Name: extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples at JoVE.com

Vi tackar tacksamt prof. Colin Jackson för stödet med renad kofaktor F420. Denna forskning stöddes av Tyrolska vetenskapsfonden (TWF) och Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Vi är mycket medvetna om stödet från GPS, HK, SB, GG och HB.

OBS: Extraktion och analys av kofaktor F420 är en trestegsprocess inklusive provlys, kofaktorförrening via fast fasextraktion (SPE) och kofaktordetektering via jonkopplad RP-HPLC (IP-RP-HPLC) med fluorescensdetektering. Förbered före start material och reagenser enligt tabell 1.
1. Provlys
<ol><li>Tillsätt upp till 5 g prov till lämpliga rör (t.ex. 50 ml koniska rör).</li>
	<li>Tillsätt 5 ml lysbuffert (2x lagerlösning, tabell 1) till pr...

<ol>
	<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+biochemistry,+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions.">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li><li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes.">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451 (2019).</li><li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+F420:+an+expanded+view+of+its+distribution,+biosynthesis,+and+roles+in+bacteria+and+archaea.">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium.">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria.">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li><li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420.">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li><li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments.">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li><li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane.">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li><li>Knittel, K., L&#246;sekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps.">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li><li>Lin, X. -. L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria.">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li><li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis:+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations.">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li><li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea,+in+particular+the+genus+Methanosarcina.">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li><li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis.">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li><li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri.">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species,+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea.">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li><li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis.">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li><li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species.">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li><li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -. S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+production,+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis.">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li><li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase/reductase.">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li><li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+F(420)+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents.">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism.">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000 (2017).</li><li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -. T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes.">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), 11208-11211 (2018).</li><li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases.">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902 (2017).</li><li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria.">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li><li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei.">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li><li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed.">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), 139-145 (1994).</li><li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+coenzyme+F(420)+in+Mycobacterium+species.">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li><li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+(Spain).">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic/anoxic+conditions.">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155 (2019).</li><li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila.">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li><li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+acetate:+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments.">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation,+preservation,+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants.">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li><li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis.">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803 (2010).</li></ol>

För utvärdering av kofaktor F420 från methanogenic rena kulturer kan en mikroskopisk utvärdering utföras för att visualisera tillväxt och aktivitet (fluorescensmikroskopi) av de berörda mikroorganismerna (figur 1). För prover som härrör från naturliga miljöer är användningen av mikroskopi för att detektera eller kvantifiera F420 begränsad på grund av störningar med andra fluorescerande mikroorganismer, organiska och oorganiska partiklar. I detta samma...

