Name: extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples at JoVE.com

Vi takker taknemmeligt prof. Colin Jackson for støtten med renset cofaktor F420. Denne forskning blev støttet af Tyrols videnskabsfond (TWF) og Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Vi anerkender i høj grad støtten fra GPS, HK, SB, GG og HB.

BEMÆRK: Udvinding og analyse af cofaktor F420 er en tretrinsproces, herunder prøve lysis, cofaktorforrensning via solid-fase ekstraktion (SPE) og cofaktordetektering via ion-parret-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) med fluorescensdetektering. Inden du begynder, skal materialerne og reagenserne klargøres som angivet i tabel 1.
1. Prøve lysis
<ol><li>Der tilsættes op til 5 g prøve til passende rør (f.eks. 50 mL koniske rør).</li>
	<li>5 gtL af lysisbufferen (2x lageropl?...

<ol>
	<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+biochemistry,+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions.">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li><li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes.">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451 (2019).</li><li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+F420:+an+expanded+view+of+its+distribution,+biosynthesis,+and+roles+in+bacteria+and+archaea.">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium.">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria.">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li><li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420.">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments.">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li><li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane.">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li><li>Knittel, K., L&#246;sekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps.">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li><li>Lin, X. -. L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria.">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li><li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis:+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations.">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li><li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea,+in+particular+the+genus+Methanosarcina.">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li><li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis.">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li><li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri.">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species,+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea.">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li><li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis.">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li><li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species.">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li><li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -. S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+production,+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis.">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li><li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase/reductase.">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li><li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+F(420)+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents.">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism.">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000 (2017).</li><li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -. T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes.">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), 11208-11211 (2018).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases.">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902 (2017).</li><li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria.">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li><li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei.">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li><li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed.">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), 139-145 (1994).</li><li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+coenzyme+F(420)+in+Mycobacterium+species.">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li><li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+(Spain).">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic/anoxic+conditions.">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155 (2019).</li><li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila.">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li><li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+acetate:+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments.">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation,+preservation,+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants.">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li><li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis.">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803 (2010).</li></ol>

Til evaluering af cofaktor F420 fra methanogenic rene kulturer kan der udføres en mikroskopisk evaluering for at visualisere væksten og aktiviteten (fluorescensmikroskopi) af de involverede mikroorganismer (figur 1). For prøver, der stammer fra naturlige miljøer, er brugen af mikroskopi til at detektere eller kvantificere F420 begrænset på grund af interferens med andre fluorescerende mikroorganismer, organiske og uorganiske partikler. I denne forbindelse kan ekst...

