Name: extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples at JoVE.com

אנו מודים להכרת תודה לפרופ' קולין ג'קסון על התמיכה ב-F420 המטוהר. מחקר זה נתמך על ידי קרן המדע טירולי (TWF) ואוניברסיטת Innsbruck (Publikationsfonds). אנו מכירים מאוד בתמיכתם של GPS, HK, SB, GG ו- HB.

הערה: מיצוי וניתוח של קופקטור F420 הוא תהליך בן שלושה שלבים כולל תמוגה לדוגמה, טיהור מראש קופקטור באמצעות מיצוי שלב מוצק (SPE), וזיהוי קופקטור באמצעות יון-מזווג-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) עם זיהוי פלואורסצנטיות. לפני תחילת, הכינו את החומרים והריגנטים כאמור בטבלה 1.
1. תמיסת דגימה...

<ol>
	<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+biochemistry,+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions.">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li><li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes.">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451 (2019).</li><li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+F420:+an+expanded+view+of+its+distribution,+biosynthesis,+and+roles+in+bacteria+and+archaea.">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium.">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria.">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li><li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420.">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments.">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li><li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane.">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li><li>Knittel, K., L&#246;sekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps.">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li><li>Lin, X. -. L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria.">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li><li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis:+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations.">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li><li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea,+in+particular+the+genus+Methanosarcina.">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li><li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis.">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li><li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri.">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species,+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea.">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li><li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis.">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li><li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species.">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li><li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -. S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+production,+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis.">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li><li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase/reductase.">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li><li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+F(420)+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents.">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism.">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000 (2017).</li><li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -. T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes.">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), 11208-11211 (2018).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases.">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902 (2017).</li><li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria.">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li><li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei.">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li><li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed.">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), 139-145 (1994).</li><li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+coenzyme+F(420)+in+Mycobacterium+species.">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li><li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+(Spain).">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic/anoxic+conditions.">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155 (2019).</li><li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila.">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li><li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+acetate:+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments.">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation,+preservation,+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants.">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li><li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis.">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803 (2010).</li></ol>

להערכת קופקטור F420 מתרביות טהורות מתנוגניות, ניתן לבצע הערכה מיקרוסקופית כדי לדמיין את הצמיחה והפעילות (מיקרוסקופיה פלואורסצנטית) של המיקרואורגניזמים המעורבים (איור 1). עבור דגימות הנובעות מסביבות טבעיות, השימוש במיקרוסקופיה כדי לזהות או לכמת F420 מוגבל עקב הפרע...

