Name: extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples at JoVE.com

Vi takker takknemlig prof. Colin Jackson for støtten med renset medfaktor F420. Denne forskningen ble støttet av Tyrolsk vitenskapsfond (TWF) og Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Vi anerkjenner i stor grad støtten fra GPS, HK, SB, GG og HB.

MERK: Ekstraksjon og analyse av cofactor F420 er en tre-trinns prosess, inkludert prøvelys, kofaktorforrensing via fastfaseutvinning (SPE), og kofaktordeteksjon via ionparert-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) med fluorescensdeteksjon. Før oppstart må materialer og reagenser klargjøres som angitt i tabell 1.
1. Prøve lysis
<ol><li>Tilsett opptil 5 g prøve på passende rør (f.eks. 50 ml koniske rør).</li>
	<li>Tilsett 5 ml lysisbuffer (2x lagerløsning, tabell 1<...

<ol>
	<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+biochemistry,+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions.">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li><li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes.">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451 (2019).</li><li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+F420:+an+expanded+view+of+its+distribution,+biosynthesis,+and+roles+in+bacteria+and+archaea.">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium.">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria.">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li><li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420.">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments.">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li><li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane.">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li><li>Knittel, K., L&#246;sekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps.">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li><li>Lin, X. -. L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria.">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li><li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis:+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations.">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li><li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea,+in+particular+the+genus+Methanosarcina.">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li><li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis.">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li><li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri.">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species,+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea.">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li><li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis.">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li><li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species.">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li><li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -. S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+production,+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis.">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li><li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase/reductase.">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li><li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+F(420)+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents.">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism.">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000 (2017).</li><li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -. T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes.">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), 11208-11211 (2018).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases.">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902 (2017).</li><li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria.">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li><li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei.">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li><li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed.">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), 139-145 (1994).</li><li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+coenzyme+F(420)+in+Mycobacterium+species.">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li><li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+(Spain).">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic/anoxic+conditions.">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155 (2019).</li><li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila.">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li><li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+acetate:+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments.">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation,+preservation,+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants.">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li><li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis.">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803 (2010).</li></ol>

For evaluering av cofactor F420 fra metanogene rene kulturer kan det utføres en mikroskopisk evaluering for å visualisere veksten og aktiviteten (fluorescensmikroskopi) av de involverte mikroorganismer (figur 1). For prøver som stammer fra naturlige miljøer, er bruken av mikroskopi for å oppdage eller kvantifisere F420 begrenset på grunn av forstyrrelser med andre fluorescerende mikroorganismer, organiske og uorganiske partikler. I denne sammenhengen kan utvinning...

