Name: microelectrode array recording of sinoatrial node firing rate to identify intrinsic cardiac pacemaking defects in mice
Uploaded: 2021-07-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health mit den Fördernummern R01NS100954 und R01NS099188 finanziert.

Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Southern Methodist University genehmigt wurden.
1. Beschichtung des Multielektroden-Arrays (MEA) für die Aufnahme
<ol><li>Machen Sie 25 mM Boratpuffer.<ol>
<li>0,953 gNa2B4O7·10H2O in 80 ml destilliertem Wasser auflösen.</li>
		<li>S...

Das Üben und Beherrschen des SAN-Dissektionsprozesses ist unerlässlich, da das Gewebe zerbrechlich ist und gesundes Gewebe für eine erfolgreiche Aufnahme notwendig ist. Während der SAN-Dissektion ist eine korrekte Orientierung unerlässlich, um die richtige Geweberegion zu erhalten. Die ursprüngliche Ausrichtung des Herzens kann jedoch während des Dissektionsprozesses leicht verloren gehen, was dieses Unterfangen erschwert. Um die richtige Links-Rechts-Ausrichtung zu gewährleisten, sollten die Vorhöfe daher visue...

Das Herz ist ein komplexes Organ, das sowohl von kardiale-intrinsischen als auch von extrinsischen Einflüssen gesteuert wird, wie sie im Gehirn entstehen. Der Sinusknoten (SAN) ist eine definierte Region im Herzen, die die Schrittmacherzellen (auch als Sinuszellen oder SA-Zellen bezeichnet) beherbergt, die für die Initiierung und Aufrechterhaltung des Herzschlags von Säugetieren verantwortlich sind1,2. Die intrinsische Herzfrequenz ist die Rate, die von den Herzschrittmacherzellen ohne Einfluss anderer kardialer oder neurohumoraler Einflüsse angetrieben wird, aber traditionelle Messungen der Herzfrequenz bei Menschen und lebenden Tieren, wie Elektrokardiogramme, spiegeln sowohl den Herzschrittmacher als auch neuronale Einflüsse auf das Herz wider. Der bemerkenswerteste neuronale Einfluss auf SA-Zellen kommt vom autonomen Nervensystem, das ständig Feuermuster moduliert, um die physiologischen Anforderungen des Körpers zu erfüllen3. Um diese Idee zu unterstützen, finden sich in der Nähe des SAN4sowohl sympathische als auch parasympathische Projektionen. Das intrinsische Herznervensystem (ICNS) ist ein weiterer wichtiger neuronaler Einfluss, bei dem ganglionierte Plexi, insbesondere in den rechten Vorhöfen, die Aktivität des SAN 5innervierenund regulieren5,6.
Das Verständnis von Schrittmacherdefiziten ist klinisch wichtig, da Funktionsstörungen vielen Herzerkrankungen zugrunde liegen und zum Risiko anderer Komplikationen beitragen können. Sick-Sinus-Syndrom (SSS) ist eine Kategorie von Krankheiten, die durch eine Dysfunktion des Sinusknotens gekennzeichnet sind, die die richtige Schrittmacherei behindert7,8. SSS kann mit Sinusbradykardie, Sinuspausen, Sinusstillstand, sinoatrialem Austrittsblock und abwechselnden Bradyarrythmien und Tachyarrhythmien9 auftreten und kann zu Komplikationen führen, einschließlich eines erhöhten Risikos für embolischen Schlaganfall und plötzlichen Tod8,10. Diejenigen mit Brugada-Syndrom, einer Herzerkrankung, die durch Kammerflimmern mit einem erhöhten Risiko für plötzlichen Herztod gekennzeichnet ist, haben ein höheres Risiko für arrhythmogene Ereignisse, wenn sie auch eine komorbide SAN-Dysfunktion haben11,12. Sinoatriale Dysfunktion kann auch physiologische Folgen über das Herz hinaus haben. Zum Beispiel wurde beobachtet, dass SSS Beifällen bei einem Patienten aufgrund einer zerebralen Hypoperfusion ausgelöst wird13.
Um sinoatriale Schrittmacherdefizite zu identifizieren, müssen die intrinsischen Herzfrequenzen durch Messung der Aktivität des SAN ohne den Einfluss des autonomen Nervensystems oder humoraler Faktoren bestimmt werden. Klinisch kann dies durch pharmakologische autonome Blockade14angenähert werden, aber dieselbe Technik kann auch in Säugetiermodellen angewendet werden, um die intrinsische Herzfunktion15,16zu untersuchen. Während dieser Ansatz einen großen Teil der beitragenden neuronalen Einflüsse blockiert und eine In-vivo-Herzuntersuchung ermöglicht, beseitigt er nicht alle extrinsischen Einflüsse auf das Herz vollständig. Eine weitere Forschungstechnik, die zur Untersuchung der intrinsischen Herzfunktion in Tiermodellen verwendet wird, sind isolierte Herzaufnahmen mit Langendorff-perfundierten Herzen, die typischerweise Messungen mit Elektrogrammen, Pacing oder epikarden Multielektrodenarrays17,18,19,20beinhalten . Während diese Technik spezifischer für die Herzfunktion ist, da sie das Herz aus dem Körper entfernt, können die Messungen immer noch durch mechanoelektrische Autoregulationsmechanismen beeinflusst werden, die die intrinsischen Herzfrequenzmessungen beeinflussen könnten21. Die isolierten Herzaufnahmen können auch noch durch autonome Regulation durch das ICNS 5,6,22,23beeinflusst werden. Darüber hinaus kann die Aufrechterhaltung einer physiologisch relevanten Temperatur des Herzens, die für Herzfunktionsmessungen entscheidend ist, bei isolierten Herzansätzen schwierig sein20. Eine direktere Methode zur Untersuchung der SAN-Funktion besteht darin, SAN-Gewebe spezifisch zu isolieren und seine Aktivität zu messen. Dies kann durch SAN-Streifen (isoliertes SAN-Gewebe) oder isolierte SAN-Schrittmacherzellen24,25erreicht werden. Beide erfordern ein hohes Maß an technischer Ausbildung, da das SAN eine sehr kleine und hoch definierte Region ist und die Zellisolierung eine noch größere Herausforderung darstellt, da die Dissoziation die allgemeine Gesundheit der Zelle schädigen kann, wenn sie nicht richtig durchgeführt wird. Darüber hinaus erfordern diese Techniken elektrophysiologische Fachkenntnisse, um mit einzelnen Aufzeichnungsmikroelektroden erfolgreich aus dem Gewebe oder den Zellen aufzunehmen.