Name: defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353, R01 NS109655), National Cancer Institute (R01 CA122804), Forsvarsministeriet (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 og W81XWH-15-1-0193) og The Children's Tumor Foundation (2014-04-001 og 2015-05-007).

Før der udføres procedurer med mus, skal alle procedurer gennemgås og godkendes af Institutional Animal Care and Use Committee. Protokollen beskrevet i dette manuskript blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Medical University of South Carolina. Denne protokol blev udført af korrekt uddannet personale efter MUSC's retningslinjer for institutionel dyrepleje.
1. Generation af mus, der udvikler MPNST'er homozygote til Erbb4 flox alleler...

<ol>
	<li>Ricciuti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates+for+lung+cancer+in+the+era+of+personalized+oncology.">Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology.</a> Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).</li><li>Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+axis+in+glioblastoma+multiforme.">PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).</li><li>Roskoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+FDA-approved+small+molecule+protein+kinase+inhibitors.">Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors.</a> Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).</li><li>Heffner, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+conditional+mouse+mutagenesis+with+a+comprehensive+cre+characterization+resource.">Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource.</a> Nature Communications. 3, 1218 (2012).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB4+promotes+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis+via+Ras-independent+mechanisms.">ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms.</a> Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).</li><li>Kazmi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+overexpressing+neuregulin-1+model+neurofibroma-malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+progression+and+implicate+specific+chromosomal+copy+number+variations+in+tumorigenesis.">Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).</li><li>Brosius, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+overexpression+and+Trp53+haploinsufficiency+cooperatively+promote+de+novo+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis.">Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis.</a> Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).</li><li>Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.+A+clinicopathologic+study+of+120+cases.">Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases.</a> Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).</li><li>Gassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+neural+and+cardiac+development+in+mice+lacking+the+ErbB4+neuregulin+receptor.">Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor.</a> Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).</li><li>Tidcombe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+and+mammary+gland+defects+in+ErbB4+knockout+mice+genetically+rescued+from+embryonic+lethality.">Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality.</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).</li><li>Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+characteristics+of+a+nervous+system-specific+erbB4+knock-out+mouse.">Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse.</a> Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).</li><li>Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+neuropathies+and+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+in+transgenic+mice+overexpressing+glial+growth+factor+beta3+in+myelinating+Schwann+cells.">Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells.</a> Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).</li><li>Jackson-Fisher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Neu/ErbB2-induced+mammary+tumors+is+unaffected+by+loss+of+ErbB4.">Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4.</a> Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).</li><li>Byer, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen+inhibits+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+growth+in+an+estrogen+receptor-independent+manner.">Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner.</a> Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+utility+of+SOX10+to+distinguish+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+from+synovial+sarcoma,+including+intraneural+synovial+sarcoma.">Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma.</a> Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genomic+characterization+of+a+sporadic+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+line.">Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cstf2t+regulates+expression+of+histones+and+histone-like+proteins+in+male+germ+cells.">Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells.</a> Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).</li><li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63,+MHC+class+1,+and+CD47+identify+subsets+of+extracellular+vesicles+containing+distinct+populations+of+noncoding+RNAs.">CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+promote+regenerative+growth+in+sensory+neurons.">Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normalization+and+differential+expression+analyses+using+RNA-Seq+data+from+726+individual+Drosophila+melanogaster.">Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 17, 28 (2016).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Huang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DAVID+Gene+Functional+Classification+Tool:+a+novel+biological+module-centric+algorithm+to+functionally+analyze+large+gene+lists.">The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists.</a> Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+map:+a+network-based+method+for+gene-set+enrichment+visualization+and+interpretation.">Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation.</a> PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).</li><li>Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+gene-set+enrichment+analysis+of+RNA-Seq+data+with+small+replicates.">Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates.</a> PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).</li><li>Koch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+analysis+of+RNA+sequencing+data.">A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).</li><li>Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+xenografting+of+human+luciferase-tagged+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells+for+in+vivo+testing+of+candidate+therapeutic+agents.">Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).</li><li>Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G*Power+3:+a+flexible+statistical+power+analysis+program+for+the+social,+behavioral,+and+biomedical+sciences.">G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences.</a> Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+the+embryonic+nerve+roots+for+NF1-associated+plexiform+neurofibroma.">Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma.</a> Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).</li><li>Mo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+neurofibroma+model+from+induced+pluripotent+stem+cells+delineates+tumor+pathogenesis+and+developmental+origins.">Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).</li><li>Chau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+therapeutic+efficacy+of+a+novel+pharmacologic+inducer+of+apoptosis+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.">Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).</li><li>Dodd, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF1(+/-)+Hematopoietic+cells+accelerate+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+development+without+altering+chemotherapy+response.">NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response.</a> Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).</li><li>Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+beta+and+neuregulin-1+alpha+differentially+affect+the+migration+and+invasion+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells.">Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells.</a> Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).</li></ol>

