Name: extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00
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Wir danken Prof. Colin Jackson für die Unterstützung mit gereinigtem Cofaktor F420. Diese Forschung wurde vom Tiroler Wissenschaftsfonds (TWF) und der Universität Innsbruck (Publikationsfonds) unterstützt. Wir danken der Unterstützung von GPS, HK, SB, GG und HB sehr.

HINWEIS: Die Extraktion und Analyse von Cofaktor F420 ist ein dreistufiger Prozess, der Probenlyse, Cofaktor-Vorreinigung durch Festphasenextraktion (SPE) und Cofaktordetektion über Ionen-gepaarte RP-HPLC (IP-RP-HPLC) mit Fluoreszenzdetektion umfasst. Bereiten Sie vor Beginn die materialien und Reagenzien gemäß Tabelle 1 vor.
1. Probenlyse
<ol><li>Geben Sie bis zu 5 g Probe in geeignete Röhrchen (z. B. 50 ml konische Röhrchen).</li>
	<li>5 ml des Lysepuffers ...

<ol>
	<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+biochemistry,+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions.">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li><li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes.">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451 (2019).</li><li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+F420:+an+expanded+view+of+its+distribution,+biosynthesis,+and+roles+in+bacteria+and+archaea.">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium.">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria.">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li><li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420.">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments.">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li><li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane.">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li><li>Knittel, K., L&#246;sekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps.">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li><li>Lin, X. -. L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria.">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li><li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis:+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations.">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li><li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea,+in+particular+the+genus+Methanosarcina.">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li><li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis.">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li><li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri.">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species,+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea.">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li><li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis.">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li><li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species.">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li><li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -. S. T., Yurek, D. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase/reductase.">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li><li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+F(420)+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents.">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism.">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000 (2017).</li><li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -. T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes.">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), 11208-11211 (2018).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases.">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902 (2017).</li><li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria.">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li><li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei.">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li><li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed.">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), 139-145 (1994).</li><li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+coenzyme+F(420)+in+Mycobacterium+species.">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li><li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+(Spain).">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic/anoxic+conditions.">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155 (2019).</li><li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila.">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li><li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+acetate:+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments.">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation,+preservation,+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants.">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li><li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis.">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803 (2010).</li></ol>

Zur Beurteilung des Cofaktors F420 aus methanogenen Reinkulturen kann eine mikroskopische Auswertung durchgeführt werden, um das Wachstum und die Aktivität (Fluoreszenzmikroskopie) der beteiligten Mikroorganismen sichtbar zu machen (Abbildung 1). Für Proben aus natürlichen Umgebungen ist die Verwendung der Mikroskopie zum Nachweis oder zur Quantifizierung von F420 aufgrund von Interferenzen mit anderen fluoreszierenden Mikroorganismen, organischen und anorganischen ...