F420 är en utbredd men ofta försummad kofaktor, som fungerar som en obligatorisk tvåelektronhydridbärare i primära och sekundära metaboliska processer av både Arkéer och Bakterier1,2. F420 är en 5-deazaflavin och strukturellt lik flavins, varigenom dess kemiska och biologiska egenskaper är mer jämförbara med NAD + eller NADP +. På grund av substitutionen av kväve med kol vid position 5 i isoalloxazinringen är det ett starkt reduktant, vilket uppvisar en låg standard redox potential på -340 mV1,3. F420 består av en 5-deazaflavin ring och en 2-phospho-L-laktat linker (F420-0). En oligoglutamat svans som innehåller n +1 glutamat monomerer kan fästas på molekylen (F420-n+1)4.
Under lång tid har kofaktorn F420 endast associerats med Archaea och Actinobacteria. Detta har till stor del omkullkastats. Nyligen genomförda analyser visade att F420 distribueras mellan olika anaeroba och aeroba organismer av phyla Proteobacteria, Chloroflexi och potentiellt Firmicutes som bor i en myriad av livsmiljöer som jordar, sjöar och den mänskliga tarmen1,5. År 2019 visade Braga et al.6 att proteobakterien Paraburkholderia rhizoxinica producerar ett unikt F420-derivat, innehållande ett 3-fosfosfolat istället för en 2-phossfolactate svans, som kan vara utbredd i olika livsmiljöer. Inom området Archaea har F420 hittats i flera härstamningar, inklusive mekanogen7, methanotrofisk8,9 och sulfatreducerande order10, och är tänkt att produceras i Thaumarchaeota11. F420 är mest känd som en viktig redox coenzyme i hydrogenotrofisk och metotrofisk metanogenes. Den reducerade formen av F420 (F420H2) fungerar som elektrondonator för minskning av metylenetrahydrometanopterin (metylen-H4MPT, Mer) och methenyl-H4MPT12,13. Det kan också användas som elektronbärare i H2-oberoende elektrontransportvägar för metanogener som innehåller cytokromer12,14. Dessutom har den oxiderade formen av F420 en karakteristisk blågrön fluorescens vid excitation vid 420 nm, vilket underlättar detektion av metanogener mikroskopiskt (figur 1). På grund av sin låga redoxpotential underlättar F420 i) den exogena minskningen av ett brett spektrum av annars motsträviga eller giftiga organiska föreningar, ii) syntes av tetracyklin- och linkosamidantibiotika eller fytotoxiner i streptomyceter (fylum Actinobacteria) och iii) resistens mot oxidativ eller nitrosativ stress eller andra ogynnsamma förhållanden i mykobakterier (fylum Actinobacteria)1,5, 16,17,18,19,20,21,22. Följaktligen är F420-beroende oxidoreduktaser lovande biokatalysanter för industriella och farmaceutiska ändamål samt för bioremediation av förorenade miljöer1,23. Trots dessa senaste resultat är de exakta rollerna för kofaktorn F420 fortfarande marginellt kända i Actinobacteria eller annan bakteriell phyla.
Det finns minst tre vägar för F420 biosyntes2,6,24. I början delas biosyntesvägen upp i en 5-deazaflavin biosyntes och en 2-fosfolactate metabolism gren. Den reaktiva delen av F420-molekylen syntetiseras via FO-syntas med hjälp av substraten tyrosin och 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedion. Resultatet är riboflavin nivå kromofor FO. Inom den för närvarande accepterade laktatmetabolismgrenen fosforyleras L-laktat till 2-fosfato-L-laktat av en L-laktatkinas (CofB); 2-fosfatfos-L-laktat, i sin tur, är guanylerad till L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosin av 2-phospho-L-laktat guanylyltransferase (CofC). I nästa steg är L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosin kopplad till FO genom en 2-phospho-L-laktattransferas (CofD) för att bilda F420-02. Slutligen ligates enzymet F420-0:ķ-glutamyl ligase (CofE) glutamatmonomerer till F420-0 och bildar den slutliga kofaktorn6 i varierande antal23,25. Olika organismer uppvisar olika mönster i antalet bifogade glutamatrester, med kortare svansar som finns för metanogener än i mykobakterier2,25,26. I allmänhet visar metanogener svanslängder från två till tre, med upp till fem i acetoclastic methanogen, Methanosarcina sp., medan svanslängder som finns i Mycobacterium sp. varierade från fem till sju glutamatrester2,25,26,27. De senaste resultaten visade dock att långkedjiga F420 binder till F420-beroende oxidoreduktaser med högre affinitet än kortkedjiga F420. Dessutom ökar den bundna långkedjiga F420 substrattillhörigheten men minskar omsättningshastigheten för respektive enzymer23.
Detektion av kofaktor F420 baseras ofta på dess fluorescens. Därmed separerades dess oligo glutamat derivat med hjälp av omvänd fas (RP)-HPLC27,28. Nyligen använde Ney et al. tetrabutylammoniumhydroxid som ett jonparningsreagens för den negativt laddade glutamat svansen för att förbättra separationen på RP-HLPC framgångsrikt5. Här presenterar vi en metod för beredning av prover, efterföljande lys, extraktion, rening, separation och kvantifiering av kofaktor F420 inte bara från rena kulturer utan också från olika miljöprover (dvs. jordar och rötslam).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>HPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge and rotor for 50 mL &#8220;Falcon&#8221; tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Column: Gemini NX C18, 5 &#956;m, 150 x 3 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE filter (pore size 0.22 &#181;m) to remove particulate matter prior HPLC analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin for SPE: Strata-X-AW 33 &#956;m as weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>weak anion mixed-mode polymeric sorbent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SPE equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of cofactor f420 for analysis of polyglutamate tail length from methanogenic pure cultures and environmental samples

Kofaktorn F420 spelar en central roll som hydridbärare i den primära och sekundära metabolismen av många bakteriella och ålderdomliga taxa. Kofaktorn är mest känd för sin roll i metanogenes, där den underlättar termodynamiskt svåra reaktioner. Eftersom polyglutamate svansen varierar i längd mellan olika organismer, kan längdprofilanalyser vara ett kraftfullt verktyg för att skilja och karakterisera olika grupper och vägar i olika livsmiljöer. Här beskriver protokollet extraktion och optimering av kofaktor F420 detektion genom att tillämpa solid fas extraktion i kombination med högpresterande vätskekromatografi analys oberoende av kulturella eller molekylära biologiska metoder. Metoden tillämpades för att få ytterligare information om uttrycket av kofaktor F420 från mikrobiella samhällen i jordar, anaeroba slam och rena kulturer och utvärderades genom spikningsexperiment. Därmed lyckades studien generera olika F420 svanslängdsprofiler för hydrogenotrofiska och acetoclasta metanogener i kontrollerade metanogena rena kulturer samt från miljöprover som anaerobt rötslam och jordar.

Rena kulturer av Methanosarcina thermophila och Methanoculleus thermophilus, båda termofila methanogenic Archaea, odlades i lämpliga medier som beskrivits tidigare29,30. För Methanosarcina thermophila användes metanol som energikälla, medan Methanoculleus thermophilus odlades på H2/CO2. Tillväxten kontrollerades genom mikroskopisk utvärdering, medan aktiviteten undersöktes genom mätning ...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples at JoVE.com

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

En metod för utvinning av kofaktor F420 från rena kulturer optimerades för vätskekromatografisk separation och analys av F420 svanslängd i rena odlings- och miljöprover.