De detaljerede metoder, der præsenteres her, blev udviklet ved hjælp af en GEM-model af MPNST'er. Men hvis tumorvævet af interesse kan spredes i individuelle celler, kan disse metoder let tilpasses til forskellige tumortyper, der opstår i GEM'er. Det er vigtigt at sikre, at den floxede allel ikke resulterer i i) nedsat overlevelse, der kan gøre det vanskeligt at få tilstrækkelige mus til at screene for tumorer, eller ii) øget tumorlatens, der kan gøre det vanskeligt at opnå nok tumorbærende mus. Hvis den floxe...

Før de sidste to årtier var behandlingen af kræft hos mennesker stærkt afhængig af strålebehandling og kemoterapeutiske midler, der bredt målrettede hurtigt prolifererende cellulære populationer ved at beskadige DNA eller hæmme DNA-syntese. Selvom disse tilgange hæmmede kræftcellevækst, havde de også skadelige bivirkninger på normale hurtigt prolifererende celletyper såsom tarmepitelceller og hårfollikelceller. For nylig er kræftbehandling begyndt at anvende kemoterapeutiske midler, der præcist målretter proteiner inden for signalveje, der er kritisk vigtige for væksten af en individuel patients neoplasma. Denne tilgang, der almindeligvis omtales som "Præcisionsmedicin", har ført til udviklingen af et stadigt voksende repertoire af monoklonale antistoffer og små molekylære hæmmere. Disse midler hæmmer effektivt tumorcelleproliferation og overlevelse, samtidig med at man undgår de skadelige bivirkninger på normale celletyper, der ses med konventionelle kemoterapeutiske midler og strålebehandling. Monoklonale antistoffer, der anvendes til behandling af humane kræftformer, er oftest målrettet mod celleoverflademolekyler, såsom vækstfaktorreceptorer1 (f.eks. den store familie af membranspændende receptortyrososinkinaser) og immunresponsmodulatorer2 (f.eks. programmeret celledødsprotein 1, programmeret dødsligand 1). Små molekylære hæmmere kan hæmme enten celleoverfladeproteiner eller signalproteiner, der er placeret intracellulært3. For effektivt at anvende disse nye terapeutiske midler skal det imidlertid fastslås, at en bestemt kræft er afhængig af det molekyle, der målrettes af et kandidatterapeutisk middel.
Selvom disse nye terapeutiske midler har mere fokuserede virkninger, hæmmer mange af dem stadig virkningen af mere end et protein. Derudover er flere midler med varierende effektivitet og specificitet ofte tilgængelige for at målrette mod et specifikt protein. Derfor er det under prækliniske undersøgelser klogt at bruge yderligere tilgange såsom genetisk ablation til at validere et kandidatprotein som et terapeutisk mål. En særlig nyttig tilgang til validering af et protein som et terapeutisk mål er at ablate genet, der koder for kandidatproteinet i en genetisk manipuleret dyremodel, der udvikler den specifikke kræfttype af interesse. Denne tilgang kan være relativt ligetil, hvis mus med en nulmutation (enten en naturlig mutation, en genetisk manipuleret nulmutation [en "knockout"] eller en nulmutation introduceret af en genfælde) er tilgængelige, og musene er levedygtige i voksenalderen. Desværre er mus med en nulmutation, der opfylder disse kriterier, ofte ikke tilgængelige, typisk fordi nulmutationen resulterer i død embryonalt eller i de første dage af postnatalt liv. Under disse omstændigheder kan mus, der er tilbøjelige til at udvikle tumortypen af interesse, i stedet krydses til mus, hvor nøglesegmenter af genet af interesse er flankeret af loxP-steder ("floxed"), som gør det muligt at opløse genet ved at indføre et transgen, der udtrykker Cre-rekombinase i tumorcellerne (en betinget knockout). Denne tilgang giver flere fordele. For det første, hvis der er en Cre-driver tilgængelig, der udtrykkes i tumoren, men ikke i den celletype, der førte til døden i konventionelle knockouts, kan denne tilgang potentielt validere det kandidatterapeutiske mål. For det andet giver ablating af genet, der koder for kandidatproteinet i tumorceller, men ikke i andre intratumorale elementer, såsom tumorassocierede fibroblaster eller immunceller, investigator mulighed for at skelne mellem celleautonome og ikke-celle-autonome virkninger af det terapeutiske mål. Endelig giver en tamoxifen-inducerbar Cre-driver (CreERT2) investigator mulighed for at slette genet af interesse på forskellige stadier i tumorudvikling og definere det vindue, hvor det kandidatterapeutiske middel mest sandsynligt vil være effektivt.