F420 er en udbredt, men ofte forsømt cofaktor, der fungerer som en obligatorisk to-elektronhydridbærer i primære og sekundære metaboliske processer i både Archaea og Bacteria1,2. F420 er en 5-deazaflavin og strukturelt ligner flavins, hvorved dens kemiske og biologiske egenskaber er mere sammenlignelige med nad + eller NADP +. På grund af substitution af kvælstof med kulstof ved position 5 i isoalloxazinringen er det et stærkt reduktant, hvilket udviser et lavt standard redox-potentiale på -340 mV1,3. F420 består af en 5-deazaflavin ring og en 2-fosfo-L-laktat linker (F420-0). En oligoglutamat hale, der indeholder n+1 glutamatmonomerer, kan fastgøres til molekylet (F420-n+1)4.
I lang tid har cofaktoren F420 udelukkende været forbundet med Archaea og Actinobacteria. Dette er stort set blevet væltet. Nylige analyser viste, at F420 er fordelt på forskellige anerobe og aerobe organismer i phyla Proteobacteria, Chloroflexi, og potentielt Firmicutes beboer et utal af levesteder som jord, søer, og den menneskelige tarm1,5. I 2019 viste Braga et al.6, at proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica producerer et unikt F420-derivat, der indeholder en 3-fosphoglycerate i stedet for en 2-fosfolactathale, som kan være udbredt i forskellige levesteder. Inden for domænet Archaea, F420 er blevet fundet i flere slægter, herunder methanogenic7, methanotrofisk8,9, og sulfat-reducerende ordrer10, og formodes at være produceret i Thaumarchaeota11. F420 er bedst kendt som et essentielt redox coenzym i hydrogenotrofisk og methylotrofisk methanogenese. Den reducerede form af F420 (F420H2) fungerer som elektrondonor til reduktion af methylentetrahydromethanopterin (methylen-H4MPT, Mer) og methenyl-H4MPT12,13. Det kan også bruges som en elektronbærer i H2-uafhængige elektrontransportveje af methanogener, der indeholder cytochromes12,14. Desuden har den oxiderede form af F420 en karakteristisk blågrøn fluorescens ved excitation ved 420 nm, hvilket letter påvisning af methanogener mikroskopisk (figur 1). På grund af det lave redoxpotentiale letter F420 (i) den udefrakommende reduktion af et bredt spektrum af ellers genstridige eller giftige organiske forbindelser, ii) syntese af tetracyklin- og lincosamid antibiotika eller phytotoktoksin i streptomycetes (phylum Actinobacteria) og (iii) resistens over for oxidativ eller nitrosativ stress eller andre ugunstige tilstande i mycobacteria (phylum Actinobacteria)1,5,15 16,17,18,19,20,21,22. Derfor er F420-afhængige oxidoreductaser lovende biokatalysatorer til industrielle og farmaceutiske formål samt til biorensning af forurenede miljøer1,23. På trods af disse nylige resultater er de nøjagtige roller for cofaktoren F420 stadig marginalt kendt i Actinobacteria eller anden bakteriel phyla.
Der er mindst tre veje til F420 biosyntese2,6,24. I begyndelsen er biosyntesevejen opdelt i en 5-deazaflavin biosyntese og en 2-fosfolactat metabolismegren. Den reaktive del af F420-molekylet syntetiseres via FO-synthase ved hjælp af substraterne tyrosin og 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedion. Resultatet er riboflavin niveau chromophore FO. Inden for den aktuelt accepterede laktatmetabolismegren fosforyleres L-laktat til 2-fosfo-L-laktat af en L-laktatkinase (CofB); 2-fosfo-L-laktat, igen, er guanyleret til L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosin ved 2-fosfo-L-laktat guanylyltransferase (CofC). I næste trin er L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosin forbundet med FO ved en 2-fosfo-L-laktatoverførselase (CofD) til F420-02. Endelig enzymet F420-0:ɣ-glutamyl ligase (CofE) ligates glutamat monomers til F420-0, danner den endelige cofaktor6 i varierende antal23,25. Forskellige organismer viser forskellige mønstre i antallet af tilknyttede glutamatrester, med kortere haler fundet for methanogener end i mycobacteria2,25,26. Generelt viser methanogener halelængder fra to til tre, med op til fem i acetoclastic methanogen, Methanosarcina sp., mens halelængder fundet i Mycobacterium sp. varierede fra fem til syv glutamatrester2,25,26,27. De seneste resultater viste imidlertid, at F420 med lang kæde binder sig til F420-afhængige oxidoreductaser med en højere affinitet end kortkædet F420; Desuden øger bundne langkædede F420 substrataffiniteten, men reducerer omsætningen af de respektive enzymer23.
Påvisning af cofaktor F420 er ofte baseret på dens fluorescens. Derved blev dens oligo glutamat derivater adskilt ved hjælp af omvendt fase (RP)-HPLC27,28. For nylig brugte Ney et al. tetrabutylammoniumhydroxid som et ionparringsreagens til den negativt ladede glutamathale for at forbedre adskillelsen på RP-HLPC med succes5. Her præsenterer vi en metode til fremstilling af prøver, efterfølgende lysis, udvinding, rensning, adskillelse og kvantificering af cofaktor F420 ikke kun fra rene kulturer, men også fra forskellige miljøprøver (dvs. jord og rådnende slam).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>HPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge and rotor for 50 mL &#8220;Falcon&#8221; tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Column: Gemini NX C18, 5 &#956;m, 150 x 3 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE filter (pore size 0.22 &#181;m) to remove particulate matter prior HPLC analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin for SPE: Strata-X-AW 33 &#956;m as weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SPE equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples

Cofaktoren F420 spiller en central rolle som hydridbærer i den primære og sekundære metabolisme hos mange bakterielle og arkæiske taxa. Cofaktoren er bedst kendt for sin rolle i methanogenese, hvor det letter termodynamisk vanskelige reaktioner. Da polyglutamat halen varierer i længde mellem forskellige organismer, kan længdeprofilanalyser være et kraftfuldt værktøj til at skelne og karakterisere forskellige grupper og veje i forskellige levesteder. Her beskriver protokollen udvindingen og optimeringen af cofaktor F420-påvisning ved at anvende fastfaseudvinding kombineret med højtydende flydende kromatografianalyse uafhængigt af kulturelle eller molekylære biologiske tilgange. Metoden blev anvendt til at få yderligere oplysninger om cofaktor F420's udtryk fra mikrobielle samfund i jord, anaerobe slam og rene kulturer og blev evalueret ved spiking eksperimenter. Dermed lykkedes det undersøgelsen at generere forskellige F420 halelængdeprofiler for hydrogenotrofisk og acetoclastic methanogener i kontrollerede methanogenic rene kulturer samt fra miljøprøver som anaerobe rådnetankslam og jord.

Rene kulturer af Methanosarcina thermophila og Methanoculleus thermophilus, begge termofile methanogenic Archaea, blev dyrket i egnede medier som beskrevet tidligere29,30. For Methanosarcina thermophila blev methanol brugt som energikilde, mens Methanoculleus thermophilus blev dyrket på H2/CO2. Væksten blev kontrolleret ved mikroskopisk evaluering, mens aktiviteten blev undersøgt ved måling af...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples at JoVE.com

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

En metode til udvinding af cofaktor F420 fra rene kulturer blev optimeret til flydende kromatografisk adskillelse og analyse af F420 halelængde i ren kultur og miljøprøver.