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Technik zur Aufzeichnung des SAN in vitro mit einem Mikroelektrodenarray (MEA), um intrinsische Herzfrequenzmessungen zu erhalten. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass hochspezifische elektrophysiologische Aufzeichnungen forschern zugänglich gemacht werden, denen es an intensiven elektrophysiologischen Fähigkeiten mangelt. MEAs wurden zuvor verwendet, um die Kardiomyozytenfunktion in primären Kardiomyozytenkulturen26,27,28,29,30,31,32, Herzblättern33,34,35,36,37,38,39und Gewebe ganzen Mounts40zuuntersuchen. 41,42,43,44,45,46,47. Frühere Arbeiten wurden auch durchgeführt, um Feldpotentiale in SAN-Gewebe41,42zu untersuchen. Hier bieten wir eine Methodik zur Verwendung der MEA zur Aufzeichnung und Analyse der intrinsischen SAN-Feuerraten von Murinen. Wir beschreiben auch, wie diese Technik verwendet werden kann, um pharmakologische Wirkungen von Medikamenten auf die intrinsischen Zündraten von SAN zu testen, indem ein Beispielexperiment zur Verfügung gestellt wird, das die Auswirkungen von 4-Aminopyridin (4-AP), einem spannungsgesteuerten K+ Kanalblocker, zeigt. Mithilfe definierter anatomischer Landmarken können wir das SAN genau erfassen, ohne die umfangreichen Gewebedissektionen oder Zellisolierungen durchführen zu müssen, die für andere Methoden erforderlich sind. Während die MEA unerschwinglich sein kann, bieten die Aufzeichnungen hochspezifische und zuverlässige Messungen der Schrittmacherei, die in einer Vielzahl von klinischen und physiologischen Forschungsanwendungen verwendet werden können.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Aminopyridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A78403-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 gauge syringe needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-5A</td>
			<td>Used for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 gauge syringe needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-6C</td>
			<td>Used for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm Petri Dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-105G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500mL Pyrex Bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1C</td>
			<td>Used to store solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Pyrex Bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td>Used to store solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (95% O2, 5% CO2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Scissors, 4&#34;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition PC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920x1080</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Jenco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #2 Laminectomy Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11223-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Chamber</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>49WF30</td>
			<td>Used for mouse euthanization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harp Anchor Kit</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>&#160;SHD-22CL/15 WI 64-0247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>SA48-4</td>
			<td>Used for pH balancing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram</td>
			<td>NDC 63739-953-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Motic</td>
			<td>AE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light for Dissection Microscope</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td>MI150DG 660000391014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208337-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MED64 Head Amplifier</td>
			<td>MED64</td>
			<td>MED-A64HE1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MED64 Main Amplifier</td>
			<td>MED64</td>
			<td>MED-A64MD1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MED64 Perfusion Cap</td>
			<td>MED64</td>
			<td>MED-KCAP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MED64 Perfusion Pipe Holder Kit</td>
			<td>MED64</td>
			<td>MED-KPK02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MED64 ThermoConnector</td>
			<td>MED64</td>
			<td>MED-CP04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh</td>
			<td>&#160;Warner Instruments</td>
			<td>640246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode array (MEA)</td>
			<td>Alpha Med Scientific</td>
			<td>MED-R515A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobius Software</td>
			<td>WitWerx Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Specific software for the MED64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>S320-500</td>
			<td>Used for pH balancing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>Ultigiene</td>
			<td>NDC 50989-885-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1751733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-298</td>
			<td>1/8&#39;&#39; Interior Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgruard Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14074-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipets (3mL graduated)</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microelectrode array recording of sinoatrial node firing rate to identify intrinsic cardiac pacemaking defects in mice