Desværre er der også tekniske problemer, der kan begrænse brugen af betingede knockouts i tumorer, der opstår i GEM-modeller. For eksempel er en Cre-driver, der udtrykkes i tumorceller og undgår gensletning i normale celler, der er afgørende for livet, muligvis ikke tilgængelig. Et andet problem, som kan undervurderes, er, at Cre- og CreERT2-drivere ofte varierer floxede alleler hos mus, hvilket resulterer i mosaik for nulmutationen i en GEM-kræft. Når dette sker, vil tumorceller, hvor det målrettede gen ikke er blevet ablated, fortsætte med at formere sig hurtigt og overgroe tumorcellerne med ablerede alleler. Mosaicisme i Cre-driverlinjer kan forekomme på grund af ikke-allestedsnærværende Cre-udtryk i den målrettede slægt og ved mislykket rekombination i individuelle celler uafhængigt af Cre-ekspression4. Dette er et kendt fænomen af Cre-drivere, der er celletypeafhængige og bør overvejes under eksperimentelt design og datafortolkning. Mosaicisme kan maskere effekten af knockout og få en efterforsker til fejlagtigt at konkludere, at genet af interesse ikke er afgørende for tumorcelleproliferation og / eller overlevelse og derfor ikke er et gyldigt terapeutisk mål.
Flere af disse problemer blev stødt på i en tidligere undersøgelse, der forsøgte at afgøre, om receptor tyrosinkinase erbB4 var et potentielt terapeutisk mål i MPNST-celler5. I disse undersøgelser blev der anvendt mus, der udtrykker et transgen, der koder for neuregulin-1 (NRG1) isoform glial vækstfaktor-β3 (GGFβ3) under kontrol af Schwann-cellespecifik myelinprotein nulpromotor (P 0-GGFβ3 mus). P 0-GGFβ3 mus udvikler flere plexiforme neurofibromer, der udvikler sig til at blive MPNST'er via en proces, der rekapitulerer processerne for neurofibrom patogenese og plexiform neurofibroma-MPNST-progression set hos patienter med autosomal dominant tumorfølsomhed syndrom neurofibromatose type 1 (NF1)6. Når krydset til mus med en Trp53 null mutation, den resulterende P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus udvikler MPNSTs de novo som det ses i cis-Nf1+/-; Trp53+/- mus.
Disse MPNST'er rekapitulerer progressionen fra Verdenssundhedsorganisationens (WHO) klasse II til WHO klasse IV læsioner set hos mennesker7. I P 0-GGFβ3-mus opstår MPNST'er inden for allerede eksisterende plexiforme neurofibromer i trigeminusnerven (58%) og spinal dorsale nerverødder (68%)7; MPNST'erne, der opstår i P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus har en meget lignende fordeling. Hos mennesker opstår MPNST'er oftest i iskiasnerven efterfulgt af brachial plexus, spinal nerverødder, vagus, lårben, median, sacral plexus, popliteal obturator og posterior tibial og ulnar nerver8. Denne tumorfordeling i disse GEM-modeller er noget anderledes end hvad der ses hos mennesker. Imidlertid er MPNST'erne, der opstår i P 0-GGFβ3 og P0-GGFβ3; Trp53+/- mus er histologisk identiske med humane MPNST'er, bærer mange af de samme mutationer, der ses i humane MPNST'er, og rekapitulerer processen med neurofibrom-MPNST-progression set hos NF1-patienter. Dannelsen af P 0-GGFβ3 eller P0-GGFβ3; Trp53+/- mus, der var Erbb4-/- var ikke mulige, da mus med to Erbb4 null alleler dør i utero på embryonal dag 10,5 sekundært til hjertefejl9. Fordi redning af Erbb4-ekspression i hjertet ved at indføre et hjertespecifikt Erbb4-transgen (α-myosin tung kæde (MHC)-Erbb4) resulterer i levedygtige Erbb4-/- mus10, generationen af mus med en kompliceret P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- genotype blev forsøgt.
Parringerne producerede imidlertid ikke mus i de forventede Mendelske forhold, hvilket indikerer, at den ønskede genotype var skadelig. Derfor er dannelsen af P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus med floxede Erbb4-alleler 11 og en CreERT2-driver blev forsøgt at tillade sletning af Erbb4 i MPNST'erne, der opstod i disse mus. I disse dyr var der stadig mange tumorceller med intakte Erbb4-alleler (mosaicisme). Den observerede mosaicisme kunne skyldes ineffektiv tamoxifenlevering, hvilket resulterede i forskelle i rekombinationseffektivitet i vævet. Muligheden for spontane kompenserende mekanismer kan yderligere bidrage til mosaicisme i tamoxifen-medieret rekombination ved at omgå kravet om Erbb4-udtryk. Det er muligt, at tabet af Trp53 gør tumorceller modtagelige for yderligere spontane "tilladende" mutationer, der kan forvirre fortolkningen af dataene. Da det syntes sandsynligt, at de Erbb4-intakte MPNST-celler ville maskere konsekvenserne af at afvaske Erbb4 i andre tumorceller, blev denne tilgang opgivet.
