Name: extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00
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Agradecemos al Prof. Colin Jackson por el apoyo con el cofactor purificado F420. Esta investigación fue apoyada por el Fondo Científico Tirolesa (TWF) y la Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Reconocemos enormemente el apoyo de GPS, HK, SB, GG y HB.

NOTA: La extracción y el análisis del cofactor F420 es un proceso de tres pasos que incluye la lisis de la muestra, la prepurificación del cofactor a través de la extracción en fase sólida (SPE) y la detección del cofactor a través de RP-HPLC emparejado con iones (IP-RP-HPLC) con detección de fluorescencia. Antes de comenzar, prepare los materiales y reactivos como se indica en la Tabla 1.
1. Lisis de la muestra
<ol><li>Agregue hasta 5 g de muestra a los ...

<ol>
	<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+biochemistry,+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions.">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li><li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes.">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451 (2019).</li><li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+F420:+an+expanded+view+of+its+distribution,+biosynthesis,+and+roles+in+bacteria+and+archaea.">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium.">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria.">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li><li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420.">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments.">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li><li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane.">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li><li>Knittel, K., L&#246;sekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps.">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li><li>Lin, X. -. L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria.">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li><li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis:+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations.">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li><li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea,+in+particular+the+genus+Methanosarcina.">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li><li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis.">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li><li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri.">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species,+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea.">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li><li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis.">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li><li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species.">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li><li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -. S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+production,+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis.">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li><li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase/reductase.">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li><li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+F(420)+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents.">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism.">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000 (2017).</li><li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -. T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes.">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), 11208-11211 (2018).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases.">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902 (2017).</li><li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria.">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li><li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei.">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li><li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed.">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), 139-145 (1994).</li><li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+coenzyme+F(420)+in+Mycobacterium+species.">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li><li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+(Spain).">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic/anoxic+conditions.">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155 (2019).</li><li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila.">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li><li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+acetate:+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments.">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation,+preservation,+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants.">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li><li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis.">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803 (2010).</li></ol>

Para la evaluación del cofactor F420 a partir de cultivos metanogénicos puros, se puede realizar una evaluación microscópica para visualizar el crecimiento y la actividad (microscopía de fluorescencia) de los microorganismos involucrados (Figura 1). Para muestras procedentes de entornos naturales, el uso de microscopía para detectar o cuantificar F420 es limitado debido a interferencias con otros microorganismos fluorescentes, partículas orgánicas e inorgánicas...

