Name: extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples at JoVE.com

हम कृतज्ञतापूर्वक शुद्ध cofactor F420 के साथ समर्थन के लिए प्रोफेसर कॉलिन जैक्सन को धन्यवाद देते हैं। इस शोध को Tyrolean Science Fund (TWF) और Universität Innsbruck (Publikationsfonds) द्वारा समर्थित किया गया था। हम जीपीएस, एचके, एसबी, जीजी और एचबी के समर्थन को बहुत स्वीकार करते हैं।

नोट: निष्कर्षण और cofactor F420 का विश्लेषण नमूना lysis, ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) के माध्यम से cofactor पूर्व शुद्धिकरण सहित एक तीन कदम की प्रक्रिया है, और प्रतिदीप्ति का पता लगाने के साथ आयन-युग्मित-RP-HPLC (आईपी-आरपी-HPLC) ?...

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	<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+biochemistry,+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions.">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li><li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes.">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451 (2019).</li><li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+F420:+an+expanded+view+of+its+distribution,+biosynthesis,+and+roles+in+bacteria+and+archaea.">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium.">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria.">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li><li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420.">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments.">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li><li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane.">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li><li>Knittel, K., L&#246;sekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps.">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li><li>Lin, X. -. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri.">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species,+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea.">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li><li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis.">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li><li>McCormick, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase/reductase.">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li><li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+F(420)+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents.">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism.">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000 (2017).</li><li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -. T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes.">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), 11208-11211 (2018).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases.">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902 (2017).</li><li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria.">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li><li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei.">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li><li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed.">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), 139-145 (1994).</li><li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+coenzyme+F(420)+in+Mycobacterium+species.">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li><li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+(Spain).">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic/anoxic+conditions.">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155 (2019).</li><li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila.">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li><li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+acetate:+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments.">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation,+preservation,+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants.">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li><li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. 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मेथेनोजेनिक शुद्ध संस्कृतियों से कोफ़ैक्टर F420 के मूल्यांकन के लिए, शामिल सूक्ष्मजीवों के विकास और गतिविधि (प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी) की कल्पना करने के लिए एक सूक्ष्म मूल्यांकन किया जा सकता है (<st...