Disse hindringer førte til udviklingen af en metode til ablating Af Erbb4 i meget tidlig passage MPNST-celler ved hjælp af et adenovirus, der udtrykker Cre-rekombinase og eGFP. Disse celler kan adskilles fra ikke-inficerede celler ved hjælp af FACS, hvilket markant reducerer mosaicisme for det ablerede Erbb4-gen . Nedenfor beskrives de metoder, der anvendes til at opnå dette, sammen med de metoder, der anvendes til at vurdere virkningerne af genablation in vitro og in vivo. Følgende protokol er et eksempel på, hvordan man producerer tumorbærende mus, der giver tumorer, der bærer floxede alleler af embryonale dødelige gener af interesse for ex vivo excision inden in vivo allograft tumorvækstvurdering. Dette inkluderer en beskrivelse af de tilgange, der anvendes til at analysere den effekt, som Erbb4-ablation udøver på tumorcelleproliferation, overlevelse og genekspression in vitro og proliferation, overlevelse og angiogenese i ortopiske allotransplantater.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad5CMV-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad5CMVCre-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-1174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alexa 568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>GaR A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>http://www.bioconductor.org</td>
			<td>alternative statistical analysis tool used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td>mixture of chelators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)</td>
			<td>DAVID</td>
			<td>https://david.ncifcrf.gov</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>EP0701 and K1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab35374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HFR1: 05-1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeSpace Tools and Data Sources</td>
			<td>GenomeSpace</td>
			<td>https://genomespace.org/support/tools/</td>
			<td>general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice</td>
			<td>Envigo (Previously Harlan Labs)</td>
			<td>69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Hi Seq 2500</td>
			<td>DNA sequencer used for step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis</td>
			<td>DNAStar LaserGene software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software statistical and normalization analysis used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor basement membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRG1-beta</td>
			<td>In house</td>
			<td>Generated by SLC, also commercially available from R &#38; D Systems(396-HB-050/CF).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain Hoeschst 33342</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panther Gene Ontology Classification System</td>
			<td>Panther</td>
			<td>http://pantherdb.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partek (BWA aligner and analyzer)</td>
			<td>Partek, Ver 7</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment and statistical/normalization used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1: 5&#8242;-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT 
			GTCTG- 3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2: 5&#8242;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC 
			AGAAGC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Primer 3: 5&#8242;-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA 
			ACCCAG-3&#8242;
			</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 3: 350&#8201;bp wild-type ErbB4 product.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>51-351-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ARY003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9712</td>
			<td>bioluminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ToppGene Suite</td>
			<td>ToppGene</td>
			<td>https://toppgene.cchmc.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide Signal Amplification Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL721001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells

Udviklingen af nye lægemidler, der præcist er målrettet nøgleproteiner i humane kræftformer, ændrer grundlæggende kræftbehandling. Men før disse lægemidler kan anvendes, skal deres målproteiner valideres som terapeutiske mål i specifikke kræfttyper. Denne validering udføres ofte ved at slå genet ud, der koder for det kandidatterapeutiske mål i en genetisk manipuleret mus (GEM) kræftmodel og bestemme, hvilken effekt dette har på tumorvækst. Desværre begrænser tekniske problemer som embryonal dødelighed i konventionelle knockouts og mosaicisme i betingede knockouts ofte denne tilgang. For at overvinde disse begrænsninger blev der udviklet en tilgang til ablating af et floxet embryonalt dødeligt gen af interesse i kortvarige kulturer af maligne perifere nerveskedetumorer (MPNST'er) genereret i en GEM-model.
Dette papir beskriver, hvordan man etablerer en musemodel med den passende genotype, udleder kortvarige tumorkulturer fra disse dyr og derefter ablaterer det floxede embryonale dødelige gen ved hjælp af en adenoviral vektor, der udtrykker Cre-rekombinase og forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP). Oprensning af celler transduceret med adenovirus ved anvendelse af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og kvantificeringen af de virkninger, som genablation udøver på cellulær proliferation, levedygtighed, transkriptomet og ortotopisk allograftvækst, beskrives derefter. Disse metoder giver en effektiv og generaliserbar tilgang til identifikation og validering af terapeutiske mål in vitro og in vivo. Disse tilgange giver også en vedvarende kilde til tumorafledte celler med lav passage med reducerede in vitro-vækstartefakter . Dette gør det muligt at studere den biologiske rolle af det målrettede gen i forskellige biologiske processer såsom migration, invasion, metastase og intercellulær kommunikation medieret af sekretomet.

