Name: extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples at JoVE.com

Мы с благодарностью благодарим профессора Колина Джексона за поддержку очищенного кофактора F420. Это исследование было поддержано Тирольским научным фондом (TWF) и Университетом Инсбрука (Publikationsfonds). Мы высоко ценим поддержку GPS, HK, SB, GG и HB.

ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция и анализ кофактора F420 представляет собой трехэтапный процесс, включающий лизис образца, предварительную очистку кофактора с помощью твердофазной экстракции (SPE) и обнаружение кофакторов с помощью ионно-парного RP-ВЭЖХ (IP-RP-HPLC) с флуоресцентным обнаружением. ...

<ol>
	<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+biochemistry,+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions.">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li><li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes.">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451 (2019).</li><li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+F420:+an+expanded+view+of+its+distribution,+biosynthesis,+and+roles+in+bacteria+and+archaea.">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium.">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria.">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li><li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420.">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments.">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li><li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane.">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li><li>Knittel, K., L&#246;sekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps.">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li><li>Lin, X. -. L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria.">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li><li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis:+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations.">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li><li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea,+in+particular+the+genus+Methanosarcina.">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li><li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis.">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li><li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri.">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species,+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea.">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li><li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis.">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li><li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species.">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li><li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -. S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+production,+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis.">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li><li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase/reductase.">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li><li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+F(420)+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents.">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism.">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000 (2017).</li><li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -. T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes.">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), 11208-11211 (2018).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases.">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902 (2017).</li><li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria.">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li><li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei.">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li><li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed.">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), 139-145 (1994).</li><li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+coenzyme+F(420)+in+Mycobacterium+species.">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li><li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+(Spain).">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic/anoxic+conditions.">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155 (2019).</li><li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila.">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li><li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+acetate:+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments.">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation,+preservation,+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants.">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li><li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis.">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803 (2010).</li></ol>

Для оценки кофактора F420 из метаногенных чистых культур может быть выполнена микроскопическая оценка для визуализации роста и активности (флуоресцентная микроскопия) вовлеченных микроорганизмов (фиг.1). Для образцов, полученных из природной среды, использование м...

