Name: extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00
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Nous remercions chaleureusement le professeur Colin Jackson pour son soutien avec le cofacteur purifié F420. Cette recherche a été soutenue par le Fonds tyrolien pour la science (TWF) et l’Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Nous reconnaissons grandement le soutien de GPS, HK, SB, GG et HB.

REMARQUE: L’extraction et l’analyse du cofacteur F420 est un processus en trois étapes comprenant la lyse de l’échantillon, la pré-purification du cofacteur via l’extraction en phase solide (SPE) et la détection des cofacteurs via IP-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) avec détection de fluorescence. Avant de commencer, préparez les matériaux et les réactifs comme indiqué dans le tableau 1.
1. Lyse de l’échantillon
<ol><li>Ajouter jusqu’à 5 g d’échantil...

<ol>
	<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+biochemistry,+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions.">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li><li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes.">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451 (2019).</li><li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+F420:+an+expanded+view+of+its+distribution,+biosynthesis,+and+roles+in+bacteria+and+archaea.">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium.">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria.">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li><li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420.">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments.">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li><li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane.">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li><li>Knittel, K., L&#246;sekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps.">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li><li>Lin, X. -. L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria.">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li><li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis:+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations.">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li><li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea,+in+particular+the+genus+Methanosarcina.">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li><li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis.">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li><li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri.">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species,+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea.">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li><li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis.">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li><li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species.">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li><li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -. S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+production,+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis.">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li><li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase/reductase.">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li><li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+F(420)+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents.">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism.">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000 (2017).</li><li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -. T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes.">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), 11208-11211 (2018).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases.">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902 (2017).</li><li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria.">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li><li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei.">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li><li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed.">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), 139-145 (1994).</li><li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+coenzyme+F(420)+in+Mycobacterium+species.">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li><li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+(Spain).">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic/anoxic+conditions.">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155 (2019).</li><li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila.">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li><li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+acetate:+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments.">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation,+preservation,+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants.">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li><li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis.">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803 (2010).</li></ol>

Pour l’évaluation du cofacteur F420 à partir de cultures pures méthanogènes, une évaluation microscopique peut être effectuée pour visualiser la croissance et l’activité (microscopie à fluorescence) des micro-organismes impliqués (Figure 1). Pour les échantillons provenant d’environnements naturels, l’utilisation de la microscopie pour détecter ou quantifier F420 est limitée en raison des interférences avec d’autres micro-organismes fluorescents,...