Der Sinusknoten (SAN), der sich im rechten Vorhof befindet, enthält die Herzschrittmacherzellen des Herzens, und eine Dysfunktion dieser Region kann Tachykardie oder Bradykardie verursachen. Die zuverlässige Identifizierung von Herzschrittmacherfehlern erfordert die Messung der intrinsischen Herzfrequenz, indem der Einfluss des autonomen Nervensystems, der Ratendefizite maskieren kann, weitgehend verhindert wird. Traditionelle Methoden zur Analyse der intrinsischen Herzschrittmacherfunktion umfassen eine medikamenteninduzierte autonome Blockade zur Messung der In-vivo-Herzfrequenz, isolierte Herzaufzeichnungen zur Messung der intrinsischen Herzfrequenz und sinoatriale Streifen- oder Einzelzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von sinoatrialen Schrittmacherzellen zur Messung spontaner Aktionspotenzial-Feuerraten. Diese traditionelleren Techniken können jedoch technisch anspruchsvoll und schwierig durchzuführen sein. Hier stellen wir eine neue Methodik zur Messung der intrinsischen Herzfeuerrate vor, indem wir Mikroelektrodenarray-Aufnahmen (MEA) von Sinusknotenpräparaten von Mäusen durchführen. MEAs bestehen aus mehreren Mikroelektroden, die in einem gitterartigen Muster angeordnet sind, um extrazelluläre In-vitro-Feldpotentiale aufzuzeichnen. Die hier beschriebene Methode hat den kombinierten Vorteil, dass sie relativ schneller, einfacher und präziser ist als frühere Ansätze zur Aufzeichnung intrinsischer Herzfrequenzen und gleichzeitig eine einfache pharmakologische Abfrage ermöglicht.

