Name: defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353, R01 NS109655), het National Cancer Institute (R01 CA122804), het Ministerie van Defensie (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-1-1-0073 en W81XWH-15-1-0193) en The Children's Tumor Foundation (2014-04-001 en 2015-05-007).

Voordat u procedures met muizen uitvoert, moeten alle procedures worden beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee. Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Medical University of South Carolina. Dit protocol werd uitgevoerd door goed opgeleid personeel volgens de richtlijnen voor institutionele dierverzorging van MUSC.
1. Generatie muizen die MPNSTs homozygoot ontwikkelen voo...

<ol>
	<li>Ricciuti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates+for+lung+cancer+in+the+era+of+personalized+oncology.">Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology.</a> Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).</li><li>Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+axis+in+glioblastoma+multiforme.">PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).</li><li>Roskoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+FDA-approved+small+molecule+protein+kinase+inhibitors.">Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors.</a> Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).</li><li>Heffner, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+conditional+mouse+mutagenesis+with+a+comprehensive+cre+characterization+resource.">Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource.</a> Nature Communications. 3, 1218 (2012).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB4+promotes+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis+via+Ras-independent+mechanisms.">ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms.</a> Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).</li><li>Kazmi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+overexpressing+neuregulin-1+model+neurofibroma-malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+progression+and+implicate+specific+chromosomal+copy+number+variations+in+tumorigenesis.">Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).</li><li>Brosius, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+overexpression+and+Trp53+haploinsufficiency+cooperatively+promote+de+novo+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis.">Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis.</a> Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).</li><li>Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.+A+clinicopathologic+study+of+120+cases.">Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases.</a> Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).</li><li>Gassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+neural+and+cardiac+development+in+mice+lacking+the+ErbB4+neuregulin+receptor.">Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor.</a> Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).</li><li>Tidcombe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+and+mammary+gland+defects+in+ErbB4+knockout+mice+genetically+rescued+from+embryonic+lethality.">Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality.</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).</li><li>Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+characteristics+of+a+nervous+system-specific+erbB4+knock-out+mouse.">Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse.</a> Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).</li><li>Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+neuropathies+and+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+in+transgenic+mice+overexpressing+glial+growth+factor+beta3+in+myelinating+Schwann+cells.">Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells.</a> Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).</li><li>Jackson-Fisher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Neu/ErbB2-induced+mammary+tumors+is+unaffected+by+loss+of+ErbB4.">Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4.</a> Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).</li><li>Byer, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen+inhibits+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+growth+in+an+estrogen+receptor-independent+manner.">Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner.</a> Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+utility+of+SOX10+to+distinguish+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+from+synovial+sarcoma,+including+intraneural+synovial+sarcoma.">Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma.</a> Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genomic+characterization+of+a+sporadic+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+line.">Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cstf2t+regulates+expression+of+histones+and+histone-like+proteins+in+male+germ+cells.">Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells.</a> Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).</li><li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63,+MHC+class+1,+and+CD47+identify+subsets+of+extracellular+vesicles+containing+distinct+populations+of+noncoding+RNAs.">CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+promote+regenerative+growth+in+sensory+neurons.">Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normalization+and+differential+expression+analyses+using+RNA-Seq+data+from+726+individual+Drosophila+melanogaster.">Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 17, 28 (2016).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Huang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DAVID+Gene+Functional+Classification+Tool:+a+novel+biological+module-centric+algorithm+to+functionally+analyze+large+gene+lists.">The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists.</a> Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+map:+a+network-based+method+for+gene-set+enrichment+visualization+and+interpretation.">Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation.</a> PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).</li><li>Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+gene-set+enrichment+analysis+of+RNA-Seq+data+with+small+replicates.">Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates.</a> PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).</li><li>Koch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+analysis+of+RNA+sequencing+data.">A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).</li><li>Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+xenografting+of+human+luciferase-tagged+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells+for+in+vivo+testing+of+candidate+therapeutic+agents.">Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).</li><li>Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G*Power+3:+a+flexible+statistical+power+analysis+program+for+the+social,+behavioral,+and+biomedical+sciences.">G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences.</a> Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+the+embryonic+nerve+roots+for+NF1-associated+plexiform+neurofibroma.">Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma.</a> Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).</li><li>Mo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+neurofibroma+model+from+induced+pluripotent+stem+cells+delineates+tumor+pathogenesis+and+developmental+origins.">Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).</li><li>Chau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+therapeutic+efficacy+of+a+novel+pharmacologic+inducer+of+apoptosis+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.">Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).</li><li>Dodd, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF1(+/-)+Hematopoietic+cells+accelerate+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+development+without+altering+chemotherapy+response.">NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response.</a> Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).</li><li>Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+beta+and+neuregulin-1+alpha+differentially+affect+the+migration+and+invasion+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells.">Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells.</a> Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).</li></ol>