Figur 4 illustrerer et typisk resultat opnået ved transducering af P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl MPNST-celler med enten Ad5CMV-eGFP adenovirus eller Ad5CMV-Cre/eGFP adenovirus (figur 4A). Kulturer ses med fluorescensmikroskopi for at identificere eGFP-ekspressive celler og ved fasekontrastmikroskopi for at bestemme det samlede antal celler, der er til stede i samme felt ved 10x (øverst) og 40x (nederst). Pr...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Her præsenterer vi en protokol til udførelse af gen knockouts, der er embryonale dødelige in vivo i genetisk manipulerede musemodelafledte tumorer og derefter vurdere den effekt, som knockout har på tumorvækst, proliferation, overlevelse, migration, invasion og transkriptomet in vitro og in vivo.

Definition af genfunktioner i tumorigenese ved Ex vivo Ablation af floxede alleler i maligne perifere nerveskede tumorceller

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Denne protokol giver en alternativ in vivo-metode til at studere tumorvækstrollen for en embryonal dødelig gen knockout. Fordelen ved denne metode er, at gen knockouts, der normalt er embryonale dødelige, kan udføres i tumorer afledt af en genetisk manipuleret musemodel for at studere deres tab af funktionseffekter in vivo. Denne teknik kan anvendes på sygdomme, der kræver undersøgelse af in vivo-rollen af embryonale essentielle gener, der ikke kan opnås fra traditionelle gen knockout-musemodeller.Generering af dyremodellen tager tid, og empirisk test er nødvendig for at bestemme den optimale MOI for adenoviral infektion for at sikre, at der opnås passende rekombination. Til at begynde med skal du identificere musen med den ønskede genotype. Når en tumorbærende mus når sit humane endepunkt, skal du aflive musen og bruge en steril skalpelkniv til at fjerne tumoren.Disseker tumoren i tre sektioner i brødbrødsagtige snit ved hjælp af en skalpelkniv til at generere vævssegmenterne til formalinfiksering paraffinindlejring af tidlig passagekulturgenerering og flashfrysning til analytiske analyser. Pletter en fem mikrometer tyk formalinfikseret, paraffinindlejret vævssektion med hæmatoxylin og eosin. Når en patolog bekræfter tumoren, skal du udføre den immunohistokemiske farvning for at bekræfte tumordiagnosen.Placer det friskopsamlede maligne perifere nerveskede tumorvæv i 10 ml iskold steril PBS på is, og overfør det derefter til et sterilt arbejdsområde for at etablere tidlige passagekulturer. Hak tumorvævet i to til fire millimeter stykker og triturat otte til 10 gange i en 10 kvadratcentimeter behandlet vævskulturskål indeholdende 10 ml vækstmedium. Kultur disse væv i høj glucose DMEM-10 vækstmedium suppleret med 10 nanomolar neuregulin-1 beta og to mikromolar forskolin.Frø de tidlige passagede tumorceller med en tæthed på 1,5 gange 10 til de sjette celler pr. En 10 kvadratcentimeter behandlet vævskulturskål indeholdende DMEM-10 vækstmedium. Efter 12 til 16 timer vaskes de vedhængende kulturer med to til fire milliliter DPBS og inficeres cellerne med adenovirus ved ca. 400 plaquedannende enheder pr. Celle i 10 ml serumfri DMEM. Efter 48 timers infektion skal du kort kontrollere cellerne for EGFP-signal på et fluorescensmikroskop for at sikre effektiv infektion med ca. 50 til 100% positive celler, og derefter sorterer FACS de EGFP-positive inficerede celler.Efter FACS-sortering skal cellerne komme sig i en vævskulturinkubator i mindst 24 til 48 timer og derefter forberede cellerne til in vitro-cellebaserede analyser eller in vivo-podning. Bekræft Erbb4-deletion ved at udføre PCR ved hjælp af genomisk DNA isoleret fra en del af de sorterede EGFP-positive celler. Udfør proliferationsassays i løbet af de næste syv dage på sorterede tumorceller belagt i en 96-brøndplade ved hjælp af et billedbaseret automatiseret cytometer.Pletter cellerne med kroge og propidiumiodidfarvestoffer, og tag billederne af cellerne ved hjælp af en automatiseret pladelæser for at tælle antallet af levende og døde celler i hver brønd. Isoler total RNA fra sorterede tumorceller ved anvendelse af standard syre guanidinium phenol og chloroformbaseret metode. Åbn softwaren for at udføre RNA-sekvensjusteringen ved at følge de programspecifikke trin ved hjælp af standardindstillingerne.Vælg analysemetoden, RNA-søgning, og vælg derefter musens referencegenom. Upload BED-filen, hvis den leveres af sekventeringskernen. Upload FASTQ-sekventeringsfilerne, og tildel unikke replikatnavne til filerne.Grupper replikere FASTQ-filerne, og angiv filerne til et replikatsæt. For den statistiske og normaliseringsanalyse for at identificere de differentielle genekspressionssignaler med robust statistisk effekt skal du åbne