F420 एक व्यापक लेकिन अक्सर उपेक्षित cofactor है, जो Archaea और Bacteria1,2 दोनों की प्राथमिक और माध्यमिक चयापचय प्रक्रियाओं में एक बाध्य दो-इलेक्ट्रॉन हाइड्राइड वाहक के रूप में कार्य करता है। F420 एक 5-deazaflavin है और संरचनात्मक रूप से flavins के समान है, जिससे इसके रासायनिक और जैविक गुण NAD + या NADP + के उन लोगों के साथ अधिक तुलनीय हैं। isoalloxazine अंगूठी की स्थिति 5 पर कार्बन के साथ नाइट्रोजन के प्रतिस्थापन के कारण, यह एक मजबूत रिडक्टेंट है, इस प्रकार -340 mV1,3 की कम मानक रेडॉक्स क्षमता का प्रदर्शन करता है। F420 में एक 5-deazaflavin अंगूठी और एक 2-फॉस्फो-एल-लैक्टेट लिंकर (F420-0) शामिल है। एन + 1 ग्लूटामेट मोनोमर्स युक्त एक ओलिगोग्लूटामेट पूंछ को अणु (F420-n + 1)4 से जोड़ा जा सकता है।
एक लंबे समय के लिए, cofactor F420 पूरी तरह से Archaea और Actinobacteria के साथ जुड़ा हुआ है। इसे काफी हद तक पलट दिया गया है। हाल के विश्लेषणों से पता चला है कि F420 को फाइला प्रोटिओबैक्टीरिया, क्लोरोफ्लेक्सी के विविध अवायवीय और एरोबिक जीवों के बीच वितरित किया जाता है, और संभावित रूप से फर्मिक्यूट्स मिट्टी, झीलों और मानव आंत 1,5 जैसे असंख्य आवासों में रहते हैं। 2019 में, Braga et al.6, से पता चला है कि proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica एक अद्वितीय F420 व्युत्पन्न का उत्पादन करता है, जिसमें 2-फॉस्फोलेक्टेट पूंछ के बजाय 3-फॉस्फोग्लिसरेट होता है, जो विभिन्न आवासों में व्यापक हो सकता है। डोमेन Archaea के भीतर, F420 कई वंशों में पाया गया है, जिसमें मेथेनोजेनिक 7, मेथानोट्रोफिक 8, 9, और सल्फेट-कम करने वाले ऑर्डर 10 शामिल हैं, और इसे थाउमरचायोटा 11 में उत्पादित किया जाना चाहिए। F420 को हाइड्रोजनोट्रॉफिक और मेथिलोट्रोफिक मेथेनोजेनेसिस में एक आवश्यक रेडॉक्स कोएंजाइम के रूप में जाना जाता है। F420 (F420H2) का कम रूप मेथिलीनटेट्राहाइड्रोमेथेनोप्टेरिन (मेथिलीन-H4MPT, Mer) और मेथेनिल-H4MPT12,13 की कमी के लिए एक इलेक्ट्रॉन दाता के रूप में कार्य करता है। इसका उपयोग साइटोक्रोम 12,14 युक्त मेथेनोजेन के एच 2-स्वतंत्र इलेक्ट्रॉन परिवहन मार्गों में एक इलेक्ट्रॉन वाहक के रूप में भी किया जा सकता है। इसके अलावा, F420 के ऑक्सीकरण रूप में 420 एनएम पर उत्तेजना पर एक विशेषता नीले-हरे रंग की प्रतिदीप्ति होती है, जो माइक्रोस्कोपिक रूप से मेथेनोजेन का पता लगाने की सुविधा प्रदान करती है (चित्रा 1)। इसकी कम रेडॉक्स क्षमता के कारण, F420 सुविधा प्रदान करता है (i) अन्यथा अड़ियल या विषाक्त कार्बनिक यौगिकों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम की बहिर्जात कमी, (ii) टेट्रासाइक्लिन और लिनकोसामाइड एंटीबायोटिक दवाओं या स्ट्रेप्टोमाइसेट्स (फाइलम एक्टिनोबैक्टीरिया) में फाइटोटॉक्सिन का संश्लेषण, और (iii) ऑक्सीडेटिव या नाइट्रोसेटिव तनाव या माइकोबैक्टीरिया में अन्य प्रतिकूल स्थितियों के लिए प्रतिरोध (फाइलम एक्टिनोबैक्टीरिया)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. नतीजतन, F420-निर्भर oxidoreductases औद्योगिक और दवा उद्देश्यों के साथ-साथ दूषित वातावरण के बायोरेमेडिएशन के लिए बायोकैटालिस्ट का वादा कर रहे हैं1,23। इन हाल के निष्कर्षों के बावजूद, cofactor F420 की सटीक भूमिकाअभी भी एक्टिनोबैक्टीरिया या अन्य जीवाणु फाइला में मामूली रूप से ज्ञात है।
F420 जैवसंश्लेषण 2,6,24 के लिए कम से कम तीन रास्ते हैं। शुरुआत में, जैवसंश्लेषण मार्ग को 5-deazaflavin जैवसंश्लेषण और 2-फॉस्फोलेक्टेट चयापचय शाखा में विभाजित किया जाता है। F420 अणु के प्रतिक्रियाशील भाग को FO-synthase के माध्यम से संश्लेषित किया जाता है, जो सब्सट्रेट्स टायरोसिन और 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedione का उपयोग करता है। परिणाम राइबोफ्लेविन स्तर क्रोमोफोर एफओ है। वर्तमान में स्वीकृत लैक्टेट चयापचय शाखा के भीतर, एल-लैक्टेट को एल-लैक्टेट किनेज (कोएफबी) द्वारा 2-फॉस्फो-फॉस्फो-एल-लैक्टेट के लिए फॉस्फोराइलेटेड किया जाता है; 2-फॉस्फो-एल-लैक्टेट, बदले में, 2-फॉस्फो-एल-लैक्टेट गुआनिलट्रांसफरेज़ (सीओएफसी) द्वारा एल-लैक्टिल-2-डिफॉस्फो-5'-गुआनोसिन के लिए गुआनिलेटेड है। अगले चरण में, L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine को FO से 2-फॉस्फो-L-lactate transferase (CofD) द्वारा F420-02 बनाने के लिए जोड़ा गया है। अंत में, एंजाइम F420-0: π-glutamyl ligase (CofE) ग्लूटामेट मोनोमर्स को F420-0 पर लिगेट करता है, जो अलग-अलग संख्याओं में अंतिम cofactor6 बनाता है23,25। विभिन्न जीव संलग्न ग्लूटामेट अवशेषों की संख्या में अलग-अलग पैटर्न दिखाते हैं, जिसमें माइकोबैक्टीरिया 2,25,26 की तुलना में मेथेनोजेन के लिए छोटी पूंछ पाई जाती है। आम तौर पर, मेथेनोजेन दो से तीन तक पूंछ की लंबाई दिखाते हैं, जिसमें एसिटोक्लास्टिक मेथेनोजेन, मेथानोसारसिना एसपी में पांच तक होते हैं, जबकि माइकोबैक्टीरियम एसपी में पाई जाने वाली पूंछ की लंबाई पांच से सात ग्लूटामेट अवशेष2,25,26,27 तक होती है। हालांकि, हाल के निष्कर्षों से पता चला है कि लंबी श्रृंखला F420 शॉर्ट-चेन F420 की तुलना में उच्च आत्मीयता के साथ F420-निर्भर ऑक्सीडोरेडक्टेस को बांधती है; इसके अलावा, बाध्य लंबी श्रृंखला F420 सब्सट्रेट आत्मीयता बढ़ जाती है लेकिन संबंधित एंजाइमों की टर्नओवर दर कम हो जाती है23.
Cofactor F420 का पता लगाना अक्सर इसकी प्रतिदीप्ति पर आधारित होता है। इस प्रकार, इसके ओलिगो ग्लूटामेट डेरिवेट्स को उलट-चरण (आरपी) -एचपीएलसी 27,28 का उपयोग करके अलग किया गया था। हाल ही में, नेय एट अल ने आरपी-एचएलपीसी पर अलगाव को बढ़ाने के लिए नकारात्मक रूप से चार्ज ग्लूटामेट पूंछ के लिए आयन-युग्मन अभिकर्मक के रूप में टेट्राब्यूटिलामोनियम हाइड्रॉक्साइड का उपयोग सफलतापूर्वक किया। यहां, हम नमूनों की तैयारी के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं, बाद में लाइसिस, निष्कर्षण, शुद्धिकरण, अलगाव, और कोफ़ैक्टर F420 का परिमाणीकरण न केवल शुद्ध संस्कृतियों से बल्कि विभिन्न पर्यावरणीय नमूनों (यानी, मिट्टी और डाइजेस्टर कीचड़) से भी।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>HPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge and rotor for 50 mL &#8220;Falcon&#8221; tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Column: Gemini NX C18, 5 &#956;m, 150 x 3 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE filter (pore size 0.22 &#181;m) to remove particulate matter prior HPLC analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin for SPE: Strata-X-AW 33 &#956;m as weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SPE equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples

Cofactor F420 कई जीवाणु और archaeal taxa के प्राथमिक और माध्यमिक चयापचय में एक हाइड्राइड वाहक के रूप में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। कोफ़ैक्टर को मेथेनोजेनेसिस में अपनी भूमिका के लिए जाना जाता है, जहां यह थर्मोडायनामिक रूप से कठिन प्रतिक्रियाओं की सुविधा प्रदान करता है। चूंकि पॉलीग्लूटामेट पूंछ विभिन्न जीवों के बीच लंबाई में भिन्न होती है, लंबाई प्रोफ़ाइल विश्लेषण विभिन्न आवासों में विभिन्न समूहों और मार्गों को अलग करने और विशेषता के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है। यहां, प्रोटोकॉल सांस्कृतिक या आणविक जैविक दृष्टिकोणों से स्वतंत्र उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण के साथ संयुक्त ठोस-चरण निष्कर्षण को लागू करके कोफ़ैक्टर F420 का पता लगाने के निष्कर्षण और अनुकूलन का वर्णन करता है। इस विधि को मिट्टी, अवायवीय कीचड़ और शुद्ध संस्कृतियों में माइक्रोबियल समुदायों से कोफ़ैक्टर F420 की अभिव्यक्ति पर अतिरिक्त जानकारी प्राप्त करने के लिए लागू किया गया था और स्पाइकिंग प्रयोगों द्वारा मूल्यांकन किया गया था। इस प्रकार, अध्ययन नियंत्रित मेथेनोजेनिक शुद्ध संस्कृतियों में हाइड्रोजनोट्रोफिक और एसिटोक्लास्टिक मेथेनोजेन के साथ-साथ एनारोबिक डाइजेस्टर कीचड़ और मिट्टी जैसे पर्यावरणीय नमूनों से हाइड्रोजनोट्रोफिक और एसिटोक्लास्टिक मेथेनोजेन के लिए विभिन्न एफ 420 पूंछ-लंबाई प्रोफाइल उत्पन्न करने में सफल रहा।

