Name: extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00
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Agradecemos ao Prof. Colin Jackson pelo apoio com o cofactor F420 purificado. Esta pesquisa foi apoiada pelo Tyrolean Science Fund (TWF) e pela Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Reconhecemos muito o suporte de GPS, HK, SB, GG e HB.

NOTA: A extração e análise do cofato F420 é um processo de três etapas, incluindo lise amostral, pré-purificação de cofato por extração em fase sólida (SPE) e detecção de cofatores através de RP-HPLC (IP-RP-HPLC) com detecção de fluorescência. Antes de iniciar, prepare os materiais e reagentes conforme indicado na Tabela 1.
1. Lise amostral
<ol><li>Adicione até 5 g de amostra aos tubos apropriados (por exemplo, tubos cônicos de 50 mL).</li>
	<li...

<ol>
	<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+biochemistry,+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions.">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li><li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes.">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451 (2019).</li><li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+F420:+an+expanded+view+of+its+distribution,+biosynthesis,+and+roles+in+bacteria+and+archaea.">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium.">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria.">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li><li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420.">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments.">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li><li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane.">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li><li>Knittel, K., L&#246;sekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps.">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li><li>Lin, X. -. L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria.">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li><li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis:+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations.">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li><li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea,+in+particular+the+genus+Methanosarcina.">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li><li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis.">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li><li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri.">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species,+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea.">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li><li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis.">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li><li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species.">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li><li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -. S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+production,+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis.">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li><li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase/reductase.">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li><li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+F(420)+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents.">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism.">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000 (2017).</li><li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -. T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes.">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), 11208-11211 (2018).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases.">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902 (2017).</li><li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria.">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li><li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei.">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li><li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed.">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), 139-145 (1994).</li><li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+coenzyme+F(420)+in+Mycobacterium+species.">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li><li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+(Spain).">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic/anoxic+conditions.">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155 (2019).</li><li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila.">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li><li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+acetate:+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments.">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation,+preservation,+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants.">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li><li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis.">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803 (2010).</li></ol>

Para a avaliação do cofator F420 a partir de culturas puras metogênicas, pode-se realizar uma avaliação microscópica para visualizar o crescimento e a atividade (microscopia de fluorescência) dos microrganismos envolvidos (Figura 1). Para amostras derivadas de ambientes naturais, o uso de microscopia para detectar ou quantificar f420 é limitado devido a interferências com outros microrganismos fluorescentes, partículas orgânicas e inorgânicas. Neste contexto...