F420 est un cofacteur répandu mais souvent négligé, qui fonctionne comme un transporteur d’hydrure à deux électrons obligatoire dans les processus métaboliques primaires et secondaires des archées et des bactéries1,2. F420 est une 5-déazaflavine et structurellement similaire aux flavines, ses propriétés chimiques et biologiques étant plus comparables à celles du NAD+ ou du NADP+. En raison de la substitution de l’azote par du carbone à la position 5 du cycle isoalloxazine, il s’agit d’un puissant réducteur, présentant ainsi un faible potentiel redox standard de -340 mV1,3. F420 comprend un cycle de 5-déazaflavine et un liant 2-phospho-L-lactate (F420-0). Une queue d’oligoglutamate contenant n+1 monomères de glutamate peut être attachée à la molécule (F420-n+1)4.
Pendant longtemps, le cofacteur F420 a été uniquement associé aux archées et aux actinobactéries. Cela a été largement renversé. Des analyses récentes ont révélé que le F420 est réparti entre divers organismes anaérobies et aérobies des phyla Proteobacteria, Chloroflexi, et potentiellement Firmicutes habitant une myriade d’habitats comme les sols, les lacs et l’intestin humain1,5. En 2019, Braga et al.6, ont montré que la protéobactérie Paraburkholderia rhizoxinica produit un dérivé unique de F420, contenant un 3-phosphoglycérate au lieu d’une queue de 2-phospholactate, qui pourrait être répandu dans divers habitats. Dans le domaine Archaea, F420 a été trouvé dans plusieurs lignées, y compris methanogenic7, methanotrophic8,9 et sulfate-reducing orders10, et est censé être produit dans Thaumarchaeota11. F420 est surtout connu comme une coenzyme redox essentielle dans la méthanogenèse hydrogénotrophe et méthylotrophique. La forme réduite de F420 (F420H2) fonctionne comme un donneur d’électrons pour la réduction de la méthylènetétrahydrométhanoptérine (méthylène-H4MPT, Mer) et du méthényl-H4MPT12,13. Il peut également être utilisé comme transporteur d’électrons dans les voies de transport d’électrons indépendantes de H2 de méthanogènes contenant des cytochromes12,14. De plus, la forme oxydée de F420 a une fluorescence bleu-vert caractéristique lors de l’excitation à 420 nm, ce qui facilite la détection microscopique des méthanogènes (Figure 1). En raison de son faible potentiel redox, F420 facilite (i) la réduction exogène d’un large spectre de composés organiques autrement récalcitrants ou toxiques, (ii) la synthèse d’antibiotiques tétracycline et de lincosamide ou de phytotoxines chez les streptomycètes (phylum Actinobacteria), et (iii) la résistance au stress oxydatif ou nitrosatif ou à d’autres conditions défavorables chez les mycobactéries (phylum Actinobacteria)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Par conséquent, les oxydoréductases dépendantes de la F420 sont des biocatalyseurs prometteurs à des fins industrielles et pharmaceutiques ainsi que pour la bioremédiation des environnements contaminés1,23. Malgré ces découvertes récentes, les rôles exacts du cofacteur F420 sont encore marginalement connus chez les Actinobactéries ou d’autres phyla bactériens.
Il existe au moins trois voies pour la biosynthèse F4202,6,24. Au début, la voie de biosynthèse est divisée en une biosynthèse de la 5-déazaflavine et une branche du métabolisme du 2-phospholactate. La partie réactive de la molécule F420 est synthétisée via la FO-synthase en utilisant les substrats tyrosine et 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedione. Le résultat est le niveau de riboflavine chromophore FO. Dans la branche du métabolisme du lactate actuellement acceptée, le L-lactate est phosphorylé en 2-phospho-L-lactate par une L-lactate kinase (CofB); Le 2-phospho-L-lactate, à son tour, est guanylé en L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine par la 2-phospho-L-lactate guanylyltransférase (CofC). Dans l’étape suivante, la L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine est liée à la FO par une 2-phospho-L-lactate transférase (CofD) pour former F420-02. Enfin, l’enzyme F420-0:ɣ-glutamyl ligase (CofE) ligate les monomères du glutamate en F420-0, formant le cofacteur final6 en nombre variable23,25. Différents organismes présentent des modèles différents dans le nombre de résidus de glutamate attachés, avec des queues plus courtes trouvées pour les méthanogènes que dans les mycobactéries2,25,26. Généralement, les méthanogènes montrent des longueurs de queue de deux à trois, avec jusqu’à cinq dans le méthanogène acétoclastique, Methanosarcina sp., tandis que les longueurs de queue trouvées dans Mycobacterium sp. variaient de cinq à sept résidus de glutamate2,25,26,27. Cependant, des résultats récents ont montré que la F420 à longue chaîne se lie aux oxydoréductases dépendantes de la F420 avec une affinité plus élevée que la F420 à chaîne courte; de plus, la F420 à longue chaîne liée augmente l’affinité du substrat mais diminue le taux de renouvellement des enzymes respectives23.
La détection du cofacteur F420 est souvent basée sur sa fluorescence. Ainsi, ses dérivés oligo-glutamate ont été séparés à l’aide de la phase inversée (RP)-HPLC27,28. Récemment, Ney et al. ont utilisé l’hydroxyde de tétrabutylammonium comme réactif d’appariement d’ions pour la queue de glutamate chargée négativement afin d’améliorer la séparation sur RP-HLPC avec succès5. Nous présentons ici une méthode pour la préparation d’échantillons, la lyse ultérieure, l’extraction, la purification, la séparation et la quantification du cofacteur F420 non seulement à partir de cultures pures, mais également à partir de différents échantillons environnementaux (sols et boues de digesteur).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>HPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge and rotor for 50 mL &#8220;Falcon&#8221; tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Column: Gemini NX C18, 5 &#956;m, 150 x 3 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE filter (pore size 0.22 &#181;m) to remove particulate matter prior HPLC analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin for SPE: Strata-X-AW 33 &#956;m as weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SPE equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples

Le cofacteur F420 joue un rôle central en tant que porteur d’hydrure dans le métabolisme primaire et secondaire de nombreux taxons bactériens et archéaux. Le cofacteur est surtout connu pour son rôle dans la méthanogenèse, où il facilite les réactions thermodynamiquement difficiles. Comme la longueur de la queue de polyglutamate varie d’un organisme à l’autre, les analyses de profil de longueur pourraient être un outil puissant pour distinguer et caractériser différents groupes et voies dans divers habitats. Ici, le protocole décrit l’extraction et l’optimisation de la détection du cofacteur F420 en appliquant l’extraction en phase solide combinée à une analyse par chromatographie liquide à haute performance indépendante des approches culturelles ou biologiques moléculaires. La méthode a été appliquée pour obtenir des informations supplémentaires sur l’expression du cofacteur F420 à partir de communautés microbiennes dans les sols, les boues anaérobies et les cultures pures et a été évaluée par des expériences de pic. Ainsi, l’étude a réussi à générer différents profils de longueur de queue F420 pour les méthanogènes hydrogénotrophes et acétoclastiques dans des cultures pures méthanogènes contrôlées ainsi qu’à partir d’échantillons environnementaux tels que les boues et les sols de digesteurs anaérobies.