F420 ist ein weit verbreiteter, aber oft vernachlässigter Cofaktor, der als obligater Zwei-Elektronenhydrid-Träger in primären und sekundären Stoffwechselprozessen von Archaeen und Bakterien fungiert1,2. F420 ist ein 5-Deazaflavin und strukturell flavin ähnlich, wobei seine chemischen und biologischen Eigenschaften eher mit denen von NAD+ oder NADP+ vergleichbar sind. Aufgrund der Substitution von Stickstoff durch Kohlenstoff an Position 5 des Isoalloxazinrings ist es ein starkes Reduktionsmittel und weist somit ein geringes Standard-Redoxpotential von -340 mV1,3 auf. F420 besteht aus einem 5-Deazaflavin-Ring und einem 2-Phospho-L-Lactat-Linker (F420-0). Ein Oligoglutamatschwanz, der n+1 Glutamatmonomere enthält, kann an das Molekül (F420-n+1)4 gebunden sein.
Lange Zeit wurde der Cofaktor F420 ausschließlich mit Archaeen und Actinobakterien in Verbindung gebracht. Dies wurde weitgehend rückgängig gemacht. Jüngste Analysen ergaben, dass F420 auf verschiedene anaerobe und aerobe Organismen der Phyla Proteobakterien, Chloroflexi und möglicherweise Firmicutes verteilt ist, die eine Vielzahl von Lebensräumen wie Böden, Seen und den menschlichen Darm bewohnen1,5. Im Jahr 2019 zeigten Braga et al.6, dass das Proteobakterium Paraburkholderia rhizoxinica ein einzigartiges F420-Derivat produziert, das ein 3-Phosphoglycerat anstelle eines 2-Phospholactat-Schwanzes enthält, das in verschiedenen Lebensräumen weit verbreitet sein könnte. Innerhalb der Domäne Archaea wurde F420 in mehreren Linien gefunden, darunter methanogenic7, methanotrophic8,9 und sulfatreduzierende Ordnungen10, und soll in Thaumarchaeota11 hergestellt werden. F420 ist am besten als essentielles Redox-Coenzym in der hydrogenotrophen und methylotrophen Methanogenese bekannt. Die reduzierte Form von F420 (F420H2) fungiert als Elektronendonor zur Reduktion von Methylentetrahydromethanopterin (Methylen-H4MPT, Mer) und Methenyl-H4MPT12,13. Es kann auch als Elektronenträger in H2-unabhängigen Elektronentransportwegen von Methanogenen verwendet werden, die Cytochrome enthalten12,14. Darüber hinaus weist die oxidierte Form von F420 eine charakteristische blau-grüne Fluoreszenz bei Anregung bei 420 nm auf, die den mikroskopischen Nachweis von Methanogenen erleichtert (Abbildung 1). Aufgrund seines geringen Redoxpotentials erleichtert F420 (i) die exogene Reduktion eines breiten Spektrums von ansonsten widerspenstigen oder toxischen organischen Verbindungen, (ii) die Synthese von Tetracyclin- und Lincosamid-Antibiotika oder Phytotoxinen in Streptomyceten (Stamm-Actinobakterien) und (iii) die Resistenz gegen oxidativen oder nitrosativen Stress oder andere ungünstige Bedingungen in Mykobakterien (Stamm-Actinobakterien)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Folglich sind F420-abhängige Oxidoreduktasen vielversprechende Biokatalysatoren für industrielle und pharmazeutische Zwecke sowie für die Bioremediation kontaminierter Umgebungen1,23. Trotz dieser jüngsten Erkenntnisse sind die genauen Rollen des Cofaktors F420 bei Actinobakterien oder anderen Bakterienstämmen noch marginal bekannt.
Es gibt mindestens drei Wege für die F420-Biosynthese2,6,24. Zu Beginn wird der Biosyntheseweg in eine 5-Deazaflavin-Biosynthese und einen 2-Phospholactat-Stoffwechselzweig aufgeteilt. Der reaktive Teil des F420-Moleküls wird über FO-Synthase unter Verwendung der Substrate Tyrosin und 5-Amino-6-Ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion synthetisiert. Das Ergebnis ist das Riboflavin-Level-Chromophor FO. Innerhalb des derzeit akzeptierten Laktatstoffwechselzweigs wird L-Laktat durch eine L-Laktatkinase (CofB) zu 2-Phospho-L-Lactat phosphoryliert; 2-Phospho-L-lactat wiederum wird durch 2-Phospho-L-Lactat-Guanylyltransferase (CofC) zu L-Lactyl-2-diphospho-5'-guanosin guanyliert. Im nächsten Schritt wird L-Lactyl-2-diphospho-5'-guanosin durch eine 2-Phospho-L-Lactat-Transferase (CofD) mit FO zu F420-02 verknüpft. Schließlich ligat das Enzym F420-0:ɣ-Glutamylligase (CofE) Glutamatmonomere zu F420-0 und bildet den endgültigen Cofaktor6 in unterschiedlicher Anzahl23,25. Verschiedene Organismen zeigen unterschiedliche Muster in der Anzahl der angehängten Glutamatrückstände, wobei kürzere Schwänze für Methanogene gefunden wurden als in Mykobakterien2,25,26. Im Allgemeinen zeigen Methanogene Schwanzlängen von zwei bis drei, mit bis zu fünf im acetoklastischen Methanogen Methanosarcina sp., während die Schwanzlängen in Mycobacterium sp. zwischen fünf und sieben Glutamatresten lagen2,25,26,27. Neuere Erkenntnisse zeigten jedoch, dass langkettiges F420 an F420-abhängige Oxidoreduktasen mit einer höheren Affinität bindet als kurzkettiges F420; Darüber hinaus erhöht gebundenes langkettiges F420 die Substrataffinität, verringert aber die Fluktuationsrate der jeweiligen Enzyme23.
Der Nachweis des Cofaktors F420 basiert oft auf seiner Fluoreszenz. Dabei wurden seine Oligoglutamatderivate mittels Reversed-Phase (RP)-HPLC27,28 getrennt. Kürzlich verwendeten Ney et al. Tetrabutylammoniumhydroxid als Ionenpaarungsreagenz für den negativ geladenen Glutamatschwanz, um die Trennung auf RP-HLPC erfolgreich zu verbessern5. Hier stellen wir eine Methode zur Probenvorbereitung, anschließenden Lyse, Extraktion, Reinigung, Trennung und Quantifizierung des Cofaktors F420 nicht nur aus Reinkulturen, sondern auch aus verschiedenen Umweltproben (d.h. Böden und Faulschlamm) vor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>HPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge and rotor for 50 mL &#8220;Falcon&#8221; tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Column: Gemini NX C18, 5 &#956;m, 150 x 3 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE filter (pore size 0.22 &#181;m) to remove particulate matter prior HPLC analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin for SPE: Strata-X-AW 33 &#956;m as weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SPE equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples

Der Cofaktor F420 spielt als Hydridträger eine zentrale Rolle im Primär- und Sekundärstoffwechsel vieler bakterieller und archaealer Taxa. Der Cofaktor ist vor allem für seine Rolle in der Methanogenese bekannt, wo er thermodynamisch schwierige Reaktionen ermöglicht. Da der Polyglutamat-Schwanz zwischen verschiedenen Organismen in der Länge variiert, könnten Längenprofilanalysen ein leistungsfähiges Werkzeug zur Unterscheidung und Charakterisierung verschiedener Gruppen und Wege in verschiedenen Lebensräumen sein. Hier beschreibt das Protokoll die Extraktion und Optimierung der Cofaktor-F420-Detektion durch Anwendung der Festphasenextraktion in Kombination mit einer leistungsstarken Flüssigkeitschromatographie-Analyse unabhängig von kultur- oder molekularbiologischen Ansätzen. Die Methode wurde angewendet, um zusätzliche Informationen über die Expression des Cofaktors F420 aus mikrobiellen Gemeinschaften in Böden, anaeroben Schlämmen und Reinkulturen zu gewinnen und wurde durch Spiking-Experimente bewertet. Dabei gelang es der Studie, unterschiedliche F420-Schwanzlängenprofile für hydrogenotrophe und acetoklastische Methanogene in kontrollierten methanogenen Reinkulturen sowie aus Umweltproben wie anaeroben Fermenterschlamm und Böden zu generieren.

Reinkulturen von Methanosarcina thermophila und Methanoculleus thermophilus, beide thermophile methanogene Archaeen, wurden wie zuvor beschrieben in geeigneten Medien gezüchtet29,30. Für Methanosarcina thermophila wurde Methanol als Energiequelle verwendet, während Methanoculleus thermophilus auf H2/CO2 gezüchtet wurde. Das Wachstum wurde durch mikroskopische Auswertung überprüft, während d...

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Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

Eine Methode zur Extraktion des Cofaktors F420 aus Reinkulturen wurde für die flüssigkeitschromatographische Trennung und Analyse der F420-Schwanzlänge in Reinkultur- und Umweltproben optimiert.

Extraktion von Cofaktor F420 zur Analyse der Polyglutamat-Schwanzlänge aus methanogenen Reinkulturen und Umweltproben