F420 הוא קופקטור נפוץ אך מוזנח לעתים קרובות, המתפקד כנשא הידריד דו-אלקטרוני מחייב בתהליכים מטבוליים ראשוניים ומשניים של ארכיאה וחיידק1,2. F420 הוא 5-דיזפלבין ודומה מבחינה מבנית flavins, לפי תכונותיו הכימיות והביולוגיות דומים יותר עם אלה של NAD + או NADP +. בשל החלפת חנקן עם פחמן במיקום 5 של טבעת isoalloxazine, הוא רדויטנט חזק, ובכך מציג פוטנציאל redox סטנדרטי נמוך של -340 mV1,3. F420 כולל טבעת 5-דיזפלבין ומקשר 2-phospho-L-לקטט (F420-0). זנב אוליגלוטאמט המכיל n+1 מונומרים גלוטמט יכול להיות מחובר למולקולה (F420-n +1)4.
במשך זמן רב, F420 קופקטור היה קשור אך ורק עם ארכאיה ו Actinobacteria. זה התהפך ברובו. ניתוחים אחרונים גילו כי F420 מופץ בין אורגניזמים אנאירוביים ואירוביים מגוונים של פילה פרוטאובקטריה, כלורופלקסי, וייתכן ש- Firmicutes המאכלסים מספר עצום של בתי גידול כמו קרקעות, אגמים, והמעיים האנושיים1,5. בשנת 2019, בראגה ואח'6, הראו כי פרוטאובקטריום Paraburkholderia rhizoxinica מייצר נגזרת F420 ייחודית, המכילה 3-פוספוגליצרט במקום זנב 2-פוספט, אשר עשוי להיות נפוץ בבתי גידול שונים. בתוך התחום Archaea, F420 נמצא במספר שושלות, כולל methanogenic7, מתאנוטרופיק8,9, והזמנות להפחתת גופרית10, והוא אמור להיות מיוצר Thaumarchaeota11. F420 ידוע בעיקר בשם קואנזים אדום חיוני במתנוגנזה מינוטרופית ומתילוטרופית. הצורה המופחתת של F420 (F420H2) מתפקדת כתורמת אלקטרונים להפחתת מתילנטרהידרומתנופטרין (מתילן-H4MPT, מר) ומתניל-H4MPT12,13. זה יכול לשמש גם כנשא אלקטרונים במסלולי הובלת אלקטרונים עצמאיים H2 של מתנוגנים המכילים ציטוכרום12,14. יתר על כן, הצורה החמצונית של F420 יש פלואורסצנטיות כחולה-ירוקה אופיינית עם עירור ב 420 ננומטר, אשר מאפשר זיהוי של מתנוגנים מיקרוסקופיים (איור 1). בשל פוטנציאל redox הנמוך שלה, F420 מאפשר (i) הפחתה אקסוגנית של ספקטרום רחב של תרכובות אורגניות סרבנות או רעילות אחרת, (ii) סינתזה של טטרציקלין ואנטיביוטיקה לינקוסמיד או פיטוטוקסינים בסטרפטומיאצטים (פילום אקטינובקטריה), ו -(iii) עמידות ללחץ חמצוני או ניטרוסטיבי או תנאים שליליים אחרים במיקובקטריה (פילום אקטינובקטריה)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. כתוצאה מכך, חמצון תלוי F420 הם biocatalysts מבטיחים למטרות תעשייתיות ותרופות, כמו גם עבור תיווך ביולוגי של סביבות מזוהמות1,23. למרות הממצאים האחרונים, התפקידים המדויקים של F420 קופקטור עדיין ידועים בשוליים Actinobacteria או פילה חיידקי אחר.
ישנם לפחות שלושה מסלולים לביוסינתזה F4202,6,24. בהתחלה, מסלול הביוסינתזה מחולק לביוסינתזה של 5-דיזפלבין וענף חילוף חומרים של 2-פוספולקטאט. החלק הריאקטיבי של מולקולת F420 מסונתז באמצעות FO-סינתאז באמצעות טירוזין המצע ו 5-אמינו-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedione. התוצאה היא רמת הריבופלבין כרומופור FO. בתוך ענף חילוף החומרים לקטט המקובל כיום, L-לקטט הוא זרחן 2-phospho-L-לקטט על ידי קינאז L-לקטט (CofB); 2-פוספו-L-לקטט, בתורו, הוא guanylated ל L-לקטיל-2-דיפוספו-5'-גואנוסין על ידי 2-פוספו-L-לקטט guanylyltransferase (CofC). בשלב הבא, L-לקטיל-2-דיפוספו-5'-גואנוסין מקושר ל- FO על ידי טרנספראז 2-phospho-L-לקטט (CofD) ליצירת F420-02. לבסוף, האנזים F420-0:ɣ-גלוטמיל ליגאז (CofE) ליגאטות גלוטמט מונומרים ל- F420-0, ויוצר את קופקטור הסופי6 במספרים משתנים23,25. אורגניזמים שונים מראים דפוסים שונים במספר שאריות גלוטמט מחוברות, עם זנבות קצרים יותר שנמצאו עבור מתנוגנים מאשר mycobacteria2,25,26. בדרך כלל, מתנוגנים מראים אורך זנב משניים עד שלושה, עם עד חמישה מתנוגן אצטוקלסטי, מתנוזרצ'ינה sp., בעוד אורכי הזנב שנמצאו Mycobacterium sp. נע בין חמישה לשבע שאריות גלוטמט2,25,26,27. עם זאת, הממצאים האחרונים הראו כי F420 ארוך שרשרת נקשר חמצון תלוי F420 עם זיקה גבוהה יותר מאשר F420 קצר שרשרת; יתר על כן, F420 קשור שרשרת ארוכה מגביר את הזיקה מצע אבל מקטין את שיעור המחזור של אנזימים בהתאמה23.
זיהוי של קופקטור F420 מבוסס לעתים קרובות על הפלואורסצנטיות שלו. ובכך, נגזרי הגלוטמט אוליגו שלה הופרדו באמצעות שלב הפוך (RP)-HPLC27,28. לאחרונה, Ney ואח ' השתמש tetrabutylammonium הידרוקסיד כמו ריאגנט זיווג יונים עבור זנב גלוטמט טעון שלילי כדי לשפר את ההפרדה על RP-HLPC בהצלחה5. כאן, אנו מציגים שיטה להכנת דגימות, תמוגה לאחר מכן, מיצוי, טיהור, הפרדה וכימות של קופקטור F420 לא רק מתרבויות טהורות אלא גם מדגימות סביבתיות שונות (כלומר, קרקעות בוצה מעכל).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>HPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge and rotor for 50 mL &#8220;Falcon&#8221; tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Column: Gemini NX C18, 5 &#956;m, 150 x 3 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE filter (pore size 0.22 &#181;m) to remove particulate matter prior HPLC analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin for SPE: Strata-X-AW 33 &#956;m as weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SPE equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples

ה- F420 של קופקטור ממלא תפקיד מרכזי כנשא הידריד בחילוף החומרים העיקרי והמשני של מסה חיידקית וארכאלית רבים. קופקטור ידוע בעיקר בשל תפקידו במתנוגנזה, שם הוא מקל על תגובות קשות תרמודינמית. כמו הזנב polyglutamate משתנה באורך בין אורגניזמים שונים, ניתוחי פרופיל אורך עשוי להיות כלי רב עוצמה להבחנה ואפיון קבוצות שונות מסלולים בבתי גידול שונים. כאן, הפרוטוקול מתאר את החילוץ והאופטימיזציה של זיהוי F420 קופקטור על ידי החלת מיצוי שלב מוצק בשילוב עם ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים ללא תלות בגישות ביולוגיות תרבותיות או מולקולריות. השיטה יושמה כדי לקבל מידע נוסף על הביטוי של קופקטור F420 מקהילות מיקרוביות בקרקעות, בוצה אנאירובית, ותרבויות טהורות, והוערכה על ידי ניסויים spiking. ובכך, המחקר הצליח לייצר פרופילים שונים באורך הזנב F420 עבור מתנוגנים מימנוטרופיים ואצטוקלסטיים בתרבויות טהורות מתנוגניות מבוקרות, כמו גם מדגימות סביבתיות כגון בוצה מעכל אנאירובי ואדמה.

תרבויות טהורות של מתנוזרצ'ינה תרמופילה ומתנוקולאוס תרמופילוס, שתיהן ארכאה מתנוגניות תרמופיליות, גדלו בתקשורת המתאימה כפי שתואר קודם לכן 29,30. עבור מתנוצרצ'ינה תרמופילה, מתנול שימש כמקור אנרגיה, ואילו Methanoculleus תרמופילוס גדל על H2...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples at JoVE.com

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

שיטה להפקת קופקטור F420 מתרבויות טהורות הייתה מותאמת להפרדה וניתוח כרומטוגרפי נוזלי של אורך הזנב F420 בתרבות טהורה ודגימות סביבתיות.

הפקת קופקטור F420 לניתוח אורך זנב פוליגלוטאמט מתרבויות טהורות מתנוגניות ודגימות סביבתיות