Des cultures pures de Methanosarcina thermophila et de Methanoculleus thermophilus, deux archées méthanogènes thermophiles, ont été cultivées dans des milieux appropriés comme décrit précédemment29,30. Pour Methanosarcina thermophila, le méthanol a été utilisé comme source d’énergie, tandis que Methanoculleus thermophilus a été cultivé sur H2/CO2. La croissance a été vérifi?...

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Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

Une méthode d’extraction du cofacteur F420 à partir de cultures pures a été optimisée pour la séparation chromatographique liquide et l’analyse de la longueur de la queue F420 dans des échantillons de culture pure et d’environnement.

Extraction du cofacteur F420 pour l’analyse de la longueur de la queue du polyglutamate à partir de cultures pures méthanogènes et d’échantillons environnementaux

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

Le cofacteur F420 joue un rôle important dans le métabolisme primaire et secondaire de nombreux procaryotes. La mesure de cette molécule dans des échantillons environnementaux permet de mieux comprendre sa prévalence et sa fonction. Cette technique permet l’analyse du cofacteur dans des matériaux d’échantillonnage difficiles tels que les boues et le sol.Ainsi, la lyse du matériau et la pré-purification avant l’analyse sont les étapes centrales. Le protocole comprend différentes étapes au cours de la préparation de l’échantillon. Ces étapes doivent être très bien planifiées et préparées avant de commencer le traitement de l’échantillon.Par exemple, la préparation de tampons frais est importante. Pour commencer la lyse de l’échantillon, placez cinq grammes de l’échantillon dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez ensuite cinq millilitres de tampon de lyse 2X aux échantillons et portez le volume à 10 millilitres avec de l’eau distillée pour atteindre une concentration finale de 0,5 gramme par millilitre.Vortex les échantillons dilués pendant 20 secondes suivis d’un autoclavage de 30 minutes à 121 degrés Celsius. Pour les échantillons secs comme le sol forestier, porter à un volume final de 20 millilitres avec de l’eau distillée après autoclavage, et vortex l’échantillon dilué à nouveau pendant 20 secondes comme démontré. Une fois les échantillons refroidis, centrifuger le lysat de l’échantillon pendant cinq minutes à 11 000 x g et prélever le surnageant.Préparez une extraction en phase solide de cinq millilitres ou une colonne SPE remplie de 100 milligrammes de sorbant polymère à mode mixte d’anions faibles conditionnant l’échangeur d’anions avec trois millilitres de méthanol. Ensuite, équilibrez l’échangeur d’anions avec trois millilitres d’eau distillée. Chargez jusqu’à neuf millilitres du surnageant du lysat centrifugé sur la colonne SPE.Lavez séquentiellement les impuretés de la colonne avec cinq millilitres d’acétate d’ammoniac de 25 millimolaires et cinq millilitres de méthanol. Après le lavage, éluez le cofacteur F420 avec un millilitre de tampon d’élution. Préréglez le four à 40 degrés Celsius et réglez le détecteur de fluorescence sur une longueur d’onde d’extinction de 420 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 470 nanomètres.Ensuite, filtrez l’échantillon élué du SPE dans des flacons HPLC à l’aide d’un filtre PTFE avec une taille de pores de 0,22 micron. Injectez 50 microlitres de l’échantillon filtré dans le système HPLC et séparez le cofacteur F420 en mode gradient à l’aide d’une combinaison de phases mobiles comme décrit dans le manuscrit. Analyser la composition et la concentration du cofacteur F420.La croissance de cultures pures de méthanogènes a été vérifiée par microscopie. En microscopie à contraste de phase, des agglomérats de méthanogènes sont visibles, qui émettent une lumière bleutée lorsque le cofacteur F420 est excité par la lumière ultraviolette. La zone de pointe du cofacteur F420 récupéré après SPE avec différents volumes de cultures de Methanoculleus thermophilus a été analysée.La stratégie de désintégration de l’autoclave a atteint la zone de crête la plus élevée, concluant une efficacité d’extraction maximale à l’aide d’un traitement pression-température. L’analyse de la distribution de la longueur de la queue a révélé les différences dans la concentration globale du cofacteur F420 et la distribution de la longueur de la queue F420 des cultures méthanogènes pures dans les échantillons environnementaux. Lors de l’application de cette procédure, veillez à collecter complètement le volume total du tampon d’élution ou à enregistrer le volume exact de débit.Cette technique ouvre la voie à l’exploration du cofacteur F420 dans des échantillons plus complexes comme les sols et les boues et permet d’mieux comprendre l’impact écologique de cette molécule.

Research

JoVE Journal

Environment

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

Méthode EPA 1615. Mesure de entérovirus et Norovirus présence dans l&#39;eau par Culture et RT-qPCR. I. Prélèvement des échantillons de virus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Recherche

Environnement

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L&#39;utilisation de Chironomidae (Diptera) Surface-Flottant nymphose exuvies comme un protocole Rapid Bioassessment des plans d&#39;eau

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Sélection de la taille Gel automatisé pour améliorer la qualité des bibliothèques de séquençage de prochaine génération Préparé à partir d&#39;échantillons d&#39;eau de l&#39;environnement

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