F420 er en utbredt, men ofte forsømt kofaktor, som fungerer som en obligatorisk to-elektronhydridbærer i primære og sekundære metabolske prosesser av både Arkaea og Bakterier1,2. F420 er en 5-deazaflavin og strukturelt lik flavins, hvorved dens kjemiske og biologiske egenskaper er mer sammenlignbare med de av NAD + eller NADP +. På grunn av substitusjon av nitrogen med karbon i posisjon 5 av isoalloksazinen, er det et sterkt reduktant, og viser dermed et lavt standard redokspotensial på -340 mV1,3. F420 består av en 5-deazaflavin ring og en 2-fosfo-L-laktat linker (F420-0). En oligoglutamathale som inneholder n +1 glutamatmonomerer kan festes til molekylet (F420-n+1)4.
I lang tid har cofactor F420 vært utelukkende forbundet med Archaea og Actinobacteria. Dette har i stor grad blitt veltet. Nyere analyser viste at F420 er fordelt på forskjellige anaerobe og aerobe organismer av phyla Proteobacteria, Chloroflexi, og potensielt Firmicutes som bor i et utall habitater som jord, innsjøer og den menneskelige tarmen1,5. I 2019 viste Braga et al.6 at proteobakterien Paraburkholderia rhizoxinica produserer et unikt F420-derivat, som inneholder et 3-fosfoglyserat i stedet for en 2-phospholactate hale, som kan være utbredt i ulike habitater. Innenfor domenet Archaea har F420 blitt funnet i flere avstamninger, inkludert methanogenic7, methanotrophic8,9, og sulfatreduserende ordrer10, og skal produseres i Thaumarchaeota11. F420 er best kjent som et essensielt redoks koenzym i hydrogenotrofisk og metytrofisk metanogenese. Den reduserte formen for F420 (F420H2) fungerer som elektrondonor for reduksjon av metylentrahydromethanopterin (metylen-H4MPT, Mer) og methenyl-H4MPT12,13. Den kan også brukes som elektronbærer i H2-uavhengige elektrontransportveier av metanogener som inneholder cytokromer12,14. Videre har den oksiderte formen av F420 en karakteristisk blågrønn fluorescens ved eksitasjon ved 420 nm, noe som letter påvisning av metanogener mikroskopisk (figur 1). På grunn av sitt lave redokspotensial letter F420 (i) den eksogene reduksjonen av et bredt spekter av ellers tilbakevendende eller giftige organiske forbindelser, (ii) syntese av tetracyklin og lincosamid antibiotika eller fytotoksiner i streptomycetes (phylum Actinobacteria), og (iii) resistens mot oksidativt eller nitrosativt stress eller andre ugunstige forhold i mykobakterier (phylum Actinobacteria)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Følgelig er F420-avhengige oksidoreductaser lovende biokakalysatorer for industrielle og farmasøytiske formål, samt for bioremediering av forurensede miljøer1,23. Til tross for disse nylige funnene er de eksakte rollene til kofaktoren F420 fortsatt marginalt kjent i Actinobacteria eller annen bakteriell phyla.
Det er minst tre veier for F420 biosyntese2,6,24. I begynnelsen er biosyntesebanen delt inn i en 5-deazaflavin biosyntese og en 2-phospholactate metabolisme gren. Den reaktive delen av F420-molekylet syntetiseres via FO-syntase ved hjelp av substratene tyrosin og 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidindione. Resultatet er riboflavin nivå kromofor FO. Innenfor den nåværende aksepterte laktatmetabolismegrenen er L-laktat fosforylert til 2-fosfo-L-laktat av en L-laktatkinase (CofB); 2-fosfo-L-laktat, i sin tur, er guanylated til L-laktyl-2-difosfo-5'-guanosin med 2-fosfo-L-laktat guanylyltransferase (CofC). I neste trinn er L-laktyl-2-difosfo-5'-guanosin knyttet til FO med en 2-fosfo-L-laktat transferase (CofD) for å danne F420-02. Til slutt ligater enzymet F420-0:ɣ-glutamyl ligase (CofE) glutamatmonomerer til F420-0, og danner den endelige cofactor6 i varierende tall23,25. Ulike organismer viser forskjellige mønstre i antall vedlagte glutamatrester, med kortere haler funnet for metanogener enn i mykobakterier2,25,26. Generelt viser metanogener hale lengder fra to til tre, med opptil fem i acetoklastisk methanogen, Methanosarcina sp., mens hale lengder funnet i Mycobacterium sp. varierte fra fem til syv glutamatrester2,25,26,27. Nyere funn viste imidlertid at langkjedet F420 binder seg til F420-avhengige oksidoreductaser med høyere affinitet enn kortkjedet F420; Videre øker bundet langkjedet F420 substrataffiniteten, men reduserer omsetningshastigheten til respektive enzymer23.
Påvisning av cofactor F420 er ofte basert på fluorescens. Dermed ble dens oligo glutamatavledninger skilt ved hjelp av omvendt fase (RP)-HPLC27,28. Nylig brukte Ney et al. tetrabutylammoniumhydroksid som et ionparerende reagens for den negativt ladede glutamathalen for å forbedre separasjonen på RP-HLPC vellykket5. Her presenterer vi en metode for fremstilling av prøver, etterfølgende lysis, ekstraksjon, rensing, separasjon og kvantifisering av cofactor F420, ikke bare fra rene kulturer, men også fra forskjellige miljøprøver (dvs. jord og fordøyelsesslam).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>HPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge and rotor for 50 mL &#8220;Falcon&#8221; tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Column: Gemini NX C18, 5 &#956;m, 150 x 3 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE filter (pore size 0.22 &#181;m) to remove particulate matter prior HPLC analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin for SPE: Strata-X-AW 33 &#956;m as weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SPE equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples

Cofactor F420 spiller en sentral rolle som hydridbærer i den primære og sekundære metabolismen av mange bakterielle og arkaeale taxa. Kofaktoren er mest kjent for sin rolle i metanogenese, hvor det letter termodynamisk vanskelige reaksjoner. Ettersom den polyglutamat hale varierer i lengde mellom ulike organismer, lengde profil analyser kan være et kraftig verktøy for å skille og karakterisere ulike grupper og veier i ulike habitater. Her beskriver protokollen utvinning og optimalisering av kofaktor F420-deteksjon ved å bruke fastfaseutvinning kombinert med høyytelses væskekromatografianalyse uavhengig av kulturelle eller molekylære biologiske tilnærminger. Metoden ble brukt for å få ytterligere informasjon om uttrykket av cofactor F420 fra mikrobielle samfunn i jord, anaerob slam og rene kulturer og ble evaluert ved spiking eksperimenter. Dermed lyktes studien i å generere forskjellige F420 halelengdeprofiler for hydrogenotrofiske og acetoklastiske metanogener i kontrollerte metanogene rene kulturer, så vel som fra miljøprøver som anaerob fordøyelsesslam og jord.

Rene kulturer av Methanosarcina thermophila og Methanoculleus thermophilus, begge termofile methanogene Arkaea, ble dyrket i egnede medier som beskrevet tidligere29,30. For Methanosarcina thermophila ble metanol brukt som energikilde, mens Methanoculleus thermophilus ble dyrket på H2/CO2. Veksten ble kontrollert ved mikroskopisk evaluering, mens aktiviteten ble undersøkt via måling av metan (<s...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples at JoVE.com

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

En metode for utvinning av kofaktor F420 fra rene kulturer ble optimalisert for flytende kromatografisk separasjon og analyse av F420 hale lengde i ren kultur og miljøprøver.