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

Der Cofaktor F420 spielt eine wichtige Rolle im Primär- und Sekundärstoffwechsel vieler Prokaryoten. Die Messung dieses Moleküls in Umweltproben ermöglicht ein tieferes Verständnis seiner Prävalenz und Funktion. Diese Technik ermöglicht die Analyse des Cofaktors in schwierigen Probenmaterialien wie Schlamm und Boden.Dabei sind die Lyse des Materials und die Vorreinigung vor der Analyse die zentralen Schritte. Das Protokoll umfasst verschiedene Schritte während der Probenvorbereitung. Diese Schritte müssen sehr gut geplant und vorbereitet werden, bevor mit der Probenbearbeitung begonnen wird.Zum Beispiel ist die Vorbereitung von frischen Puffern wichtig. Um mit der Probenlyse zu beginnen, legen Sie fünf Gramm der Probe in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Dann fügen Sie fünf Milliliter 2X Lysepuffer zu den Proben hinzu und bringen Sie das Volumen mit destilliertem Wasser auf 10 Milliliter, um eine Endkonzentration von 0,5 Gramm pro Milliliter zu erreichen.Wirbeln Sie die verdünnten Proben für 20 Sekunden vor, gefolgt von einem Autoklavieren für 30 Minuten bei 121 Grad Celsius. Für trockene Proben wie Waldboden nach dem Autoklavier mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 20 Millilitern bringen und die verdünnte Probe wie gezeigt erneut für 20 Sekunden wirbeln. Sobald die Proben abgekühlt sind, zentrifugieren Sie das Probenlysat für fünf Minuten bei 11.000 x g und sammeln Sie den Überstand.Bereiten Sie eine Fünf-Milliliter-Festphasenextraktion oder SPE-Säule vor, die mit 100 Milligramm schwachem Anionen-Mixed-Mode-Polymersorbens gefüllt ist und den Anionenaustauscher mit drei Millilitern Methanol konditioniert. Dann den Anionenaustauscher mit drei Millilitern destilliertem Wasser ausgleichen. Laden Sie bis zu neun Milliliter des Überstandes aus dem zentrifugierten Lysat auf die SPE-Säule.Waschen Sie die Verunreinigungen nacheinander aus der Säule mit fünf Millilitern 25-Millimol-Ammoniakacetat und fünf Millilitern Methanol. Nach dem Waschen den Cofaktor F420 mit einem Milliliter Elutionspuffer eluieren. Stellen Sie den Ofen auf 40 Grad Celsius ein und stellen Sie den Fluoreszenzdetektor auf 420 Nanometer Extinktionswellenlänge und 470 Nanometer Emissionswellenlänge ein.Als nächstes filtern Sie die eluierte Probe aus der SPE in HPLC-Fläschchen mit einem PTFE-Filter mit einer Porengröße von 0,22 Mikrometern. Injizieren Sie 50 Mikroliter der gefilterten Probe in das HPLC-System und trennen Sie den Cofaktor F420 über den Gradientenmodus unter Verwendung einer Kombination mobiler Phasen, wie im Manuskript beschrieben. Analysieren Sie die Zusammensetzung und Konzentration des Cofaktors F420.Das Wachstum von Reinkulturen von Methanogenen wurde durch Mikroskopie nachgewiesen. In der Phasenkontrastmikroskopie sind Agglomerate von Methanogenen sichtbar, die ein bläuliches Licht emittieren, wenn der Cofaktor F420 mit ultraviolettem Licht angeregt wird. Die Peakfläche des zurückgewonnenen Cofaktors F420 nach SPE mit unterschiedlichen Volumina der Methanoculleus thermophilus Kulturen wurde analysiert.Die Autoklavierungsstrategie erreichte die höchste Spitzenfläche und schloss die maximale Extraktionseffizienz durch eine Druck-Temperatur-Behandlung ab. Die Analyse der Schwanzlängenverteilung ergab die Unterschiede in der Gesamtkonzentration des Cofaktors F420 und der Verteilung der F420-Schwanzlänge der reinen methanogenen Kulturen in Umweltproben. Achten Sie bei der Anwendung dieses Verfahrens darauf, das Gesamtvolumen des Elutionspuffers vollständig zu erfassen oder das genaue Volumen des Durchflusses aufzuzeichnen.Diese Technik ebnet den Weg für die Erforschung des Cofaktors F420 in komplexeren Proben wie Böden und Schlämmen und ermöglicht tiefere Einblicke in die ökologischen Auswirkungen dieses Moleküls.

Research

JoVE Journal

Environment

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser von Kultur und RT-qPCR. I. Sammlung von Virenproben

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Forschung

Umwelt

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Die Nutzung Chironomidae (Diptera) Oberflächenschwimm Pupal Exuviae als schnelle Bioassessment Protokoll für die Wasserkörper

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Physische Isolierung von Endospores aus Umweltproben durch gezielte Lyse von vegetativen Zellen

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

Eine einfache Methode für die automatisierte Festphasenextraktion von Wasserproben für die immunologische Analyse von kleinen Schadstoffe

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Herstellung und Prüfung von impedanzbasierten Fluidic Biochips mit RTgill-W1 Zellen für die schnelle Auswertung von Trinkwasserproben für Toxizität

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Extraktion und Analyse von Microbial Phospholipidfettsäuren in Böden

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Die Verwendung einer Filterpatrone für die Filtration von Wasserproben und Extraktion von Umwelt-DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

Eine Lipid-Extraktions- und Analysemethode zur Charakterisierung von Boden-Mikroben in Experimenten mit vielen Proben

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Extraktion von Organochlor-Pestiziden aus Kunststoff-Pellets und Kunststoff-Typ-Analyse

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...