F420 é um cofator generalizado, mas muitas vezes negligenciado, que funciona como um portador obrigatório de hidreto de dois elétrons em processos metabólicos primários e secundários tanto da Archaea quanto das Bactérias1,2. F420 é um 5-deazaflavin e estruturalmente semelhante aos flavins, pelo qual suas propriedades químicas e biológicas são mais comparáveis com as de NAD+ ou NADP+. Devido à substituição de nitrogênio por carbono na posição 5 do anel isoalloxazine, é um forte redutivo, apresentando assim um baixo potencial de redox padrão de -340 mV1,3. F420 compreende um anel 5-deazaflavin e um linker 2-fospho-L-lactato (F420-0). Uma cauda oligoglutamate contendo monômeros de glutamato n+1 pode ser anexada à molécula (F420-n+1)4.
Por muito tempo, o cofator F420 tem sido associado exclusivamente com Archaea e Actinobacteria. Isso foi em grande parte anulado. Análises recentes revelaram que o F420 está distribuído entre diversos organismos anaeróbicos e aeróbicos da filo Proteobacteria, Cloroflexi, e potencialmente firmicutes que habitam uma miríade de habitats como solos, lagos e intestino humano1,5. Em 2019, Braga et al.6, mostraram que o proteobacterium Paraburkholderia rizoxinica produz um derivado F420 único, contendo um 3-fosfoglicerate em vez de uma cauda de 2 fosfolactato, que pode ser difundida em vários habitats. Dentro do domínio Archaea, f420 foi encontrado em várias linhagenias, incluindo methanogenic7, methanotrófico8,9, e ordens redutoras de sulfato10, e deve ser produzido em Thaumarchaeota11. F420 é mais conhecido como uma coenzima redox essencial em methanogênese metilotrófica e metilotrófica. A forma reduzida de F420 (F420H2) funciona como um doador de elétrons para a redução de metilenotetrahidromedromedetina (metileno-H4MPT, Mer) e mehenyl-H4MPT12,13. Também pode ser usado como um porta-elétrons em vias de transporte de elétrons independentes de H2 de methanogênios contendo citocromes12,14. Além disso, a forma oxidada de F420 tem uma fluorescência azul-esverdeada característica após a excitação a 420 nm, o que facilita a detecção de methanogênios microscopicamente (Figura 1). Devido ao seu baixo potencial de redox, f420 facilita (i) a redução exógena de um amplo espectro de compostos orgânicos recalcitrantes ou tóxicos, (ii) síntese de antibióticos tetracítricos e lincosamidas ou fitotoxinas em estreptomices (filo Actinobacteria), e (iii) resistência ao estresse oxidativo ou nitrosativo ou outras condições desfavoráveis em micobactérias (filo Actinobacteria)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Consequentemente, os oxidoreductases dependentes de F420 são biocatalysts promissores para fins industriais e farmacêuticos, bem como para a bioremediação de ambientes contaminados1,23. Apesar dessas descobertas recentes, os papéis exatos do cofator F420 ainda são marginalmente conhecidos em Actinobacteria ou outras bactérias.
Há pelo menos três caminhos para a biosíntese F4202,6,24. No início, a via da biossíntese é dividida em uma biosíntese de 5 deazaflavinas e um ramo metabolismo de 2 fosfolactato. A parte reativa da molécula F420 é sintetizada via FO-synthase usando os substratos tyrosine e 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinadiona. O resultado é o nível de riboflavina cromohore FO. Dentro do ramo de metabolismo de lactato atualmente aceito, o L-lactato é fosfoilado a 2-phospho-L-lactato por um L-lactato kinase (CofB); 2-phospho-L-lactato, por sua vez, é guanylated para L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine por 2-phospho-L-lactate guanylyltransferase (CofC). No próximo passo, L-lactil-2-diphospho-5'-guanosine é ligado à FO por um 2-phospho-L-lactato transferase (CofD) para formar F420-02. Finalmente, a enzima F420-0:ɣ-glutamyl liga os monômeros glutamato para F420-0, formando o cofator final6 em números variados23,25. Diferentes organismos apresentam padrões diferentes no número de resíduos de glutamato anexados, com caudas mais curtas encontradas para methanogênios do que em micobactérias2,25,26. Geralmente, os metanogens mostram comprimentos de cauda de dois a três, com até cinco no metanogena actolástico, methanosarcina sp., enquanto os comprimentos da cauda encontrados em Mycobacterium sp. variaram de cinco a sete resíduos de glutamato2,25,26,27. No entanto, descobertas recentes mostraram que a F420 de cadeia longa se liga a oxidoreductases dependentes da F420 com uma afinidade maior do que a F420 de cadeia curta; além disso, o F420 de cadeia longa ligado aumenta a afinidade do substrato, mas diminui a taxa de rotatividade das respectivas enzimas23.
A detecção do cofato F420 é frequentemente baseada em sua fluorescência. Assim, seus derivados de glutamato oligo foram separados por meio de fase inversa (RP)-HPLC27,28. Recentemente, Ney et al. usaram hidróxido de tetrabutylammonium como um reagente de emparelhamento de íons para a cauda de glutamato carregada negativamente para melhorar a separação em RP-HLPC com sucesso5. Aqui, apresentamos um método para a preparação de amostras, posteriormente, extração, purificação, separação e quantificação do cofato F420 não apenas de culturas puras, mas também de diferentes amostras ambientais (ou seja, solos e lodo digestor).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>HPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge and rotor for 50 mL &#8220;Falcon&#8221; tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Column: Gemini NX C18, 5 &#956;m, 150 x 3 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE filter (pore size 0.22 &#181;m) to remove particulate matter prior HPLC analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin for SPE: Strata-X-AW 33 &#956;m as weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SPE equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples

O cofator F420 desempenha um papel central como portador de hidreto no metabolismo primário e secundário de muitas taxas bacterianas e arqueais. O cofator é mais conhecido por seu papel na methanogênese, onde facilita reações termodinamicamente difíceis. Como a cauda de poliglutamate varia de comprimento entre diferentes organismos, as análises de perfil de comprimento podem ser uma ferramenta poderosa para distinguir e caracterizar diferentes grupos e caminhos em vários habitats. Aqui, o protocolo descreve a extração e otimização da detecção do cofato F420 aplicando extração em fase sólida combinada com análise de cromatografia líquida de alto desempenho independente de abordagens biológicas culturais ou moleculares. O método foi aplicado para obter informações adicionais sobre a expressão do cofator F420 de comunidades microbianas em solos, lodo anaeróbico e culturas puras e foi avaliado por experimentos de espiadura. Assim, o estudo conseguiu gerar diferentes perfis de comprimento da cauda F420 para methanogênios hidroeotróficos e acetoclásticos em culturas puras metogênicas controladas, bem como de amostras ambientais, como lodo digestor anaeróbico e solos.

Culturas puras de termófila de metanosarcina e termofílico de Metanoculleus, ambos termofílicos methanogênicos Archaea, foram cultivadas em mídia adequada, como descrito anteriormente29,30. Para a termófila de metanoosacina, o metanol foi usado como fonte de energia, enquanto o termofílico de Metanoculleus foi cultivado em H2/CO2. O crescimento foi verificado pela avaliação microscópica,...

