Name: defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية (R01 NS048353 ، R01 NS109655) ، والمعهد الوطني للسرطان (R01 CA122804) ، ووزارة الدفاع (X81XWH-09-1-0086 ، W81XWH-11-1-0498 ، W81XWH-12-1-0164 ، W81XWH-14-1-0073 ، و W81XWH-15-1-0193) ، ومؤسسة أورام الأطفال (2014-04-001 و 2015-05-007).

قبل تنفيذ أي إجراءات مع الفئران ، يجب مراجعة جميع الإجراءات والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها. تمت الموافقة على البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية التابعة لجامعة ساوث كارولينا الطبية. تم تنفيذ هذا البروتوكو?...

<ol>
	<li>Ricciuti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates+for+lung+cancer+in+the+era+of+personalized+oncology.">Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology.</a> Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).</li><li>Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+axis+in+glioblastoma+multiforme.">PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).</li><li>Roskoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+FDA-approved+small+molecule+protein+kinase+inhibitors.">Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors.</a> Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).</li><li>Heffner, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+conditional+mouse+mutagenesis+with+a+comprehensive+cre+characterization+resource.">Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource.</a> Nature Communications. 3, 1218 (2012).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB4+promotes+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis+via+Ras-independent+mechanisms.">ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms.</a> Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).</li><li>Kazmi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+overexpressing+neuregulin-1+model+neurofibroma-malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+progression+and+implicate+specific+chromosomal+copy+number+variations+in+tumorigenesis.">Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).</li><li>Brosius, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+overexpression+and+Trp53+haploinsufficiency+cooperatively+promote+de+novo+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis.">Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis.</a> Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).</li><li>Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.+A+clinicopathologic+study+of+120+cases.">Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases.</a> Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).</li><li>Gassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+neural+and+cardiac+development+in+mice+lacking+the+ErbB4+neuregulin+receptor.">Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor.</a> Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).</li><li>Tidcombe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+and+mammary+gland+defects+in+ErbB4+knockout+mice+genetically+rescued+from+embryonic+lethality.">Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality.</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).</li><li>Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+characteristics+of+a+nervous+system-specific+erbB4+knock-out+mouse.">Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse.</a> Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).</li><li>Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+neuropathies+and+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+in+transgenic+mice+overexpressing+glial+growth+factor+beta3+in+myelinating+Schwann+cells.">Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells.</a> Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).</li><li>Jackson-Fisher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Neu/ErbB2-induced+mammary+tumors+is+unaffected+by+loss+of+ErbB4.">Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4.</a> Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).</li><li>Byer, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen+inhibits+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+growth+in+an+estrogen+receptor-independent+manner.">Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner.</a> Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+utility+of+SOX10+to+distinguish+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+from+synovial+sarcoma,+including+intraneural+synovial+sarcoma.">Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma.</a> Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genomic+characterization+of+a+sporadic+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+line.">Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cstf2t+regulates+expression+of+histones+and+histone-like+proteins+in+male+germ+cells.">Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells.</a> Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).</li><li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63,+MHC+class+1,+and+CD47+identify+subsets+of+extracellular+vesicles+containing+distinct+populations+of+noncoding+RNAs.">CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+promote+regenerative+growth+in+sensory+neurons.">Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normalization+and+differential+expression+analyses+using+RNA-Seq+data+from+726+individual+Drosophila+melanogaster.">Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 17, 28 (2016).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Huang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DAVID+Gene+Functional+Classification+Tool:+a+novel+biological+module-centric+algorithm+to+functionally+analyze+large+gene+lists.">The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists.</a> Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+map:+a+network-based+method+for+gene-set+enrichment+visualization+and+interpretation.">Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation.</a> PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).</li><li>Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+gene-set+enrichment+analysis+of+RNA-Seq+data+with+small+replicates.">Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates.</a> PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).</li><li>Koch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+analysis+of+RNA+sequencing+data.">A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).</li><li>Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+xenografting+of+human+luciferase-tagged+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells+for+in+vivo+testing+of+candidate+therapeutic+agents.">Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).</li><li>Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G*Power+3:+a+flexible+statistical+power+analysis+program+for+the+social,+behavioral,+and+biomedical+sciences.">G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences.</a> Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+the+embryonic+nerve+roots+for+NF1-associated+plexiform+neurofibroma.">Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma.</a> Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).</li><li>Mo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+neurofibroma+model+from+induced+pluripotent+stem+cells+delineates+tumor+pathogenesis+and+developmental+origins.">Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).</li><li>Chau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+therapeutic+efficacy+of+a+novel+pharmacologic+inducer+of+apoptosis+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.">Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).</li><li>Dodd, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF1(+/-)+Hematopoietic+cells+accelerate+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+development+without+altering+chemotherapy+response.">NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response.</a> Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).</li><li>Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+beta+and+neuregulin-1+alpha+differentially+affect+the+migration+and+invasion+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells.">Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells.</a> Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).</li></ol>