Nachdem sich das Gewebe 15 Minuten lang in der Schüssel akklimatisieren kann, werden 10 einminige Spuren aufgezeichnet. Unser aktuelles Protokoll zeichnet die Aktivität für über eine Stunde auf, aber wir haben stabile Feuermuster für ≥4 h in unveröffentlichten Daten aufgezeichnet, die hier nicht gezeigt werden. Wenn eine experimentelle Vorbereitung für die Datenerfassung gut ist, sollte jeder Aufzeichnungskanal konsistente und gleichmäßig verteilte wiederkehrende Wellenformen (d. H. Spikes) einheitlicher Form ...

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Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine neue Methodik zur Messung der intrinsischen Herzfeuerrate zu beschreiben, indem Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung des gesamten Sinusknotengewebes verwendet wird, um Schrittmacherfehler bei Mäusen zu identifizieren. Pharmakologische Wirkstoffe können auch in diese Methode eingeführt werden, um ihre Auswirkungen auf die intrinsische Schrittmacherei zu untersuchen.

Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung der Sinoatrialknoten-Feuerrate zur Identifizierung intrinsischer Herzschrittmacherfehler bei Mäusen

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...

Die Messung der intrinsischen Herzfrequenz ist ein wichtiger Indikator für die Herzgesundheit. Diese Technik misst diese Rate genau und schließt gleichzeitig die Mehrheit der verwirrenden Einflüsse auf den Sinusknoten aus. Die MEA-Aufzeichnung der intrinsischen Herzfrequenz erfasst genaue Feuerratendaten ähnlich wie Einzelzellaufnahmen ohne umfangreiche Elektrophysiologie-Schulung.Personen, die diese Technik verwenden, können Schwierigkeiten haben, in frühen Experimenten gesunde Gewebepräparate zu erhalten, also üben Sie die Dissektion und optimieren Sie die Puffer und Datenerfassungseinstellungen, bevor Sie mit der eigentlichen Datenerfassung beginnen. Demonstrieren wird das Verfahren von den Ärzten Man Si und Praveen Kumar, Postdoktoranden in meinem Labor. Beginnen Sie, indem Sie die Haut der eingeschläferten Maus mit einem Hämostat halten und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen Querschnitt in die Haut direkt unter dem Boden des Brustkorbs vom linken Rippenbogen zum rechten Rippenbogen zu machen.Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um das Peritoneum aufzuschneiden und die Leber vorsichtig vom Zwerchfell zu trennen, ohne die Leber zu verneinen, um übermäßige Blutungen zu verhindern. Schneiden Sie das Zwerchfell entlang des Thorax ein, um die Brusthöhle freizulegen. Verwenden Sie die chirurgische Schere, um die Seitenwände des Brustkorbs von den Rändern der Rippenbögen bis zu den Klappendecken zu schneiden, um das Herz freizulegen, und verwenden Sie dann eine 23-Gauge-Spritzennadel, um den Brustkorb über die Schulter zu stecken.Verwenden Sie eine Transferpipette, um warme, heparinisierte komplette Tyrode-Lösung auf das Herz zu geben, um es feucht zu halten. Halten Sie die Lunge mit einer extra feinen Graefe-Truppe und durchtrennen Sie die Luftröhre mit einer chirurgischen Schere, um die Lunge zu entfernen. Um das Herz zu entfernen, halten Sie die Spitze des Herzens mit einer extra feinen Graefe-Zette und schneiden Sie die Aorta und die Vena cava inferior mit einer chirurgischen Schere.