F420 является широко распространенным, но часто игнорируемым кофактором, который функционирует как облигатный двухэлектронный гидридный носитель в первичных и вторичных метаболических процессах как архей, так и бактерий1,2. F420 представляет собой 5-деазафлавин и структурно похож на флавины, благодаря чему его химические и биологические свойства более сопоставимы с свойствами NAD+ или NADP+. Благодаря замещению азота углеродом в положении 5 изоаллоксазинового кольца, он является сильным восстановителем, проявляя при этом низкий стандартный окислительно-восстановительный потенциал -340 мВ1,3. F420 содержит 5-деазафлавиновое кольцо и 2-фосфо-L-лактатный линкер (F420-0). Хвост олигоглутамата, содержащий мономеры глутамата n+1, может быть присоединен к молекуле (F420-n+1)4.
Долгое время кофактор F420 был связан исключительно с археями и актинобактериями. Это в значительной степени было отменено. Недавние анализы показали, что F420 распределен среди различных анаэробных и аэробных организмов типа Протеобактерий, Хлорофлекси и потенциально Фирмикутов, населяющих мириады мест обитания, таких как почвы, озера и кишечник человека1,5. В 2019 году Braga et al.6 показали, что протеобактерия Paraburkholderia rhizoxinica производит уникальное производное F420, содержащее 3-фосфоглицерат вместо 2-фосфолактатного хвоста, который может быть широко распространен в различных местах обитания. В пределах домена Archaea, F420 был обнаружен в нескольких линиях, включая метаногенный7, метанотрофический8,9 и сульфатредуцирующий порядки10, и предполагается, что он производится в Thaumarchaeota11. F420 наиболее известен как незаменимый окислительно-восстановительный коэнзим в гидрогенотрофном и метилотрофном метаногенезе. Восстановленная форма F420 (F420H2) функционирует как донор электронов для восстановления метилентетрагидрометаноптерина (метилен-H4MPT, Mer) и метенил-H4MPT12,13. Он также может быть использован в качестве носителя электронов в H2-независимых путях переноса электронов метаногенов, содержащих цитохромы12,14. Более того, окисленная форма F420 обладает характерной сине-зеленой флуоресценцией при возбуждении при 420 нм, что облегчает обнаружение метаногенов микроскопически (рис. 1). Благодаря низкому окислительно-восстановительному потенциалу F420 способствует (i) экзогенному восстановлению широкого спектра непокорных или токсичных органических соединений, (ii) синтезу тетрациклиновых и линкозамидных антибиотиков или фитотоксинов в стрептомицетах (тип актинобактерий) и (iii) устойчивости к окислительному или нитрозативному стрессу или другим неблагоприятным условиям у микобактерий (тип Актинобактерий)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Следовательно, F420-зависимые оксидоредуктазы являются перспективными биокатализаторами для промышленных и фармацевтических целей, а также для биоремедиации загрязненных сред1,23. Несмотря на эти недавние результаты, точные роли кофактора F420 все еще незначительно известны в актинобактериях или других бактериальных типах.
Существует, по крайней мере, три пути биосинтеза F4202,6,24. Вначале путь биосинтеза расщепляется на 5-деазафлавиновый биосинтез и 2-фосфолактатную ветвь метаболизма. Реакционноспособную часть молекулы F420 синтезируют через FO-синтазу с использованием субстратов тирозина и 5-амино-6-рибитиламино-2,4(1H, 3H)-пиримидиндиона. Результатом является уровень рибофлавина хромофора FO. В пределах принятой в настоящее время ветви метаболизма лактата L-лактат фосфорилируется до 2-фосфо-L-лактата L-лактат-киназой (CofB); 2-фосфо-L-лактат, в свою очередь, гуанилируется до L-лактил-2-дифосфо-5'-гуанозина 2-фосфо-L-лактат гуанилилтрансферазой (CofC). На следующем этапе L-лактил-2-дифосфо-5'-гуанозин связывается с FO 2-фосфо-L-лактат-трансферазой (CofD) с образованием F420-02. Наконец, фермент F420-0:ɣ-глутамиллигаза (CofE) связывает мономеры глутамата до F420-0, образуя конечный кофактор6 в различных количествах23,25. Различные организмы демонстрируют разные закономерности в количестве прикрепленных остатков глутамата, причем более короткие хвосты обнаруживаются для метаногенов, чем у микобактерий2,25,26. Как правило, метаногены показывают длину хвоста от двух до трех, с пятью в ацетокластическом метаногене, Methanosarcina sp., в то время как длина хвоста, обнаруженная в Mycobacterium sp., варьировалась от пяти до семи остатков глутамата2,25,26,27. Однако недавние результаты показали, что длинноцепочечный F420 связывается с F420-зависимыми оксидоредуктазами с более высоким сродством, чем короткоцепочечный F420; кроме того, связанный длинноцепочечный F420 увеличивает сродство субстрата, но уменьшает скорость оборота соответствующих ферментов23.
Обнаружение кофактора F420 часто основывается на его флуоресценции. Таким образом, его производные олиго глутамата были разделены с использованием обратной фазы (RP)-HPLC27,28. Недавно Ney et al. использовали гидроксид тетрабутиламмония в качестве реагента ионного спаривания для отрицательно заряженного хвоста глутамата для успешного улучшения разделения на RP-HLPC5. Здесь мы представляем способ подготовки образцов, последующего лизиса, экстракции, очистки, разделения и количественной оценки кофактора F420 не только из чистых культур, но и из различных образцов окружающей среды (т.е. почв и осадка реактора).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>HPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge and rotor for 50 mL &#8220;Falcon&#8221; tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Column: Gemini NX C18, 5 &#956;m, 150 x 3 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE filter (pore size 0.22 &#181;m) to remove particulate matter prior HPLC analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin for SPE: Strata-X-AW 33 &#956;m as weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SPE equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples

Кофактор F420 играет центральную роль в качестве гидридного носителя в первичном и вторичном метаболизме многих бактериальных и архейных таксонов. Кофактор наиболее известен своей ролью в метаногенезе, где он облегчает термодинамически сложные реакции. Поскольку хвост полиглутамата варьируется по длине между различными организмами, анализ профиля длины может быть мощным инструментом для различения и характеристики различных групп и путей в различных местах обитания. Здесь протокол описывает экстракцию и оптимизацию обнаружения кофактора F420 путем применения твердофазной экстракции в сочетании с высокоэффективным жидким хроматографическим анализом, независимым от культурных или молекулярно-биологических подходов. Метод применялся для получения дополнительной информации о экспрессии кофактора F420 из микробных сообществ в почвах, анаэробном осадке и чистых культурах и оценивался путем пиковых экспериментов. Таким образом, исследование преуспело в создании различных профилей длины хвоста F420 для гидрогенотрофных и ацетокластических метаногенов в контролируемых метаногенных чистых культурах, а также из образцов окружающей среды, таких как анаэробный осадок реактора и почвы.

Чистые культуры Methanosarcina thermophila и Methanoculleus thermophilus, оба термофильные метаногенные археи, выращивались в подходящей среде, как описано ранее29,30. Для Methanosarcina thermophila метанол использовался в качестве источника энергии, тогда как Methanoculleus therm...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples at JoVE.com

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

Метод извлечения кофактора F420 из чистых культур оптимизирован для жидкостного хроматографического разделения и анализа длины хвоста F420 в чистых культурах и образцах окружающей среды.