تم تطوير الطرق التفصيلية المعروضة هنا باستخدام نموذج GEM من MPNSTs. ومع ذلك ، إذا كان من الممكن تشتيت أنسجة الورم ذات الأهمية إلى خلايا فردية ، فإن هذه المنهجيات قابلة للتكيف بسهولة مع أنواع الأورام المختلفة الناشئة في GEMs. من المهم التأكد من أن الأليل المفلطح لا يؤدي إلى i) انخفاض البقاء على قيد ...

قبل العقدين الماضيين، كان علاج السرطانات البشرية يعتمد بشكل كبير على العلاج الإشعاعي وعوامل العلاج الكيميائي التي استهدفت على نطاق واسع السكان الخلويين الذين ينتشرون بسرعة عن طريق إتلاف الحمض النووي أو تثبيط تخليق الحمض النووي. على الرغم من أن هذه الأساليب تمنع نمو الخلايا السرطانية ، إلا أنها كانت لها أيضا آثار جانبية ضارة على أنواع الخلايا الطبيعية سريعة التكاثر مثل الخلايا الظهارية المعوية وخلايا بصيلات الشعر. في الآونة الأخيرة ، بدأ علاج السرطان في استخدام عوامل العلاج الكيميائي التي تستهدف بدقة البروتينات ضمن مسارات الإشارات التي تعتبر مهمة للغاية لنمو أورام المريض الفردية. وقد أدى هذا النهج ، الذي يشار إليه عادة باسم "الطب الدقيق" ، إلى تطوير ذخيرة دائمة التوسع من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة والمثبطات الجزيئية الصغيرة. تمنع هذه العوامل بشكل فعال تكاثر الخلايا السرطانية وبقائها مع تجنب الآثار الجانبية الضارة على أنواع الخلايا الطبيعية التي شوهدت مع عوامل العلاج الكيميائي التقليدية والعلاج الإشعاعي. تستهدف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المستخدمة لعلاج السرطانات البشرية بشكل شائع جزيئات سطح الخلية مثل مستقبلات عامل النمو 1 (على سبيل المثال ، العائلة الكبيرة من كينازات التيروزين المستقبلة التي تمتد عبر الغشاء) ومعدلات الاستجابة المناعية2 (على سبيل المثال ، بروتين موت الخلايا المبرمج 1 ، رباط الموت المبرمج1). يمكن أن تمنع المثبطات الجزيئية الصغيرة إما بروتينات سطح الخلية أو بروتينات الإشارة الموجودة داخل الخلايا3. ومع ذلك ، من أجل توظيف هذه العوامل العلاجية الجديدة بشكل فعال ، يجب إثبات أن سرطانا معينا يعتمد على الجزيء الذي يستهدفه عامل علاجي مرشح.
على الرغم من أن هذه العوامل العلاجية الجديدة لها تأثيرات أكثر تركيزا ، إلا أن العديد منها لا يزال يمنع عمل أكثر من بروتين واحد. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تتوفر عوامل متعددة ذات فعالية وخصوصية متفاوتة لاستهداف بروتين معين. وبالتالي ، أثناء التحقيقات قبل السريرية ، من الحكمة استخدام طرق إضافية مثل الاستئصال الجيني للتحقق من صحة البروتين المرشح كهدف علاجي. أحد الأساليب المفيدة بشكل خاص للتحقق من صحة البروتين كهدف علاجي هو استئصال الجين الذي يشفر البروتين المرشح في نموذج حيواني معدل وراثيا يطور نوع السرطان المحدد للاهتمام. يمكن أن يكون هذا النهج مباشرا نسبيا إذا توفرت الفئران ذات الطفرة الصفرية (إما طفرة طبيعية أو طفرة فارغة معدلة وراثيا ["ضربة قاضية"] أو طفرة فارغة أدخلها مصيدة جينية) ، وكانت الفئران قابلة للحياة في مرحلة البلوغ. لسوء الحظ ، غالبا ما تكون الفئران ذات الطفرة الصفرية التي تلبي هذه المعايير غير متوفرة ، عادة لأن الطفرة الصفرية تؤدي إلى الموت جنينا أو في الأيام الأولى من حياة ما بعد الولادة. في هذه الحالة، يمكن بدلا من ذلك عبور الفئران المعرضة لتطوير نوع الورم محل الاهتمام إلى الفئران التي تحيط بها أجزاء رئيسية من الجين محل الاهتمام بمواقع loxP ("floxed")، والتي تسمح باستئصال الجين عن طريق إدخال جين متحول يعبر عن Cre recombinase في الخلايا السرطانية (ضربة قاضية مشروطة). يوفر هذا النهج العديد من المزايا. أولا ، إذا كان برنامج تشغيل Cre متاحا يتم التعبير عنه في الورم ولكن ليس في نوع الخلية التي أدت إلى الوفاة في الضربات القاضية التقليدية ، فمن المحتمل أن يؤدي هذا النهج إلى التحقق من صحة الهدف العلاجي المرشح. ثانيا، إن إزالة الجين الذي يشفر البروتين المرشح في الخلايا السرطانية ولكن ليس في العناصر الأخرى داخل الرحم مثل الخلايا الليفية المرتبطة بالورم أو الخلايا المناعية يسمح للباحث بالتمييز بين التأثيرات المستقلة للخلية وغير المستقلة للخلية للهدف العلاجي. وأخيرا، يسمح برنامج تشغيل Cre المستحث بالتاموكسيفين (CreERT2) للباحث بحذف الجين محل الاهتمام في مراحل مختلفة من تطور الورم وتحديد النافذة التي من المرجح أن يكون فيها العامل العلاجي المرشح فعالا.