Utvinning av cofactor F420 for analyse av polyglutamat hale lengde fra methanogenic rene kulturer og miljøprøver

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

Cofactor F420 spiller en viktig rolle i den primære og sekundære metabolismen av mange prokaryoter. Måling av dette molekylet i miljøprøver muliggjør en dypere forståelse av utbredelsen og funksjonen. Denne teknikken gjør det mulig å analysere kofaktoren i vanskelige prøvematerialer som slam og jord.Dermed er lysis av materialet og forrensing før analyse de sentrale trinnene. Protokollen inneholder forskjellige trinn under prøveforberedelsene. Disse trinnene må planlegges og utarbeides veldig bra før du starter med prøvebehandlingen.For eksempel er forberedelsen av friske buffere viktig. For å starte prøvelyset, plasser fem gram av prøven i et 50 milliliter konisk rør. Tilsett deretter fem milliliter 2X lysisbuffer til prøvene, og ta volumet til 10 milliliter med destillert vann for å nå en endelig konsentrasjon på 0,5 gram per milliliter.Vortex de fortynnede prøvene i 20 sekunder etterfulgt av autoklavering i 30 minutter ved 121 grader Celsius. For tørre prøver som skogsjord, ta med til et siste volum på 20 milliliter med destillert vann etter autoklavering, og virvel den fortynnede prøven igjen i 20 sekunder som demonstrert. Når prøvene er avkjølt, sentrifugerer du prøvelyset i fem minutter ved 11 000 x g og samler supernatanten.Forbered en fem milliliter solidfaseutvinning eller SPE-kolonne fylt med 100 milligram svak anion blandet modus polymer sorbent kondisjonering av anionveksleren med tre milliliter metanol. Deretter likevekter anionveksleren med tre milliliter destillert vann. Last opp til ni milliliter av supernatanten fra sentrifugert lysat på SPE-kolonnen.Vask urenheter sekvensielt fra kolonnen med fem milliliter 25 millimolar ammoniakkacetat og fem milliliter metanol. Etter vask, elute cofactor F420 med en milliliter elution buffer. Forhåndsinnstill ovnen til 40 grader Celsius, og sett fluorescensdetektoren til 420 nanometer utryddelsesbølgelengde og 470 nanometer utslipp bølgelengde.Deretter filtrerer du den eluterte prøven fra SPE til HPLC-hetteglass ved hjelp av et PTFE-filter med en porestørrelse på 0,22 mikron. Injiser 50 mikroliter av den filtrerte prøven i HPLC-systemet, og skill kofaktor F420 via graderingsmodus ved hjelp av en kombinasjon av mobile faser som beskrevet i manuskriptet. Analyser kofaktor F420-sammensetningen og konsentrasjonen.Veksten av rene kulturer av metanogener ble verifisert ved mikroskopi. I fasekontrastmikroskopi er agglomerater av metanogener synlige, noe som avgir et blått lys når cofactor F420 er spent med ultrafiolett lys. Toppområdet for gjenvunnet cofactor F420 etter SPE med forskjellige volumer av Methanoculleus thermophilus kulturer ble analysert.Autoklaverings-oppløsningsstrategien oppnådde det høyeste toppområdet, og konkluderte med maksimal utvinningseffektivitet ved hjelp av en trykktemperaturbehandling. Analyse av halelengdefordelingen avslørte forskjellene i den totale konsentrasjonen av kofaktor F420 og fordelingen av F420 halelengde av de rene methanogene kulturene i miljøprøver. Når du bruker denne prosedyren, må du være oppmerksom på å samle inn totalt volum av elutionbufferen helt eller registrere det nøyaktige volumet av gjennomstrømning.Denne teknikken baner vei for utforskning av cofactor F420 i mer komplekse prøver som jord og slam og muliggjør dypere innsikt i den økologiske effekten av dette molekylet.

Research

JoVE Journal

Environment

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615. Måling av Enterovirus og Norovirus Forekomst i Water av Kultur- og RT-qPCR. I. Innsamling av virusprøver

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Bruk av Chironomidae (Diptera) Surface-Floa pupal Exuviae som Rapid Bioassessment protokoll for vannforekomster

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Automatisert Gel Størrelse Selection å forbedre kvaliteten på Neste-generasjons Sekvense Biblioteker Forberedt fra miljø vannprøver

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Fysisk Isolering av endospores fra miljøprøver ved Målrettet Lysis av vegetative celler

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

En enkel metode for Automated fastfaseekstraksjon av vannprøver for Immunologisk Analyse av Små forurensninger

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Utarbeidelse og testing av Impedans baserte fluidic biochips med RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluering av drikkevann Prøver for Toxicity

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Utvinning og analyse av Microbial fosfolipid fettsyrer i jordsmonn

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Bruk av en filterpatron for filtrering av vannprøver og Utvinning av Miljø DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

En lipidekstraksjons- og analysemetode for karakterisering av jordmikrober i eksperimenter med mange prøver

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Ekstraksjon av organisk klorpesticider fra plastpellets og plasttypeanalyse

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...