F420 es un cofactor generalizado pero a menudo descuidado, que funciona como un transportador obligado de hidruro de dos electrones en los procesos metabólicos primarios y secundarios de archaea y bacteria1,2. F420 es una 5-deazaflavina y estructuralmente similar a las flavinas, por lo que sus propiedades químicas y biológicas son más comparables con las de NAD+ o NADP+. Debido a la sustitución del nitrógeno por carbono en la posición 5 del anillo de isoaloxazina, es un fuerte reductor, exhibiendo así un bajo potencial redox estándar de -340 mV1,3. F420 comprende un anillo de 5-deazaflavina y un enlazador de 2-fosfo-L-lactato (F420-0). Una cola de oligoglutamato que contiene n+1 monómeros de glutamato se puede unir a la molécula (F420-n+1)4.
Durante mucho tiempo, el cofactor F420 se ha asociado únicamente con Archaea y Actinobacteria. Esto ha sido revocado en gran medida. Análisis recientes revelaron que F420 se distribuye entre diversos organismos anaeróbicos y aeróbicos del filo Proteobacteria, Chloroflexi y potencialmente Firmicutes que habitan una miríada de hábitats como suelos, lagos y el intestino humano1,5. En 2019, Braga et al.6, demostraron que la proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica produce un derivado F420 único, que contiene un 3-fosfoglicerato en lugar de una cola de 2-fosfolactato, que podría estar muy extendida en varios hábitats. Dentro del dominio Archaea, F420 se ha encontrado en varios linajes, incluyendo órdenes metanogénico7, metanotrófico8,9 y reductor de sulfato10, y se supone que se produce en Thaumarchaeota11. F420 es mejor conocido como una coenzima redox esencial en la metanogénesis hidrogenotrófica y metilotrófica. La forma reducida de F420 (F420H2) funciona como donante de electrones para la reducción de metilentetrahidrometanopterina (metileno-H4MPT, Mer) y metenil-H4MPT12,13. También se puede utilizar como portador de electrones en vías de transporte de electrones independientes de H2 de metanógenos que contienen citocromos12,14. Además, la forma oxidada de F420 tiene una fluorescencia azul-verde característica al excitarse a 420 nm, lo que facilita la detección de metanógenos microscópicamente (Figura 1). Debido a su bajo potencial redox, F420 facilita (i) la reducción exógena de un amplio espectro de compuestos orgánicos recalcitrantes o tóxicos, (ii) la síntesis de antibióticos o fitotoxinas de tetraciclina y lincosamida en estreptomicetos (filo Actinobacteria), y (iii) resistencia al estrés oxidativo o nitrosativo u otras condiciones desfavorables en micobacterias (filo Actinobacteria)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. En consecuencia, las oxidorreductasas dependientes de F420 son biocatalizadores prometedores para fines industriales y farmacéuticos, así como para la biorremediación de ambientes contaminados1,23. A pesar de estos hallazgos recientes, las funciones exactas del cofactor F420 todavía se conocen marginalmente en Actinobacteria u otros filos bacterianos.
Existen al menos tres vías para la biosíntesis F4202,6,24. Al principio, la vía de biosíntesis se divide en una biosíntesis de 5-deazaflavina y una rama del metabolismo de 2-fosfolactato. La parte reactiva de la molécula F420 se sintetiza a través de la FO-sintasa utilizando los sustratos tirosina y 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pirimidinediona. El resultado es el cromóforo de nivel de riboflavina FO. Dentro de la rama del metabolismo del lactato actualmente aceptada, el L-lactato es fosforilado a 2-fosfo-L-lactato por una L-lactato quinasa (CofB); El 2-fosfo-L-lactato, a su vez, es guanilado a L-lactilo-2-difosfo-5'-guanosina por la 2-fosfo-L-lactato guanililtransferasa (CofC). En el siguiente paso, L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine está unida a FO por una 2-fosfo-L-lactato transferasa (CofD) para formar F420-02. Finalmente, la enzima F420-0:ɣ-glutamil ligasa (CofE) liga los monómeros de glutamato a F420-0, formando el cofactor final6 en números variables23,25. Diferentes organismos muestran diferentes patrones en el número de residuos de glutamato adheridos, encontrándose colas más cortas para los metanógenos que en las micobacterias2,25,26. En general, los metanógenos muestran longitudes de cola de dos a tres, con hasta cinco en el metanógeno acetoclástico, Methanosarcina sp., mientras que las longitudes de cola encontradas en Mycobacterium sp. variaron de cinco a siete residuos de glutamato2,25,26,27. Sin embargo, hallazgos recientes mostraron que F420 de cadena larga se une a oxidorreductasas dependientes de F420 con una afinidad más alta que F420 de cadena corta; además, F420 de cadena larga unida aumenta la afinidad del sustrato pero disminuye la tasa de recambio de las enzimas respectivas23.
La detección del cofactor F420 a menudo se basa en su fluorescencia. De este modo, sus derivados de oligo glutamato se separaron mediante hplc27,28 de fase invertida (RP). Recientemente, Ney et al. utilizaron hidróxido de tetrabutilamonio como reactivo de emparejamiento de iones para la cola de glutamato cargada negativamente para mejorar la separación en RP-HLPC con éxito5. Aquí, presentamos un método para la preparación de muestras, lisis posterior, extracción, purificación, separación y cuantificación del cofactor F420 no solo de cultivos puros sino también de diferentes muestras ambientales (es decir, suelos y lodos digestores).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>HPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge and rotor for 50 mL &#8220;Falcon&#8221; tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Column: Gemini NX C18, 5 &#956;m, 150 x 3 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE filter (pore size 0.22 &#181;m) to remove particulate matter prior HPLC analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin for SPE: Strata-X-AW 33 &#956;m as weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SPE equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples

El cofactor F420 juega un papel central como portador de hidruro en el metabolismo primario y secundario de muchos taxones bacterianos y arqueales. El cofactor es mejor conocido por su papel en la metanogénesis, donde facilita reacciones termodinámicamente difíciles. Como la cola de poliglutamato varía en longitud entre diferentes organismos, los análisis de perfil de longitud podrían ser una herramienta poderosa para distinguir y caracterizar diferentes grupos y vías en varios hábitats. Aquí, el protocolo describe la extracción y optimización de la detección del cofactor F420 mediante la aplicación de la extracción en fase sólida combinada con el análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento independiente de los enfoques biológicos culturales o moleculares. El método se aplicó para obtener información adicional sobre la expresión del cofactor F420 de las comunidades microbianas en suelos, lodos anaeróbicos y cultivos puros y se evaluó mediante experimentos de aumento. De este modo, el estudio logró generar diferentes perfiles de longitud de cola F420 para metanógenos hidrogenotróficos y acetoclásticos en cultivos puros metanogénicos controlados, así como a partir de muestras ambientales como lodos de digestor anaeróbico y suelos.

Los cultivos puros de Methanosarcina thermophila y Methanoculleus thermophilus, ambos arqueas metanogénicas termófilas, se cultivaron en medios adecuados como se describió anteriormente29,30. Para Methanosarcina thermophila, el metanol se utilizó como fuente de energía, mientras que Methanoculleus thermophilus se cultivó con H2 / CO2. El crecimiento se comprobó mediante evaluación microsc?...

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Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

Se optimizó un método para la extracción del cofactor F420 de cultivos puros para la separación cromatográfica líquida y el análisis de la longitud de la cola F420 en cultivo puro y muestras ambientales.