لسوء الحظ ، هناك أيضا مشكلات فنية يمكن أن تحد من استخدام الضربات القاضية الشرطية في الأورام الناشئة في نماذج GEM. على سبيل المثال ، قد لا يتوفر برنامج تشغيل Cre الذي يتم التعبير عنه في الخلايا السرطانية ويتجنب حذف الجينات في الخلايا الطبيعية الضرورية للحياة. هناك مشكلة أخرى ، والتي يمكن التقليل من شأنها ، وهي أن برامج تشغيل Cre و CreERT2 غالبا ما تقوم باستئصال الأليلات المفلطحة في الفئران ، مما يؤدي إلى الفسيفساء للطفرة الخالية في سرطان GEM. عندما يحدث هذا ، ستستمر الخلايا السرطانية التي لم يتم فيها استئصال الجين المستهدف في التكاثر بسرعة ، مما يؤدي إلى زيادة نمو الخلايا السرطانية مع الأليلات الممزقة. يمكن أن تحدث الفسيفساء في خطوط تشغيل Cre بسبب تعبير Cre غير المنتشر في كل مكان في السلالة المستهدفة وعن طريق إعادة التركيب الفاشلة في الخلايا الفردية المستقلة عن تعبير Cre4. هذه ظاهرة معروفة لبرامج تشغيل Cre تعتمد على نوع الخلية ويجب مراعاتها أثناء التصميم التجريبي وتفسير البيانات. يمكن للفسيفساء أن تخفي تأثير الضربة القاضية وتقود الباحث إلى استنتاج خاطئ بأن الجين محل الاهتمام ليس ضروريا لتكاثر الخلايا السرطانية و / أو البقاء على قيد الحياة ، وبالتالي فهو ليس هدفا علاجيا صالحا.
تمت مواجهة العديد من هذه المشاكل في دراسة سابقة حاولت تحديد ما إذا كان مستقبلات التيروزين كيناز erbB4 هدفا علاجيا محتملا في خلايا MPNST5. في هذه الدراسات ، تم استخدام الفئران التي تعبر عن جين متحول يشفر عامل النمو الدبقي متساوي الشكل neuregulin-1 (NRG1) -β3 (GGFβ3) تحت سيطرة بروتين المايلين الخاص بخلية Schwann صفر المروج (P 0-GGFβ3 الفئران). تطور الفئران P 0-GGFβ3 أورام ليفية عصبية متعددة الشكل تتقدم لتصبح MPNSTs من خلال عملية تلخص عمليات التسبب في الورم العصبي الليفي وتطور الورم الليفي العصبي الضفيري - MPNST الذي شوهد في المرضى الذين يعانون من متلازمة قابلية الورم الجسدي المهيمن الورم العصبي من النوع 1 (NF1)6. عند عبورها إلى الفئران ذات طفرة فارغة Trp53 ، فإن P 0-GGFβ3 الناتجة ؛ Trp53 +/- الفئران تطوير MPNSTs de novo كما هو موضح في cis-Nf1+/-; Trp53+/- الفئران.
تلخص هذه ال MPNSTs التقدم من الصف الثاني لمنظمة الصحة العالمية (WHO) إلى آفات منظمة الصحة العالمية من الدرجة الرابعة التي شوهدت في البشر7. في الفئران P 0-GGFβ3 ، تنشأ MPNSTs داخل الأورام الليفية العصبية الضفيرية الموجودة مسبقا في العصب الثلاثي التوائم (58٪) وجذور العصب الظهري الشوكي (68٪)7 ؛ MPNSTs الناشئة في P 0-GGFβ3 ؛ Trp53 +/- الفئران لديها توزيع مماثل للغاية. في البشر ، تنشأ MPNSTs بشكل شائع في العصب الوركي تليها الضفيرة العضدية ، جذور الأعصاب الشوكية ، المبهمة ، الفخذية ، المتوسطة ، الضفيرة العجزية ، الحاجز المأبضي ، والأعصاب الظنبوبية والزندية الخلفية8. يختلف توزيع الورم هذا في نماذج GEM هذه إلى حد ما عما يشاهد في البشر. ومع ذلك ، فإن MPNSTs التي تنشأ في P 0-GGFβ3 و P0-GGFβ3 ؛ الفئران Trp53 +/- متطابقة من الناحية النسيجية مع MPNSTs البشرية ، وتحمل العديد من الطفرات نفسها التي شوهدت في MPNSTs البشرية ، وتلخص عملية تطور الورم العصبي الليفي - MPNST التي شوهدت في مرضى NF1. توليد P 0-GGFβ3 أو P0-GGFβ3 ؛ Trp53 +/- الفئران التي كانت Erbb4-/- لم تكن مجدية لأن الفئران التي لديها أليلين فارغين من Erbb4 تموت في الرحم في اليوم الجنيني 10.5 الثانوي لعيوب القلب9. لأن إنقاذ تعبير Erbb4 في القلب عن طريق إدخال جين Erbb4 الترانسجين الخاص بالقلب (سلسلة ثقيلة α-myosin (MHC)-Erbb4) ينتج عنه فئران Erbb4-/- قابلة للحياة10 ، جيل الفئران مع P 0-GGFβ3 معقد ؛ Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- تمت محاولة النمط الوراثي.
ومع ذلك ، فإن التزاوج لم ينتج الفئران بالنسب المندلية المتوقعة ، مما يشير إلى أن النمط الوراثي المطلوب كان ضارا. لذلك ، فإن توليد P 0-GGFβ3 ؛ تمت محاولة Trp53 +/- الفئران ذات الأليلات Erbb411 المفلطحة وبرنامج تشغيل CreERT2 للسماح بحذف Erbb4 في MPNSTs الناشئة في هذه الفئران. في هذه الحيوانات ، كانت العديد من الخلايا السرطانية ذات أليلات Erbb4 السليمة لا تزال موجودة (الفسيفساء). يمكن أن تنتج الفسيفساء التي لوحظت عن تسليم تاموكسيفين غير الفعال ، مما أدى إلى اختلافات في كفاءة إعادة التركيب داخل الأنسجة. يمكن أن تسهم إمكانية وجود آليات تعويضية عفوية في زيادة مساهمة الفسيفساء في إعادة التركيب بوساطة تاموكسيفين عن طريق تجاوز شرط التعبير Erbb4. من الممكن أن يؤدي فقدان Trp53 إلى جعل الخلايا السرطانية عرضة لمزيد من الطفرات "المتساهلة" التلقائية التي يمكن أن تربك تفسير البيانات. نظرا لأنه بدا من المحتمل أن تخفي خلايا MPNST السليمة من Erbb4 عواقب إزالة Erbb4 في الخلايا السرطانية الأخرى ، فقد تم التخلي عن هذا النهج.