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Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

Um método para a extração do cofato F420 de culturas puras foi otimizado para a separação e análise cromatográfica líquida do comprimento da cauda F420 em cultura pura e amostras ambientais.

Extração do Cofactor F420 para Análise do Comprimento da Cauda poliglutama de culturas puras e amostras ambientais

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

O cofator F420 desempenha um papel importante no metabolismo primário e secundário de muitos procariotes. Medir essa molécula em amostras ambientais permite uma compreensão mais profunda de sua prevalência e função. Esta técnica permite a análise do cofator em materiais amostrais difíceis, como lodo e solo.Assim, a lise do material e a pré-purificação antes da análise são as etapas centrais. O protocolo inclui diferentes etapas durante a preparação da amostra. Essas etapas devem ser planejadas e preparadas muito bem antes de iniciar o processamento da amostra.Por exemplo, a preparação de tampões frescos é importante. Para começar a lise amostral, coloque cinco gramas da amostra em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione cinco mililitros de tampão de lyse 2X às amostras, e leve o volume a 10 mililitros com água destilada para atingir uma concentração final de 0,5 gramas por mililitro.Vórtice as amostras diluídas por 20 segundos seguidos de autoclaving por 30 minutos a 121 graus Celsius. Para amostras secas como solo florestal, traga para um volume final de 20 mililitros com água destilada após autoclavação, e vórtice a amostra diluída novamente por 20 segundos, como demonstrado. Uma vez que as amostras esfriem, centrifute a amostra lysate por cinco minutos a 11.000 x g, e colete o supernante.Prepare uma extração de cinco mililitros de fase sólida ou coluna SPE preenchida com 100 miligramas de ânion misto de ânion misto sorbent condicionando o trocador de ânion com três mililitros de metanol. Em seguida, equilibre o trocador de ânion com três mililitros de água destilada. Carregue até nove mililitros do supernacido do lysate centrifusado na coluna SPE.Lavar sequencialmente as impurezas da coluna com cinco mililitros de acetato de amônia de 25 mililitros e cinco mililitros de metanol. Após a lavagem, elute o cofactor F420 com um mililitro de tampão de eluição. Predefinir o forno a 40 graus Celsius, e definir o detector de fluorescência para 420 nanômetros de comprimento de onda de extinção e 470 nanômetros de comprimento de onda de emissão.Em seguida, filtre a amostra elucida da SPE em frascos HPLC usando um filtro PTFE com um tamanho de poro de 0,22 míclico. Injete 50 microliters da amostra filtrada no sistema HPLC e separe o cofator F420 através do modo gradiente usando uma combinação de fases móveis como descrito no manuscrito. Analise a composição e concentração do cofato F420.O crescimento de culturas puras de methanogênios foi verificado por microscopia. Em microscopia de contraste de fase, aglomerações de antanogênicos são visíveis, que emitem uma luz azulada quando o cofator F420 é animado com luz ultravioleta. A área de pico do cofato recuperado F420 após a SPE com diferentes volumes das culturas termofílicos de Methanoculleus foi analisada.A estratégia de desintegração autoclavante alcançou a área de pico mais alta, concluindo a máxima eficiência de extração usando um tratamento de pressão-temperatura. A análise da distribuição do comprimento da cauda revelou as diferenças na concentração global do cofator F420 e na distribuição do comprimento da cauda F420 das culturas puras de metogenia em amostras ambientais. Ao aplicar este procedimento, esteja ciente de coletar completamente o volume total do buffer de eluição ou registrar o volume exato de fluxo..Esta técnica abre caminho para a exploração do cofato F420 em amostras mais complexas, como solos e lodo e permite insights mais profundos sobre o impacto ecológico desta molécula.

Research

JoVE Journal

Environment

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água pela cultura e RT-qPCR. I. Recolha de amostras de vírus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Ambiente

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Uso de Chironomidae (Diptera) Pupal Exuviae como um Bioavaliação Protocolo Rápido para massas de água de superfície flutuante

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Automated Gel seleção de tamanho para melhorar a qualidade das bibliotecas de sequenciação de próxima geração Preparado a partir de amostras de água do ambiente

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

O isolamento físico do Endospores de amostras ambientais por alvejado Lise de células vegetativas

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

Um método simples para a extração automatizada de fase sólida das amostras de água para análise imunológica de Pequenas Poluentes

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Preparação e Teste de impedância baseado em Biochips fluídicas com células RTgill-W1 para avaliação rápida das amostras de água para a toxicidade

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Extração e Análise de Microbial Phospholipid Fatty Acids em solos

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

O uso de um cartucho de filtro para Amostras de filtração de água e extração de DNA Ambiental

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

Um método de extração e análise de lipídios para caracterizar micróbios de solo em experimentos com muitas amostras

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Extração de Pesticidas Organoclorados de Pelotização de Plástico e Análise de Tipo de Plástico

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...