Übertragen Sie das Herz auf eine Petrischale mit ausgehärtetem Silikonelastomer und verwenden Sie eine Transferpipette zum Baden des Herzens mit zwei bis drei Millilitern warmer, heparinisierter Tyrode-Komplettlösung. Befestigen Sie die Spitze des Herzens mit einem Sezierstift an der Schüssel. Halten Sie die Vena cava inferior mit der Dumont 2 Laminektomie-Heerzette.Führen Sie eine 22-Gauge-Spritzennadel durch die untere und obere Hohlvene ein, um ihre Position im rechten Vorhof zu lokalisieren, die auch die ungefähre Position des Sinusknotens identifiziert. Halten Sie das rechte Vorhoffnungsanhängsel mit der Dumont 2 Laminektomie-Pinge und legen Sie einen Sezierstift durch das rechte Vorhoffnungsteil, um es an Ort und Stelle zu halten. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für das linke Vorhoffnungsbeid und entfernen Sie dann die Spritzennadel, die die Hohlvene überspannt.Verwenden Sie eine Castroviejo-Schere, um die Spitze des Herzens zu entfernen, indem Sie einen Querschnitt über die Ventrikel machen, um das Blut aus dem Herzen freizusetzen, und waschen Sie dann das Herz, indem Sie warme, heparinisierte vollständige Tyrode-Lösung hinzufügen. Verwenden Sie eine Castroviejo-Schere, um entlang des atrioventrikulären Septums zu schneiden, bis die Vorhöfe von den Ventrikeln getrennt sind, und halten Sie den Schnitt näher am Ventrikel. Schneiden Sie entlang des interarteriellen Septums, um das linke Atrium zu entfernen.Platzieren Sie die Sezierstifte in der Peripherie des rechten Vorhofs, damit sie flach liegen. Entfernen Sie mit der Castroviejo-Schere verbleibendes Fett, Gefäße oder Gewebe aus dem Vorhof und lokalisieren Sie den Sinusknoten im rechten Vorhof. Fügen Sie die Lösung von Tyrode zum Eingabelösungsmodell hinzu und schalten Sie den Fluss des Carbogengases ein, um die Lösung der Tyrode mit Sauerstoff zu versorgen.Stellen Sie die Peristaltikpumpe auf 25 U / min ein, was eine Durchflussrate von zwei Millilitern pro Minute ergibt. Stellen Sie nach dem Starten der Pumpe sicher, dass der Puffer nicht aus dem System austritt und stellen Sie den Temperaturregler auf 37 Grad Celsius ein. Verwenden Sie die Dumont 55-Zette, um das sezierte Gewebe von der sezierenden Petrischale auf das Mikroelektroden-Array-Gitter zu übertragen.Positionieren Sie das Gewebe vorsichtig mit einem weichen Pinsel, um den sinusalen Knotenbereich des Elektrodengitters zu überlagern. Legen Sie dann das Netz mit der Knochenzette oder einer gekrümmten Zange über das Gewebe. Positionieren Sie mit der Knochenzette den Harfenanker auf dem Netz, um alles an Ort und Stelle zu halten.Ordnen Sie die Mikroelektroden-Array-Schüssel auf der Anschlussplatte an. Legen Sie die Perfusionskappe vorsichtig auf die Mikroelektroden-Array-Schüssel, ohne den Harfenscheibenanker zu stören, und sichern Sie den Perfusionsspalt mit Klebeband. Schalten Sie den Verstärker ein und richten Sie einen Workflow für die Aufnahme in der Software ein.Wählen Sie beat_recording aus. moflo Vorlage. Öffnen Sie es und stellen Sie die Anzahl der Leiterbahnen, die Leiterbahndauer, das Leiterbahnintervall, die Eingangsspannung, die Abtastrate und andere Aufzeichnungsparameter entsprechend den gewünschten Aufzeichnungsbedingungen ein.Klicken Sie auf die Schaltfläche "Aufnehmen und Wiedergeben", um die Aufzeichnung zu starten und Daten für 10 Spuren von einer Minute Dauer mit zwei Minuten Intervallen zwischen den Ablaufverfolgungen zu erfassen. Pausieren Sie die Pumpe und