أدت هذه العقبات إلى تطوير منهجية لاستئصال Erbb4 في خلايا MPNST في وقت مبكر جدا باستخدام فيروس غدي يعبر عن Cre recombinase و eGFP. يمكن فصل هذه الخلايا عن الخلايا غير المصابة باستخدام FACS، مما يقلل بشكل ملحوظ من الفسيفساء لجين Erbb4 الذي تم إزالته. أدناه ، يتم وصف الطرق المستخدمة لتحقيق ذلك ، جنبا إلى جنب مع الطرق المستخدمة لتقييم آثار الاستئصال الجيني في المختبر وفي الجسم الحي. البروتوكول التالي هو مثال على كيفية إنتاج الفئران الحاملة للورم التي تنتج أورام تحمل أليلات مفلطخة من الجينات القاتلة الجنينية ذات الأهمية لاستئصال خارج الجسم الحي قبل تقييم نمو الورم في الجسم الحي . يتضمن ذلك وصفا للنهج المستخدمة لتحليل التأثير الذي يمارسه استئصال Erbb4 على انتشار الخلايا السرطانية ، والبقاء على قيد الحياة ، والتعبير الجيني في المختبر والانتشار ، والبقاء على قيد الحياة ، وتكوين الأوعية الدموية في اللوغاريتات التقويمية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad5CMV-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad5CMVCre-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-1174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alexa 568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>GaR A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>http://www.bioconductor.org</td>
			<td>alternative statistical analysis tool used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td>mixture of chelators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)</td>
			<td>DAVID</td>
			<td>https://david.ncifcrf.gov</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>EP0701 and K1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab35374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HFR1: 05-1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeSpace Tools and Data Sources</td>
			<td>GenomeSpace</td>
			<td>https://genomespace.org/support/tools/</td>
			<td>general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice</td>
			<td>Envigo (Previously Harlan Labs)</td>
			<td>69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Hi Seq 2500</td>
			<td>DNA sequencer used for step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis</td>
			<td>DNAStar LaserGene software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software statistical and normalization analysis used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor basement membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRG1-beta</td>
			<td>In house</td>
			<td>Generated by SLC, also commercially available from R &#38; D Systems(396-HB-050/CF).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain Hoeschst 33342</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panther Gene Ontology Classification System</td>
			<td>Panther</td>
			<td>http://pantherdb.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partek (BWA aligner and analyzer)</td>
			<td>Partek, Ver 7</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment and statistical/normalization used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1: 5&#8242;-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT 
			GTCTG- 3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2: 5&#8242;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC 
			AGAAGC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Primer 3: 5&#8242;-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA 
			ACCCAG-3&#8242;
			</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 3: 350&#8201;bp wild-type ErbB4 product.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>51-351-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ARY003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9712</td>
			<td>bioluminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ToppGene Suite</td>
			<td>ToppGene</td>
			<td>https://toppgene.cchmc.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide Signal Amplification Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL721001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells

إن تطوير عقاقير جديدة تستهدف بدقة البروتينات الرئيسية في السرطانات البشرية يغير بشكل أساسي علاجات السرطان. ومع ذلك ، قبل استخدام هذه الأدوية ، يجب التحقق من صحة البروتينات المستهدفة كأهداف علاجية في أنواع محددة من السرطان. غالبا ما يتم إجراء هذا التحقق من الصحة عن طريق ضرب الجين الذي يشفر الهدف العلاجي المرشح في نموذج الفأر المعدل وراثيا (GEM) للسرطان وتحديد تأثير ذلك على نمو الورم. لسوء الحظ ، فإن القضايا التقنية مثل الفتك الجنيني في الضربات القاضية التقليدية والفسيفساء في الضربات القاضية المشروطة غالبا ما تحد من هذا النهج. للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير نهج لاستئصال جين قاتل جنيني مفلطخ يهتم بالثقافات قصيرة الأجل لأورام غمد الأعصاب الطرفية الخبيثة (MPNSTs) المتولدة في نموذج GEM.
تصف هذه الورقة كيفية إنشاء نموذج فأر بالنمط الوراثي المناسب ، واشتقاق مزارع الورم قصيرة الأجل من هذه الحيوانات ، ثم القضاء على الجين القاتل الجنيني المفلطح باستخدام ناقل فيروسي غدي يعبر عن Cre recombinase وبروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (eGFP). ثم يتم تفصيل تنقية الخلايا المحولة بالفيروس الغدي باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) وتحديد كمية التأثيرات التي يمارسها الاستئصال الجيني على الانتشار الخلوي ، والجدوى ، و transcriptome ، ونمو allograft التقويمي. توفر هذه المنهجيات نهجا فعالا وقابلا للتعميم لتحديد الأهداف العلاجية والتحقق من صحتها في المختبر وفي الجسم الحي. توفر هذه الأساليب أيضا مصدرا متجددا للخلايا المشتقة من الورم منخفض المرور مع انخفاض في القطع الأثرية للنمو في المختبر . وهذا يسمح بدراسة الدور البيولوجي للجين المستهدف في عمليات بيولوجية متنوعة مثل الهجرة والغزو والانبثاث والتواصل بين الخلايا بوساطة الإخفاق.