Extracción del cofactor F420 para el análisis de la longitud de la cola de poliglutamato a partir de cultivos puros metanogénicos y muestras ambientales

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

El cofactor F420 juega un papel importante en el metabolismo primario y secundario de muchos procariotas. La medición de esta molécula en muestras ambientales permite una comprensión más profunda de su prevalencia y función. Esta técnica permite el análisis del cofactor en materiales de muestra difíciles como lodos y suelos.Por lo tanto, la lisis del material y la prepurificación antes del análisis son los pasos centrales. El protocolo incluye diferentes pasos durante la preparación de la muestra. Estos pasos deben planificarse y prepararse muy bien antes de comenzar con el procesamiento de la muestra.Por ejemplo, la preparación de tampones frescos es importante. Para comenzar la lisis de la muestra, coloque cinco gramos de la muestra en un tubo cónico de 50 mililitros. Luego agregue cinco mililitros de tampón de lisis 2X a las muestras y lleve el volumen a 10 mililitros con agua destilada para alcanzar una concentración final de 0.5 gramos por mililitro.Vórtice las muestras diluidas durante 20 segundos seguido de autoclave durante 30 minutos a 121 grados centígrados. Para muestras secas como el suelo forestal, lleve a un volumen final de 20 mililitros con agua destilada después del autoclave, y vórtice la muestra diluida nuevamente durante 20 segundos como se ha demostrado. Una vez que las muestras se enfríen, centrífuga la muestra lisando durante cinco minutos a 11, 000 x g, y recoja el sobrenadante.Prepare una extracción en fase sólida de cinco mililitros o una columna SPE llena de 100 miligramos de sorbente polimérico de modo mixto de aniones débiles que acondiciona el intercambiador de aniones con tres mililitros de metanol. Luego, equilibre el intercambiador de aniones con tres mililitros de agua destilada. Cargue hasta nueve mililitros del sobrenadante del lisado centrifugado en la columna SPE.Lave secuencialmente las impurezas de la columna con cinco mililitros de acetato de amoníaco 25 milimolar y cinco mililitros de metanol. Después del lavado, eluya el cofactor F420 con un mililitro de tampón de elución. Preestablecimos el horno a 40 grados centígrados y ajustamos el detector de fluorescencia a una longitud de onda de extinción de 420 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 470 nanómetros.A continuación, filtre la muestra eluida del SPE en viales de HPLC utilizando un filtro de PTFE con un tamaño de poro de 0,22 micras. Inyecte 50 microlitros de la muestra filtrada en el sistema HPLC y separe el cofactor F420 a través del modo de gradiente utilizando una combinación de fases móviles como se describe en el manuscrito. Analizar la composición y concentración del cofactor F420.El crecimiento de cultivos puros de metanógenos se verificó mediante microscopía. En la microscopía de contraste de fase, son visibles los aglomerados de metanógenos, que emiten una luz azulada cuando el cofactor F420 se excita con luz ultravioleta. Se analizó el área pico del cofactor F420 recuperado después de SPE con diferentes volúmenes de los cultivos de Methanoculleus thermophilus.La estrategia de desintegración en autoclave logró el área de pico más alta, concluyendo la máxima eficiencia de extracción utilizando un tratamiento de presión-temperatura. El análisis de la distribución de la longitud de la cola reveló las diferencias en la concentración global del cofactor F420 y la distribución de la longitud de la cola F420 de los cultivos metanogénicos puros en muestras ambientales. Al aplicar este procedimiento, tenga en cuenta que debe recopilar completamente el volumen total del búfer de elución o registrar el volumen exacto de flujo continuo.Esta técnica allana el camino para la exploración del cofactor F420 en muestras más complejas como suelos y lodos y permite una visión más profunda del impacto ecológico de esta molécula.

Research

JoVE Journal

Environment

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. I. Colección de ejemplos de virus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Investigación

Medio ambiente

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

El uso de Chironomidae (Diptera) en superficie flotante pupal Exuviae como Protocolo Bioassessment rápida para las Masas de Agua

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Automatizado Gel Tamaño Selección para mejorar la calidad de las bibliotecas de secuenciación de próxima generación Preparado a partir de muestras de agua del medio ambiente

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

El aislamiento físico de endosporas de muestras ambientales por Targeted lisis de las células vegetativas

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

Un método simple para la fase sólida automatizada Extracción de muestras de agua para análisis inmunológico de los pequeños contaminantes

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Preparación y ensayo de impedancia basada en biochips fluido con células RTgill-W1 para evaluación rápida de muestras de agua potable para la toxicidad

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Extracción y análisis de ácidos grasos de fosfolípidos microbiana en suelos

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

El uso de un cartucho de filtro para la filtración de agua Las muestras y extracción de ADN del Medio Ambiente

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

Un método de extracción y análisis de lípidos para caracterizar los microbios del suelo en experimentos con muchas muestras

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Extracción de plaguicidas organoclorados de pellets de plástico y análisis de tipos de plástico

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...