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

F420 קופקטור ממלא תפקיד חשוב בחילוף החומרים העיקרי והמשני של פרוקריוטים רבים. מדידת מולקולה זו בדגימות סביבתיות מאפשרת הבנה עמוקה יותר של שכיחותה ותפקודה. טכניקה זו מאפשרת ניתוח של קופקטור בחומרי מדגם קשים כגון בוצה ואדמה.ובכך התמוגה של החומר וטיהור מראש לפני הניתוח הם הצעדים המרכזיים. הפרוטוקול כולל שלבים שונים במהלך הכנת המדגם. שלבים אלה חייבים להיות מתוכננים ומוכנים היטב לפני שמתחילים בעיבוד לדוגמה.לדוגמה, הכנת מאגרים טריים חשובה. כדי להתחיל את תמיסת המדגם, למקם חמישה גרם של המדגם בצינור חרוט 50 מיליליטר. לאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של 2X חיץ תמה לדגימות, ולהביא את הנפח ל 10 מיליליטר עם מים מזוקקים כדי להגיע לריכוז הסופי של 0.5 גרם למיליליטר.מערבולת הדגימות המדוללות במשך 20 שניות ואחריהן פירוק אוטומטי במשך 30 דקות ב-121 מעלות צלזיוס. עבור דגימות יבשות כמו אדמת יער, להביא לנפח סופי של 20 מיליליטר עם מים מזוקקים לאחר autoclaving, ואת מערבולת המדגם המדולל שוב במשך 20 שניות כפי שהוכח. ברגע שהדגימות מתקררות, צנטריפוגות הדגימה ליסאט במשך חמש דקות ב 11, 000 x g, ולאסוף את supernatant.הכן מיצוי שלב מוצק חמישה מיליליטר או עמוד SPE מלא 100 מיליגרם של אניון חלש במצב מעורב סורבט סורבט במצב מעורב מיזוג מחליף אניון עם שלושה מיליליטר של מתנול. לאחר מכן, ישיחל את מחליף האניון עם שלושה מיליליטר של מים מזוקקים. העמיסו עד תשעה מיליליטרים של הסופר-טבעי מהליסאט הצנטריפוגות אל עמוד ה-SPE.לשטוף ברצף את זיהומים מן הטור עם חמישה מיליליטר של אצטט אמוניה 25 מילימולר וחמישה מיליליטר של מתנול. לאחר הכביסה, לחמוק F420 קופקטור עם מיליליטר אחד של חוצץ elution. קבעו מראש את התנור ל-40 מעלות צלזיוס, והגדירו את גלאי הפלואורסצנטיות לאורך גל של 420 ננומטר ואורך גל פליטה של 470 ננומטר.לאחר מכן, סנן את הדגימה הנבהלת מה- SPE לבקבוקונים של HPLC באמצעות מסנן PTFE בגודל נקבובית של 0.22 מיקרון. הזרק 50 מיקרוליטרים של המדגם המסונן למערכת HPLC, והפרד את ה-F420 של קופקטור באמצעות מצב הדרגתי באמצעות שילוב של שלבים ניידים כמתואר בכתב היד. לנתח את קומפוזיציה F420 קופקטור וריכוז.הצמיחה של תרביות טהורות של מתנוגנים אומתה על ידי מיקרוסקופיה. במיקרוסקופיה של ניגוד פאזה, ניתן לראות אגלומרטים של מתנוגנים, הפולטים אור כחלחל כאשר קופקטור F420 מתרגש מאור אולטרה סגול. אזור השיא של קופקטור התאושש F420 לאחר SPE עם כרכים שונים של תרמופילוס Methanoculleus נותח.אסטרטגיית התפוררות האוטו-שעבוד השיגה את אזור השיא הגבוה ביותר, והגיעו ליעילות מיצוי מרבית באמצעות טיפול בטמפרטורת לחץ. ניתוח התפלגות אורך הזנב חשף את ההבדלים בריכוז הכולל של קופקטור F420 ואת התפלגות אורך הזנב F420 של תרביות מתנוגניות טהורות בדגימות סביבתיות. בעת החלת הליך זה, שים לב לאסוף לחלוטין את הנפח הכולל של מאגר ההתחמקות או להקליט את הנפח המדויק של זרימה דרך.טכניקה זו סוללת את הדרך לחקר קופקטור F420 בדגימות מורכבות יותר כמו קרקעות בוצה ומאפשרת תובנות עמוקות יותר על ההשפעה האקולוגית של מולקולה זו.

Research

JoVE Journal

Environment

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. I. איסוף דגימות וירוסים

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

שימוש בChironomidae (כפולי כנף) גלמי Exuviae כמהיר Bioassessment פרוטוקול לגופי מים צפים-שטח

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

בחירת גודל האוטומטי ג&#39;ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

בידוד פיזי של Endospores מדגימות סביבתיות על ידי תמוגה ממוקדת של תאים גטטיבי

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

שיטה פשוטה למיצוי שלב המוצק האוטומטי של דגימות מים לניתוח החיסוני של מזהמים קטנים

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

הכנה ובדיקה של עכבה מבוססי biochips fluidic עם תאים RTgill-W1 טוב ההערכה המהירה של שתייה דגימות מים עבור רעילות

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

הפקה וניתוח של פוספוליפידים מיקרוביאלית חומצות שומן בקרקעות

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

שימוש במחסנית סינון עבור הסינון של מי דוגמאות הפקת DNA הסביבה

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

ליפיד הפקת וניתוח שיטה לאפיון קרקע חיידקים בניסויים עם דוגמאות רבות

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

הפקת חומרי הדברה אורגנוכלורינים מפלסטיק וגלגול סוג פלסטיק

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...