analysesoftwaren og vælge GFP FASTQ-filerne som kontroldatasæt. Vælg derefter DESeq2 som statistisk og normaliseringsmetode, og start samlingen og analysen.Brug genontologidatasættene integreret i open access funktionelle berigelsesanalyseværktøjer til at udføre den funktionelle berigelsesanalyse på den identificerede statistisk signifikante Erbb4-medierede DEG for at bestemme den biologiske og vejmæssige betydning af Erbb4-gentab. Injicer tumorcellerne i iskiasnerven hos den bedøvede mus for at vurdere in vivo allograftvækstpotentialet i postinficerede celler. Når tumoren når den krævede størrelse, dissekeres tumoren fra en aflivet mus i to-tre sektioner som tidligere demonstreret.Fix en vævssektion i 4%Paraformaldehyd natten over, og integrer derefter den faste sektion i paraffinen. Efter at have lavet fem mikrometer tykke sektioner fra FFPE-vævet, skal du montere sektionen på diasene og bekræfte tilstedeværelsen af tumorceller i det podede væv ved hjælp af H&E og immunostaining som tidligere demonstreret. For at bekræfte in vivo Erbb4-ekspressionsforskelle mellem de to eksperimentelle tilstande skal du plette det formalinfikserede, paraffinindlejrede væv med Erbb4-specifikke antistoffer.Transduktionen af de maligne perifere nerveskede tumorvævsceller med adenovirus blev analyseret. EGFP-ekspressionscellerne blev detekteret ved hjælp af fluorescensmikroskopi, og det samlede antal celler blev bestemt ved hjælp af fasekontrastmikroskopi. Efter den cre-medierede genablation, afhængigt af transfektionseffektiviteten, viste PCR-genotypningen en komplet gen knockout og en heterogen population af inducerede og uinducerede celler sammenlignet med kontroltransduktionen.Den karakteristiske histopatologi, der findes i de ortopiske allotransplantater af maligne perifere nerveskede tumorvæv sammenlignet med tumorerne afledt af de oprindelige genetisk manipulerede dyremodeller, viste en forskel i cellemorfologien. Erbb4-ablationen reducerede cellulær tæthed og cellulær proliferation i adeno5-CMV-Cre-ablated celler styrer adeno5-CMV-GFP-transducerede celler. Ekspressionen af Erbb4 i tumorcellerne transduceret med adeno5-CMV-Cre eller EGFP-virus blev nedsat i resultatet i adeno5-CMV-Cre transducerede allotranstrates sammenlignet med de kontrol adeno5-CMV-EGFP-behandlede allotransplanttumorer.Vaskulær densiteten blev vurderet via immunreaktivitetsdetektion for CD31, og de repræsentative resultater viste markant reduceret vaskulær densitet i allotransplantater af adeno5-CMV-Cre-transducerede celler sammenlignet med kontrol-adeno5-CMV-EGFP-transducerede celler. Efter genablation kan cellerne bruges til mange forskellige typer cellebaserede assays såsom proliferation, migration, 3D-vækst eller ændringer i mikromiljøet samt til in vivo ortotopiske injektioner.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Det<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginære Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantificering af genekspression og tumorindtrængen Brug Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Billeddannelse af hjemmehørende CD8 T-lymfocytter i menneskelige lunge Tumor skiver bruger konfokalmikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR vurdering af pH, pO2, Redox Status, og koncentrationen af fosfat og glutathion i Tumor mikromiljø

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

En In Vivo Murine iskiasnerven Model af Perineural Invasion

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirus for Tumor-målrettet Immunomodulation: Design og evaluering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid påvisning af i Vitro Tumor celle apoptose induceret af CD8+ T-celler til at studere immun suppressiv funktioner af Tumor infiltrerer myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Immunogenicitetsscreening af tumorafledte ekstracellulære vesikler ved flowcytometri af milt-T-celler

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoidmodel af adenovirus-cre-medierede gendeletninger i museurtelceller

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Kultur og billeddannelse af ex vivo organotypiske pseudomyxoma peritonei tumorskiver fra resekterede humane tumorprøver

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Genome-Scale Screening to Identify and Compare Therapeutic Targets in Tumors

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Finding New Therapeutic Targets for Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Through Genome-Scale shRNA Screens (Video) | JoVE

Genetisk profilering og genom-skala dropout screening for at identificere terapeutiske mål i musemodeller af ondartet perifer nerveskede tumor

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...