يوضح الشكل 4 نتيجة نموذجية تم الحصول عليها عند تحويل P 0-GGFβ3 ؛ Trp53-/+ ؛ خلايا Erbb4 fl / fl MPNST إما مع الفيروس الغدي Ad5CMV-eGFP أو الفيروس الغدي Ad5CMV-Cre / eGFP (الشكل 4A). يتم النظر إلى الثقافات باستخدام المجهر الفلوري لتحديد الخلايا المعبرة عن eGFP وبو?...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

هنا ، نقدم بروتوكولا لإجراء الضربات القاضية الجينية القاتلة جنينيا في الجسم الحي في الأورام المشتقة من نموذج الفئران المهندسة وراثيا ، ثم تقييم تأثير الضربة القاضية على نمو الورم ، والانتشار ، والبقاء على قيد الحياة ، والهجرة ، والغزو ، والنسخ في المختبر وفي الجسم الحي.

تحديد وظائف الجينات في تكوين الأورام عن طريق الاستئصال خارج الجسم الحي للأليلات المفلطحة في الخلايا السرطانية الخبيثة للغمد العصبي المحيطي

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

يوفر هذا البروتوكول طريقة بديلة في الجسم الحي لدراسة دور نمو الورم للضربة القاضية الجينية القاتلة الجنينية. ميزة هذه الطريقة هي أن الضربات القاضية الجينية التي عادة ما تكون قاتلة جنينيا يمكن إجراؤها في الأورام المستمدة من نموذج فأر مهندس وراثيا لدراسة فقدانها لتأثيرات الوظيفة في الجسم الحي. يمكن تطبيق هذه التقنية على الأمراض التي تتطلب دراسة الدور الحي للجينات الأساسية الجنينية التي لا يمكن تحقيقها من نماذج الفئران التقليدية بالضربة القاضية للجينات.يستغرق إنشاء النموذج الحيواني وقتا طويلا ويلزم إجراء اختبارات تجريبية لتحديد وزارة الداخلية المثلى للعدوى الفيروسية الغدية لضمان تحقيق إعادة التركيب المناسبة. بادئ ذي بدء ، حدد الماوس مع النمط الوراثي المطلوب. عندما يصل الفأر الحامل للورم إلى نقطة نهايته الإنسانية ، قم بالقتل الرحيم للفأر واستخدم سكين مشرط معقم لإزالة الورم.قم بتشريح الورم إلى ثلاثة أقسام في قطع على غرار رغيف الخبز باستخدام سكين مشرط لتوليد شرائح الأنسجة لتثبيت الفورمالين البارافين الذي يتضمن توليد ثقافة المرور المبكر والتجميد السريع للتحليلات التحليلية. قم بتلطيخ قسم أنسجة بسمك خمسة ميكرومترات من الفورمالين الثابت والبارافين مع الهيماتوكسيلين والإيوزين. بمجرد أن يؤكد أخصائي علم الأمراض الورم ، قم بإجراء تلطيخ المناعة النسيجية الكيميائية لتأكيد تشخيص الورم.ضع نسيج ورم غمد الأعصاب المحيطية الخبيث الذي تم جمعه حديثا في 10 ملليلتر من PBS المعقم على الجليد ، ثم انقله إلى منطقة عمل معقمة لإنشاء ثقافات مرور مبكرة. قم بطني أنسجة الورم إلى قطعتين إلى أربع ملليمترات وقم بترطيرها من ثماني إلى 10 مرات في طبق زراعة الأنسجة المعالج بمساحة 10 سنتيمترات مربعة يحتوي على 10 ملليلتر من وسط النمو. زراعة هذه الأنسجة في وسط نمو DMEM-10 عالي الجلوكوز مع استكمال 10 نانومولار نيوريجولين-1 بيتا واثنين من فورسكولين ميكرومولار.زرع الخلايا السرطانية التي تم تمريرها مبكرا بكثافة 1.5 مرة 10 إلى الخلايا السادسة لكل طبق واحد من 10 سنتيمترات مربعة من زراعة الأنسجة المعالجة يحتوي على وسط نمو DMEM-10. بعد 12 إلى 16 ساعة ، اغسل الثقافات الملتصقة باثنين إلى أربعة ملليلتر من DPBS ، وأصاب الخلايا بالفيروس الغدي بحوالي 400 وحدة لتشكيل اللويحات لكل خلية في 10 ملليلتر من DMEM الخالي من المصل. بعد 48 ساعة من العدوى ، تحقق لفترة وجيزة من الخلايا بحثا عن إشارة EGFP على المجهر الفلوري لضمان العدوى الفعالة بحوالي 50 إلى 100٪ من الخلايا الإيجابية ، ثم يقوم FACS بفرز الخلايا المصابة الإيجابية EGFP.بعد فرز FACS ، دع الخلايا تتعافى في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 24 إلى 48 ساعة على الأقل ، ثم قم بإعداد الخلايا للتحليلات القائمة على الخلايا في المختبر أو في التطعيم في الجسم الحي. تأكد من حذف Erbb4 عن طريق إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الحمض النووي الجينومي المعزول من جزء من الخلايا الإيجابية EGFP المفروزة. قم بإجراء اختبارات الانتشار على مدى الأيام السبعة التالية على الخلايا السرطانية المفروزة المطلية في صفيحة من 96 بئرا باستخدام مقياس خلوي آلي قائم على الصور.