schalten Sie den Pumpenzuflussschlauch von der normalen Aufzeichnungslösung auf Tyrodes Lösung um, die das gewünschte Medikament der Wahl enthält. Starten Sie die Pumpe neu und setzen Sie die Aufnahme fort.Sobald die mit dem Medikament angereicherte Tyrode-Lösung das Gewebe erreicht hat, zeichnen Sie 10 Spuren auf die gleiche Weise auf, wie dies zuvor für die Baseline-Aufnahmen der Standardwertaufnahmen der Standard war. Machen Sie ein abschließendes Bild von der Positionierung des Gewebes auf dem Mikroelektrodenarray. Öffnen Sie die gespeicherte aufgezeichnete Datendatei in der Beatfrequenzanalysevorlage der Analysesoftware.Klicken Sie auf die Wiedergabe und lassen Sie die gesamte Aufzeichnung zur Datenvisualisierung laufen und weisen Sie dann entsprechende Analyseparameter zu. Wählen Sie die Kanäle aus, die in die Analyse einbezogen werden sollen, und legen Sie die gewünschten Amplitudenmaxima oder Amplitudenminima-Schwellenwerte für die automatisierte Wellenform-Peak-Identifizierung fest. Klicken Sie erneut auf das Wiedergabesymbol, um das Dataset erneut auslaufen zu lassen und zu bestätigen, dass die Analyseparameter für eine Spike-Extraktion geeignet sind.Identifizieren Sie für die Analyse die drei stabilsten aufeinanderfolgenden Spuren, die während des Ausgangszeitraums des Experiments eine stabile Schlagrate für jede Spur über die meisten Kanäle aufweisen, und weitere drei aufeinanderfolgende stabile Spuren während der Arzneimittelexpositionsperiode. Klicken Sie auf das Wiedergabe- und Aufnahmesymbol, um die Analyse zu starten. Die Daten wurden von einer 45 Tage alten männlichen wildtypischen schwarzen Schweizer Maus für die sinoatriale Knoten-Beat-Frequenzmessung gesammelt.Die Wellenformen mit unterschiedlichen Formen und Amplituden wurden in verschiedenen Kanälen beobachtet und alle Kanäle zeigten identische Interspike-Intervalle und Feuerfrequenzen. Der Grad des Gewebekontakts mit der Elektrode kann jedoch auch die Wellenformeigenschaften wie die Amplitude beeinflussen. Aus den 10 aufgezeichneten Spuren wurden die drei aufeinanderfolgenden Kanäle mit stabiler Taktfrequenz und Interspike-Intervall für die weitere Analyse ausgewählt.Die schlecht extrahierten Spike-Muster sollten fehlen, aber wenn vorhanden, sind sie entweder durch Rauschen beeinflusst oder instabil. Die Wellenformen, die den einzelnen Herzschlägen entsprechen, spiegeln die intrinsische Herzschrittmacheraktivität wider. Das Mikroelektroden-Array-System ermöglicht die einfache Anwendung von Arzneimitteln zur Analyse der pharmakologischen Wirkungen.Die intrinsische Feuerrate ausgewählter drei Spuren über alle 64 Kanäle hinweg betrug in den Abtastdaten etwa 320 Schläge pro Minute. Die Einführung von 4-Aminopyrimidin erhöhte die Interspike-Intervalle wie erwartet, was die Taktfrequenz von 320 auf 210 Schläge pro Minute verringerte. Um zuverlässige Daten für die Analyse zu sammeln, ist es wichtig zu bestätigen, dass das Gewebe während der Aufzeichnung gesund ist, indem überprüft wird, ob die Spuren stabil sind und die Standardkriterien erfüllen.MEAs können verwendet werden, um die Herzaktivität in anderen Regionen des Herzens aufzuzeichnen, was eine detaillierte regionsspezifische Charakterisierung ermöglicht, die die Auswirkungen genetischer und pharmakologischer Manipulation untersuchen kann.

Research

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