Extraktion av Cofactor F420 för analys av polyglutamate svanslängd från methanogenic rena kulturer och miljöprover

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

Kofaktorn F420 spelar en viktig roll i den primära och sekundära metabolismen hos många prokaryoter. Att mäta denna molekyl i miljöprover möjliggör en djupare förståelse för dess prevalens och funktion. Denna teknik möjliggör analys av kofaktorn i svåra provmaterial som slam och jord.Därmed är lysen av det materiellt och pre-rening för analys de centrala kliver. Protokollet innehåller olika steg under provberedningen. Dessa steg måste planeras och förberedas mycket väl innan provbehandlingen påbörjas.Till exempel är det viktigt att förbereda färska buffertar. För att påbörja provlysen, placera fem gram av provet i ett koniskt rör på 50 milliliter. Tillsätt sedan fem milliliter 2X lysbuffert till proverna och låt volymen till 10 milliliter med destillerat vatten nå en slutlig koncentration på 0,5 gram per milliliter.Virvel de utspädda proverna i 20 sekunder följt av autoklaving i 30 minuter vid 121 grader Celsius. För torra prover som skogsjord, ta till en slutlig volym på 20 milliliter med destillerat vatten efter autoklavering och virvla det utspädda provet igen i 20 sekunder enligt vad som visats. När proverna har svalnat, centrifugera provet lysate i fem minuter vid 11,000 x g, och samla supernatanten.Förbered en fem-milliliter fast fas extraktion eller SPE kolonn fylld med 100 milligram svag anion blandad-läge polymera sorbent konditionering anjonväxlaren med tre milliliter metanol. Balansera sedan anjonväxlaren med tre milliliter destillerat vatten. Ladda upp till nio milliliter av supernatanten från den centrifugerade lysat på SPE-kolonnen.Tvätta föroreningarna från kolonnen med fem milliliter 25-millimolärt ammoniakacetat och fem milliliter metanol. Efter tvätt, elute cofactor F420 med en milliliter elution buffert. Förinställ ugnen till 40 grader Celsius och ställ in fluorescensdetektorn på 420 nanometers utdöendevåglängd och 470 nanometers emissionsvåglängd.Filtrera sedan det eluterade provet från SPE till HPLC-injektionsflaska med hjälp av ett PTFE-filter med en porstorlek på 0,22 mikron. Injicera 50 mikroliter av det filtrerade provet i HPLC-systemet och separera kofaktor F420 via gradientläge med hjälp av en kombination av mobila faser som beskrivs i manuskriptet. Analysera kofaktor f420 sammansättning och koncentration.Tillväxten av rena kulturer av metanogener kontrollerades av mikroskopi. I faskontrastmikroskopi är agglomerater av metanogener synliga, som avger ett blåaktigt ljus när kofaktorN F420 är upphetsad med ultraviolett ljus. Toppområdet för återvunnen cofactor F420 efter SPE med olika volymer av Methanoculleus thermophilus kulturer analyserades.Strategin för automatisk desintegration uppnådde det högsta toppområdet och avslutade maximal extraktionseffektivitet med hjälp av en trycktemperaturbehandling. Analys av svanslängdsfördelningen visade skillnaderna i den totala koncentrationen av kofaktor F420 och fördelningen av F420 svanslängden för de rena metanogena kulturerna i miljöprover. När du tillämpar den här proceduren bör du vara medveten om att fullständigt samla in den totala volymen av elutionsbufferten eller registrera den exakta volymen av genomströmningen.Denna teknik banar väg för utforskning av kofaktor F420 i mer komplexa prover som jordar och slam och möjliggör djupare insikter om den ekologiska effekten av denna molekyl.

Research

JoVE Journal

Environment

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Metod 1615. Mätning av Enterovirus och Norovirus förekomst i vatten efter kultur och RT-qPCR. I. Insamling av virusprov

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Användning av Chironomidae (Diptera) Utanpå Flytande PUPP exuviae som en snabb Bioassessment protokoll för vattenförekomster

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Automatiserad Gel Storlek Val för att förbättra kvaliteten på nästa generations sekvensering bibliotek Framställd från Miljö vattenprov

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Fysisk Isolering av Endospores från miljöprover genom riktade Lys av vegetativa celler

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

En enkel metod för Automated Fastfasextraktion av vattenprover för immunologisk analys av små föroreningar

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Framställning och testning av impedans-baserade fluid Biochips med RTgill-W1 celler för snabb utvärdering av dricksvatten Prover för toxicitet

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Utvinning och analys av mikrobiell Phospholipid fettsyror i jordar

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Användning av en filterpatron för filtrering av vattenprover och utvinning av miljö DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

En lipid extraktions- och analysmetod för karakterisering av markmikrober i experiment med många prov

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Extraktion av organiska klorpesticider från plastpellets och plasttypsanalys

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...