Methanosarcina thermophila और Methanoculleus thermophilus की शुद्ध संस्कृतियों, दोनों thermophilic methanogenic Archaea, उपयुक्त मीडिया में उगाया गया था जैसा कि पहले वर्णित किया गया था29,30। Methanosarcina thermophila के लिए, मेथनॉल का उपयोग...

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Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

शुद्ध संस्कृतियों से cofactor F420 के निष्कर्षण के लिए एक विधि तरल क्रोमैटोग्राफिक अलगाव और शुद्ध संस्कृति और पर्यावरण यी नमूनों में F420 पूंछ लंबाई के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया था।

Methanogenic शुद्ध संस्कृतियों और पर्यावरण के नमूनों से Polyglutamate पूंछ लंबाई के विश्लेषण के लिए Cofactor F420 का निष्कर्षण

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

Cofactor F420 कई प्रोकैरियोट्स के प्राथमिक और माध्यमिक चयापचय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। पर्यावरणीय नमूनों में इस अणु को मापने से इसकी व्यापकता और कार्य की गहरी समझ में सक्षम बनाता है। यह तकनीक कीचड़ और मिट्टी जैसे कठिन नमूना सामग्री में कोफ़ैक्टर के विश्लेषण को सक्षम बनाती है।इस प्रकार विश्लेषण से पहले सामग्री का लाइसिस और पूर्व-शुद्धिकरण केंद्रीय कदम हैं। प्रोटोकॉल नमूना तैयारी के दौरान विभिन्न चरणों में शामिल है। इन चरणों की योजना बनाई जानी चाहिए और नमूना प्रसंस्करण के साथ शुरू करने से पहले बहुत अच्छी तरह से तैयार किया जाना चाहिए।उदाहरण के लिए, ताजा बफ़र्स की तैयारी महत्वपूर्ण है। नमूना लाइसिस शुरू करने के लिए, एक 50-मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पांच ग्राम नमूने को रखें। फिर नमूनों में 2X लाइसिस बफर के पांच मिलीलीटर जोड़ें, और 0.5 ग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए आसुत पानी के साथ 10 मिलीलीटर तक मात्रा लाएं।20 सेकंड के लिए पतला नमूनों भंवर 121 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए autoclaving द्वारा पीछा किया. वन मिट्टी जैसे सूखे नमूनों के लिए, ऑटोक्लेविंग के बाद आसुत पानी के साथ 20 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में लाएं, और 20 सेकंड के लिए पतला नमूना फिर से भंवर करें जैसा कि प्रदर्शित किया गया है। एक बार जब नमूने ठंडा हो जाते हैं, तो नमूना लिसेट को 11, 000 x g पर पांच मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, और supernatant एकत्र करें।एक पांच-मिलीलीटर ठोस-चरण निष्कर्षण या एसपीई कॉलम तैयार करें जो 100 मिलीग्राम कमजोर अनियन मिश्रित-मोड पॉलीमेरिक सॉर्बेंट कंडीशनिंग से भरा हुआ है, जो मेथनॉल के तीन मिलीलीटर के साथ अनियन एक्सचेंजर को कंडीशनिंग करता है। फिर, आसुत पानी के तीन मिलीलीटर के साथ अनियन एक्सचेंजर को संतुलित करें। एसपीई कॉलम पर सेंट्रीफ्यूज्ड लिसेट से supernatant के नौ milliliters तक लोड करें।क्रमिक रूप से 25-मिलीमोलर अमोनिया एसीटेट के पांच मिलीलीटर और मेथनॉल के पांच मिलीलीटर के साथ स्तंभ से अशुद्धियों को धोएं। धोने के बाद, क्षालन बफर के एक मिलीलीटर के साथ cofactor F420 elute. ओवन को 40 डिग्री सेल्सियस पर प्रीसेट करें, और प्रतिदीप्ति डिटेक्टर को 420 नैनोमीटर विलुप्त होने वाली तरंग दैर्ध्य और 470 नैनोमीटर उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर सेट करें।इसके बाद, 0.22 माइक्रोन के छिद्र आकार के साथ एक PTFE फ़िल्टर का उपयोग करके HPLC शीशियों में एसपीई से eluted नमूना फ़िल्टर करें। HPLC प्रणाली में फ़िल्टर किए गए नमूने के 50 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें, और पांडुलिपि में वर्णित मोबाइल चरणों के संयोजन का उपयोग करके ग्रेडिएंट मोड के माध्यम से अलग-अलग cofactor F420। Cofactor F420 संरचना और एकाग्रता का विश्लेषण करें।मेथेनोजेन की शुद्ध संस्कृतियों के विकास को माइक्रोस्कोपी द्वारा सत्यापित किया गया था। चरण के विपरीत माइक्रोस्कोपी में, मेथेनोजेन के agglomerates दिखाई देते हैं, जो एक नीले प्रकाश का उत्सर्जन करते हैं जब cofactor F420 पराबैंगनी प्रकाश के साथ उत्साहित होता है। Methanoculleus thermophilus संस्कृतियों के विभिन्न संस्करणों के साथ एसपीई के बाद बरामद cofactor F420 के चरम क्षेत्र का विश्लेषण किया गया था।ऑटोक्लेविंग विघटन रणनीति ने उच्चतम शिखर क्षेत्र हासिल किया, एक दबाव-तापमान उपचार का उपयोग करके अधिकतम निष्कर्षण दक्षता का समापन किया। पूंछ लंबाई वितरण के विश्लेषण से cofactor F420 की समग्र एकाग्रता और पर्यावरणीय नमूनों में शुद्ध मेथेनोजेनिक संस्कृतियों की F420 पूंछ लंबाई के वितरण में अंतर का पता चला। इस प्रक्रिया को लागू करते समय, क्षालन बफर की कुल मात्रा को पूरी तरह से एकत्र करने या प्रवाह-थ्रू की सटीक मात्रा रिकॉर्ड करने के लिए जागरूक रहें।यह तकनीक मिट्टी और कीचड़ जैसे अधिक जटिल नमूनों में कोफ़ैक्टर F420 की खोज के लिए मार्ग प्रशस्त करती है और इस अणु के पारिस्थितिक प्रभाव में गहरी अंतर्दृष्टि को सक्षम बनाती है।

