据收集有好处，则每个录制通道应显示给定通道均匀形状的一致且均匀间隔的重复波形（即尖峰）（图 11D）。这些波形对应于反映内在心脏起搏活动的单个心跳。每个通道的间歇间隔...

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Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

该协议旨在描述一种新的方法，测量内在心脏发射率使用微电极阵列记录整个中天节点组织，以确定小鼠的制动缺陷。药理制剂也可以在这种方法中引入，以研究它们对内在起搏的影响。

微电极阵列记录中天节点发射率，以识别小鼠内在心脏起搏缺陷

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...

测量内在心率是心脏健康的重要指标。该技术准确测量了该速率，同时排除了对中天节点的大部分混淆影响。MEA 记录内在心率可捕获与单细胞记录类似的准确发射速率数据，无需进行广泛的电生理学培训。使用这种技术的个人可能很难在早期实验中获得健康的组织制剂，因此在开始实际数据收集之前，请进行解剖并优化缓冲和数据收集设置。演示这个程序的将是医生曼思和普拉文库马尔，博士后研究人员在我的实验室。首先用血量计固定安乐死小鼠的皮肤，并使用手术剪刀在肋骨底部的皮肤上进行横切，从左拱门到右拱门。使用手术剪刀切开腹膜，小心地将肝脏从隔膜中分离，而不会划破肝脏以防止过度出血。将胸腔的隔膜化为胸腔。使用手术剪刀将肋骨的横壁从成本拱门边缘切至锁骨以暴露心脏，然后使用 23 量表注射器针将肋骨固定在肩部。使用转移移液器将温暖的肝素化完全 Tyrode 的解决方案滴在心脏上，使其保持湿润。用额外的细格雷夫钳子握住肺部，用手术剪刀切开气管以切除肺部。要切除心脏，用额外的细格雷夫钳子保持心脏的顶点，用手术剪刀切开主动脉和劣质静脉卡瓦。将心脏转移到含有腌制硅胶弹性体的培养皿中，并使用转移移液器为心脏沐浴两到三毫升的温肝素化完整的Tyrode溶液。用解剖针将心脏的顶点连接到盘子上。拿着低劣的维纳卡瓦与杜蒙 2 层切除术钳。插入一个22仪表注射器针通过低劣和优越的静脉腔定位其位置在右中庭，这也确定了约似位置的中庭节点。用Dumont 2层压切钳握住右心房附属物，并通过右心房附属物放置解剖针，使其就位。重复相同的程序为左心房附属物，然后删除注射针跨越静脉腔。使用 Castroviejo 剪刀去除心脏的顶点，在心室进行横切切，以释放心脏的血液，然后通过添加温暖的肝素化完整 Tyrode 溶液来洗净心脏。使用卡斯特罗维耶霍剪刀沿着腹腔隔膜切割，直到腹腔与心室分离，使切口靠近心室。沿着动脉间隔膜切开，以去除左中庭。将解剖销放在右中庭的外围，使其平放。使用卡斯特罗维耶霍剪刀从中庭取出剩余的脂肪、血管或组织，并将中庭节点定位在右中庭。将 Tyrode 的解决方案添加到输入解决方案模型中，并打开卡博根气体的流动，为 Tyrode 的解决方案提供氧气。将渗透泵设置为 25 RPM，使流量为每分钟 2 毫升。启动泵后，确保缓冲器不会从系统泄漏，并将温度控制器设置为 37 摄氏度。使用 Dumont 55 钳将解剖的组织从解剖的 Petri 盘转移到微电极阵列网格上。用柔软的画笔轻轻放置组织，覆盖电极网格的中天节点区域。然后使用骨钳或任何弯曲的钳子将网格放在组织上。使用骨钳，将竖琴锚固定在网格上，将一切固定到位。将微电极阵列盘排列在连接器板上。小心地将灌注帽放在微电极阵列盘上，而不会干扰竖琴切片锚，并用胶带固定灌注间隙。打开放大器，为软件中的录制设置工作流程。选择beat_recording。莫弗洛模板。打开它，根据所需的记录条件设置跟踪数、跟踪持续时间、跟踪间隔、输入电压、采样速率和其他记录参数。单击记录并播放按钮以开始录制并获取 10 个 1 分钟持续时间的痕迹，并在跟踪之间间隔两分钟获取数据。暂停泵并切换泵流入管从正常的记录解决方案到Tyrode的解决方案，其中包含所需的药物的选择。重新启动泵并恢复录制。一旦药物注入的Tyrode的溶液到达组织，记录10个痕迹的方式与之前的基线记录相同。拍摄组织在微电极阵列上的定位的最终图像。打开分析软件节拍频率分析模板中保存的记录数据文件。单击播放并允许整个录制运行数据可视化，然后分配适当的分析参数。选择要包含在分析中的通道，并设置自动波形峰值识别所需的振幅最大值或振幅最小阈值值。再次单击播放图标以重播数据集，并确认分析参数适合峰值提取。为了进行分析，确定在实验基线期间，在大多数通道中每个微量显示稳定跳动率的三个最稳定的连续痕迹，以及药物暴露期间连续三个稳定的痕迹。单击播放并录制图标以开始分析。这些数据是从一只45天大的雄性野生型黑色瑞士小鼠身上收集的，用于中天节点节拍频率测量。在不同的通道中观察到形状和振幅不同的波形，所有通道都显示相同的中间间隔和发射频率。然而，组织与电极接触的程度也可能影响波形特征，如振幅。从10个记录的痕迹中，选择了三个连续的通道，具有稳定的节拍频率和间歇间隔作进一步分析。坏的提取尖峰模式应该不存在，但如果存在受噪音或不稳定的影响。与单个心跳相对应的波形反映了内在心脏起搏活动。微电极阵列系统便于药物制剂的应用，分析药理作用。在抽样数据中，所有64个通道中所选三个痕迹的内在发射速率约为每分钟320次。引入4-阿米诺皮里米丁增加了中间的间隔，如预期的那样，这减少了节拍频率从320到210节拍每分钟。要收集可靠的数据进行分析，重要的是要通过验证痕迹是否稳定并符合标准标准来确认组织在记录过程中是否健康。MEA 可用于记录心脏其他区域的心脏活动，允许详细的区域特定特征，可用于研究遗传和药理操作的影响。

Research

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