قم بتلطيخ الخلايا بالخطافات وأصباغ يوديد البروبيديوم والتقاط صور للخلايا باستخدام قارئ لوحة آلي لحساب عدد الخلايا الحية والميتة في كل بئر. عزل الحمض النووي الريبي الكلي من الخلايا السرطانية المفروزة باستخدام حمض الفينول القياسي جوانيدينيوم والطريقة القائمة على الكلوروفورم. افتح البرنامج لإجراء محاذاة تسلسل الحمض النووي الريبي باتباع الخطوات الخاصة بالبرنامج باستخدام الإعدادات الافتراضية.حدد طريقة التحليل، وابحث عن الحمض النووي الريبي، ثم حدد الجينوم المرجعي للماوس. قم بتحميل ملف BED إذا تم توفيره بواسطة نواة التسلسل. قم بتحميل ملفات تسلسل FASTQ وقم بتعيين أسماء نسخ متماثلة فريدة للملفات.تجميع النسخ المتماثل لملفات FASTQ وتعيين الملفات إلى مجموعة نسخ متماثل. للتحليل الإحصائي والتطبيع لتحديد إشارات التعبير الجيني التفاضلي ذات القوة الإحصائية القوية ، افتح برنامج التحليل وحدد ملفات GFP FASTQ كمجموعة بيانات التحكم. بعد ذلك ، حدد DESeq2 كطريقة إحصائية وتطبيع وابدأ التجميع والتحليل.استخدم مجموعات بيانات أنطولوجيا الجينات المدمجة في أدوات تحليل التخصيب الوظيفي المفتوح الوصول لإجراء تحليل التخصيب الوظيفي على DEG المحدد بوساطة Erbb4 ذات الأهمية الإحصائية لتحديد الأهمية البيولوجية والمسار لفقدان جين Erbb4. حقن الخلايا السرطانية في العصب الوركي للفأر المخدر لتقييم إمكانات نمو الألوغراف في الجسم الحي في الخلايا ما بعد المصابة. بمجرد أن يصل الورم إلى الحجم المطلوب ، قم بتشريح الورم من فأر القتل الرحيم في قسمين إلى ثلاثة أقسام كما هو موضح سابقا.إصلاح قسم واحد من الأنسجة في 4٪ بارافورمالدهيد بين عشية وضحاها، ومن ثم تضمين القسم الثابت في البارافين. بعد عمل مقاطع بسماكة خمسة ميكرومترات من أنسجة FFPE ، قم بتركيب القسم على الشرائح وتأكد من وجود خلايا سرطانية في الأنسجة المطعمة باستخدام H & E والتلطيخ المناعي كما هو موضح سابقا. لتأكيد الاختلافات في التعبير في الجسم الحي Erbb4 بين الحالتين التجريبيتين ، قم بتلطيخ الأنسجة الثابتة بالفورمالين والمدمجة في البارافين بأجسام مضادة خاصة ب Erbb4.تم تحليل نقل خلايا الأنسجة السرطانية الخبيثة للغمد العصبي المحيطي مع الفيروس الغدي. تم الكشف عن الخلايا المعبرة عن EGFP باستخدام المجهر الفلوري ، وتم تحديد العدد الإجمالي للخلايا باستخدام المجهر المتباين الطوري. بعد الاستئصال الجيني بوساطة Cre ، اعتمادا على كفاءة النقل ، أظهر النمط الجيني PCR ضربة قاضية جينية كاملة ومجموعة غير متجانسة من الخلايا المستحثة وغير المستحثة مقارنة بنقل التحكم.أظهرت الباثولوجيا النسيجية المميزة الموجودة في اللوغاريتبات العظمية لأنسجة ورم غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة مقارنة بالأورام المشتقة من النماذج الحيوانية الأصلية المهندسة وراثيا اختلافا في مورفولوجيا الخلية. أدى استئصال Erbb4 إلى تقليل الكثافة الخلوية والانتشار الخلوي في الخلايا المحولة إلى adeno5-CMV-Cre-ablated التي تتحكم في الخلايا المحولة إلى adeno5-CMV-GFP. تم تقليل التعبير عن Erbb4 في الخلايا السرطانية المنقولة مع adeno5-CMV-Cre ، أو فيروس EGFP ، في النتيجة في allografts adeno5-CMV-Cre المحولة مقارنة بأورام allograft المعالجة ب adeno5-CMV-EGFP.تم تقييم كثافة الأوعية الدموية عن طريق الكشف عن التفاعل المناعي ل CD31 ، وأظهرت النتائج التمثيلية انخفاضا ملحوظا في كثافة الأوعية الدموية في مجموعات من الخلايا المحولة إلى adeno5-CMV-Cre مقارنة بالخلايا المحولة إلى adeno5-CMV-EGFP. بعد الاستئصال الجيني ، يمكن استخدام الخلايا للعديد من الأنواع المختلفة من الفحوصات القائمة على الخلايا مثل الانتشار أو الهجرة أو نمو 3D أو تغيرات البيئة الدقيقة ، وكذلك للحقن التقويمي في الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