Research

JoVE Journal

Environment

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

Enterovirus और संस्कृति और आर टी-qPCR के द्वारा जल में Norovirus घटना के लिए EPA विधि 1615. मापन। वायरस के नमूने की आई संग्रह

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Chironomidae (Diptera) का प्रयोग भूतल अस्थायी जल निकायों के लिए एक तेजी Bioassessment प्रोटोकॉल के रूप में पोटा संबंधी Exuviae

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

स्वचालित जेल आकार चयन पर्यावरण पानी के नमूनों से तैयार अगली पीढ़ी के अनुक्रमण पुस्तकालय की गुणवत्ता में सुधार

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

वनस्पति कोशिकाओं के लक्षित lysis द्वारा पर्यावरण के नमूनों से endospores के भौतिक अलगाव

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

छोटे प्रदूषण की रोग प्रतिरक्षण विश्लेषण के लिए पानी के नमूनों की स्वचालित ठोस चरण निष्कर्षण के लिए एक सरल विधि

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

तैयारी और का परीक्षण मुक़ाबला आधारित विषाक्तता के लिए पीने के पानी के नमूने लिए रैपिड मूल्यांकन RTgill-W1 कोशिकाओं के साथ Fluidic biochips

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

निष्कर्षण और मिट्टी में माइक्रोबियल Phospholipid फैटी एसिड का विश्लेषण

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

पानी के नमूने निस्पंदन और पर्यावरण डीएनए की निकासी के लिए एक फिल्टर कारतूस का प्रयोग करें

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

कई नमूनों के साथ प्रयोगों में मृदा की सूक्ष्मजीवों को वर्णित करने के लिए एक लिपिड निष्कर्षण और विश्लेषण विधि

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

प्लास्टिक छर्रों और प्लास्टिक प्रकार विश्लेषण से ऑगानोक्लोरीन कीटनाशकों का निकास

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...