Udvinding af Cofactor F420 til analyse af polyglutamat halelængde fra methanogenic rene kulturer og miljøprøver

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

Den cofaktor F420 spiller en vigtig rolle i den primære og sekundære metabolisme af mange prokaryoter. Måling af dette molekyle i miljøprøver giver mulighed for en dybere forståelse af dets udbredelse og funktion. Denne teknik gør det muligt at analysere cofaktoren i vanskelige prøvematerialer såsom slam og jord.Derved lysis af materialet og pre-rensning før analyse er de centrale trin. Protokollen indeholder forskellige trin under prøveforberedelsen. Disse trin skal planlægges og forberedes meget godt, før prøvebehandlingen påbegyndes.For eksempel er forberedelsen af friske buffere vigtig. For at begynde prøven lysis, placere fem gram af prøven i en 50-milliliter koniske rør. Derefter tilsættes fem milliliter af 2X lysis buffer til prøverne, og bringe volumen til 10 milliliter med destilleret vand for at nå en endelig koncentration på 0,5 gram per milliliter.Vortex de fortyndede prøver i 20 sekunder efterfulgt af autoklavering i 30 minutter ved 121 grader Celsius. For tørre prøver som skovjord, bringe til et sidste volumen på 20 milliliter med destilleret vand efter autoklavering, og hvirvle den fortyndede prøve igen i 20 sekunder som påvist. Når prøverne er kølet ned, centrifugere prøven lysate i fem minutter på 11,000 x g, og indsamle supernatant.Forbered en fem-milliliter fast fase ekstraktion eller SPE kolonne fyldt med 100 milligram svag anion blandet tilstand polymerisk sorbent conditioning anion exchanger med tre milliliter methanol. Derefter ekvilibrere anion veksler med tre milliliter destilleret vand. Læg op til ni milliliter af supernatanten fra det centrifugerede lysat på SPE-kolonnen.Sekventielt vaske urenheder fra kolonnen med fem milliliter af 25-millimolar ammoniakacetat og fem milliliter methanol. Efter vask skal cofaktoren F420 elveres med en milliliter elutionsbuffer. Forudindstillet ovnen til 40 grader Celsius, og sæt fluorescens detektor til 420 nanometer udryddelse bølgelængde og 470 nanometer emission bølgelængde.Derefter filtreres den eluterede prøve fra SPE i HPLC-hætteglas ved hjælp af et PTFE-filter med en porestørrelse på 0,22 mikron. Indsprøjt 50 mikroliter af den filtrerede prøve i HPLC-systemet, og adskil cofaktor F420 via gradienttilstand ved hjælp af en kombination af mobile faser som beskrevet i manuskriptet. Analysere cofaktoren F420 sammensætning og koncentration.Væksten af rene kulturer af methanogener blev verificeret ved mikroskopi. I fasekontrastmikroskopi er agglomerater af methanogener synlige, som udsender et blåligt lys, når cofaktor F420 er begejstret for ultraviolet lys. Topområdet for genvundet cofaktor F420 efter SPE med forskellige mængder af Methanoculleus thermophilus kulturer blev analyseret.Autoklaveringsopløsningsstrategien opnåede det højeste topområde og konkluderede maksimal udvindingseffektivitet ved hjælp af en tryktemperaturbehandling. En analyse af halelængdefordelingen afslørede forskellene i den samlede koncentration af cofaktor F420 og fordelingen af F420-halelængden af de rene methanogenic kulturer i miljøprøver. Når du anvender denne procedure, skal du være opmærksom på helt at indsamle den samlede volumen af elutionbufferen eller registrere den nøjagtige mængde flow-through.Denne teknik baner vejen for udforskning af cofaktor F420 i mere komplekse prøver som jord og slam og giver dybere indsigt i den økologiske virkning af dette molekyle.

Research

JoVE Journal

Environment

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615. Måling af Enterovirus og norovirus Forekomst i vand efter kultur og RT-qPCR. I. Indsamling af virus prøver

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Anvendelse af Chironomidae (Diptera) Overflade-Floating puppe Exuviae som Rapid Bioassessment protokol for vandområder

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Automatiseret Gel Size Selection For at forbedre kvaliteten af ​​Next-generation sequencing biblioteker fremstillet fra Environmental Water Prøver

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Fysisk Isolering af endosporer fra miljøprøver ved målrettet Lysis af vegetative celler

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

En simpel metode til Automated Solid Phase Extraction af vandprøver for Immunologisk analyse af små miljøgifte

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Forberedelse og Test af Impedans-baserede strømningstekniske Biochips med RTgill-W1 Celler til hurtig evaluering af drikkevand Prøver til Toksicitet

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Ekstraktion og analyse af Mikrobiel Phospholipid fedtsyrer i Jordbunden

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Anvendelse af en filterpatron til filtrering af vandprøver og Udvinding af Environmental DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

En lipidekstraktions- og analysemetode til karakterisering af jordmikrober i forsøg med mange prøver

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Ekstraktion af organiske chlorpesticider fra plastpellets og plasttypeanalyse

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...