السابقين فيفو تصوير لمفاوية T CD8 المقيم في ورم الرئة البشرية شرائح باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

في فيفو تقييم الجيش الشعبي الثوري لدرجة الحموضة، فس2، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات الفوسفات والجلوتاثيون في "ورم المكروية"

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

نموذج عصب الوركي مورين في فيفو غزو Perineural

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

باراميكسوفيروسيس لاستهداف الورم المرباة: التصميم والتقييم السابقين فيفو

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

الكشف عن الوقت الحقيقي في المختبر ورم الخلايا المبرمج الناجمة عن CD8+ تي الخلايا لدراسة وظائف المناعة القمعية من التسلل إلى ورم الخلايا النقوي

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

في فيفو فحص المناعة للحويصلات خارج الخلية المشتقة من الورم عن طريق قياس التدفق الخلوي للخلايا التائية الطحالية

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

السابقين فيفو النموذج العضوي لحذف الجينات بوساطة الفيروس الغدي-Cre في خلايا الفأر البولية

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

زراعة وتصوير شرائح الورم المخاطي الكاذب البريتوني خارج الجسم الحي من عينات الورم البشري المقطوعة

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Genome-Scale Screening to Identify and Compare Therapeutic Targets in Tumors

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Finding New Therapeutic Targets for Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Through Genome-Scale shRNA Screens (Video) | JoVE

التنميط الجيني وفحص التسرب على نطاق الجينوم لتحديد الأهداف العلاجية في نماذج الفئران لورم غمد العصب المحيطي الخبيث

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...