Извлечение кофактора F420 для анализа длины хвоста полиглутамита из метаногенных чистых культур и образцов окружающей среды

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

Кофактор F420 играет важную роль в первичном и вторичном метаболизме многих прокариот. Измерение этой молекулы в образцах окружающей среды позволяет глубже понять ее распространенность и функцию. Этот метод позволяет анализировать кофактор в сложных пробных материалах, таких как шлам и почва.Таким образом, лизис материала и предварительная очистка перед анализом являются центральными этапами. Протокол включает в себя различные этапы во время подготовки образца. Эти шаги должны быть спланированы и подготовлены очень хорошо, прежде чем начинать обработку образца.Например, важна подготовка свежих буферов. Чтобы начать лизис образца, поместите пять граммов образца в 50-миллилитровую коническую пробирку. Затем добавьте пять миллилитров буфера лизиса 2X к образцам и доведите объем до 10 миллилитров дистиллированной водой, чтобы достичь конечной концентрации 0,5 грамма на миллилитр.Вихрь разбавленных образцов в течение 20 секунд с последующим автоклавированием в течение 30 минут при 121 градусе Цельсия. Для сухих образцов, таких как лесная почва, доведите до конечного объема 20 миллилитров дистиллированной водой после автоклавирования и снова вращайте разбавленный образец в течение 20 секунд, как показано. Как только образцы остынут, центрифугируйте образец лизата в течение пяти минут при 11 000 х г и соберите супернатант.Готовят пятимиллилитровую твердофазную экстракцию или колонну SPE, заполненную 100 миллиграммами слабого аниона смешанного режима полимерного сорбента, обусловливающего анионообменник тремя миллилитрами метанола. Затем уравновешивайте анионообменник тремя миллилитрами дистиллированной воды. Загрузите до девяти миллилитров супернатанта из центрифугированного лизата на колонну SPE.Последовательно смывают примеси из колонки пятью миллилитрами 25-миллимолярного ацетата аммиака и пятью миллилитрами метанола. После промывки элюируют кофактор F420 одним миллилитром буфера элюирования. Предустановите духовку на 40 градусов цельсия и установите флуоресцентный детектор на длину волны вымирания 420 нанометров и длину волны излучения 470 нанометров.Затем отфильтруйте элюированный образец из SPE во флаконы ВЭЖХ с помощью фильтра PTFE с размером пор 0,22 мкм. Вводят 50 микролитров отфильтрованного образца в систему ВЭЖХ и отделяют кофактор F420 через режим градиента, используя комбинацию подвижных фаз, как описано в рукописи. Анализ состава и концентрации кофактора F420.Рост чистых культур метаногенов был подтвержден с помощью микроскопии. В фазово-контрастной микроскопии видны агломераты метаногенов, которые излучают голубоватый свет при возбуждении кофактора F420 ультрафиолетовым светом. Проанализирована пиковая площадь восстановленного кофактора F420 после SPE с различными объемами культур Methanoculleus thermophilus.Стратегия автоклавной дезинтеграции достигла самой высокой пиковой площади, заключив максимальную эффективность экстракции с использованием обработки давлением и температурой. Анализ распределения длины хвоста выявил различия в общей концентрации кофактора F420 и распределении F420 хвостовой длины чистых метаногенных культур в образцах окружающей среды. При применении этой процедуры следует помнить о том, чтобы полностью собрать общий объем буфера элюирования или записать точный объем потока.Этот метод прокладывает путь для исследования кофактора F420 в более сложных образцах, таких как почвы и шламы, и позволяет глубже понять экологическое воздействие этой молекулы.

Research

JoVE Journal

Environment

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 Измерение энтеровирус и Норовирус Происшествия в воде культуры и RT-КПЦР. I. Сбор образцов вирусов

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Использование хирономид (Diptera), поверхностно-Плавающие куколки экзувии как Bioassessment протокола Rapid для водоемов

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Выбор размера Автоматизированная гель для улучшения качества секвенирования библиотек следующего поколения, полученного из окружающей среды проб воды

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Физическая изоляция эндоспор из проб окружающей среды на целевой лизис вегетативных клеток

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

Простой метод Автоматизированная твердофазной экстракции водных образцов для анализа иммунологических малых загрязнителях

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Получение и испытание импеданса на основе струйного биочипов с RTgill-W1 Клетки для быстрой оценки питьевой воды проб на токсичность

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Добыча и анализ микробных фосфолипидов жирных кислот в почвах

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Использование фильтра картриджа для фильтрации проб воды и экстракции ДНК окружающей среды

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

Метод липидной экстракции и анализа для характеристики микробов почвы в экспериментах со многими образцами

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Экстракция органохлоридных пестицидов из пластиковых гранул и анализ пластического типа

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...