De hier gepresenteerde gedetailleerde methoden zijn ontwikkeld met behulp van een GEM-model van MPNST's. Als het tumorweefsel van belang echter kan worden verspreid in individuele cellen, zijn deze methoden gemakkelijk aan te passen voor verschillende tumortypen die in GEMs ontstaan. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het gevlochten allel niet resulteert in i) verminderde overleving die het moeilijk kan maken om voldoende muizen te verkrijgen om te screenen op tumoren, of ii) verhoogde tumorlatentie die het moeili...

Vóór de laatste twee decennia was de behandeling van menselijke kankers sterk afhankelijk van radiotherapie en chemotherapeutische middelen die zich breed richtten op snel woekerende cellulaire populaties door DNA te beschadigen of DNA-synthese te remmen. Hoewel deze benaderingen de groei van kankercellen remden, hadden ze ook schadelijke bijwerkingen op normale snel prolifererende celtypen zoals intestinale epitheelcellen en haarfollikelcellen. Meer recent is kankertherapie begonnen met het gebruik van chemotherapeutische middelen die zich precies richten op eiwitten binnen signaalroutes die van cruciaal belang zijn voor de groei van het neoplasma van een individuele patiënt. Deze aanpak, gewoonlijk aangeduid als "Precision Medicine", heeft geleid tot de ontwikkeling van een steeds groter wordend repertoire van monoklonale antilichamen en kleine moleculaire remmers. Deze middelen remmen effectief de proliferatie en overleving van tumorcellen, terwijl ze de schadelijke bijwerkingen op normale celtypen vermijden die worden gezien met conventionele chemotherapeutische middelen en radiotherapie. Monoklonale antilichamen die worden gebruikt voor de behandeling van menselijke kankers richten zich meestal op celoppervlakmoleculen zoals groeifactorreceptoren1 (bijv. de grote familie van membraanoverspannende receptor tyrosinekinasen) en immuunresponsmodulatoren2 (bijv. geprogrammeerd celdoodeiwit 1, geprogrammeerd doodsligand 1). Kleine moleculaire remmers kunnen celoppervlakeiwitten of signaaleiwitten remmen die zich intracellulair bevinden3. Om deze nieuwe therapeutische middelen effectief te gebruiken, moet echter worden vastgesteld dat een bepaalde kanker afhankelijk is van het molecuul dat het doelwit is van een kandidaat-therapeutisch middel.
Hoewel deze nieuwe therapeutische middelen meer gerichte effecten hebben, remmen veel van hen nog steeds de werking van meer dan één eiwit. Bovendien zijn er vaak meerdere middelen met verschillende effectiviteit en specificiteit beschikbaar om zich op een specifiek eiwit te richten. Daarom is het tijdens preklinisch onderzoek verstandig om aanvullende benaderingen zoals genetische ablatie te gebruiken om een kandidaat-eiwit als therapeutisch doelwit te valideren. Een bijzonder nuttige benadering voor het valideren van een eiwit als een therapeutisch doelwit is om het gen dat codeert voor het kandidaat-eiwit af te breken in een genetisch gemanipuleerd diermodel dat het specifieke type kankerinteresse ontwikkelt. Deze aanpak kan relatief eenvoudig zijn als muizen met een nulmutatie (ofwel een natuurlijke mutatie, een genetisch gemanipuleerde nulmutatie [een "knock-out"], of een nulmutatie geïntroduceerd door een genenval) beschikbaar zijn en de muizen levensvatbaar zijn in de volwassenheid. Helaas zijn muizen met een nulmutatie die aan deze criteria voldoen vaak niet beschikbaar, meestal omdat de nulmutatie embryonaal of in de eerste dagen van het postnatale leven resulteert in de dood. In deze omstandigheid kunnen muizen die vatbaar zijn voor het ontwikkelen van het tumortype van interesse in plaats daarvan worden gekruist met muizen waarin belangrijke segmenten van het gen van belang worden geflankeerd door loxP-sites ("floxed"), waardoor het gen kan worden gelateld door een transgen te introduceren dat Cre-recombinase tot expressie brengt in de tumorcellen (een voorwaardelijke knock-out). Deze aanpak biedt verschillende voordelen. Ten eerste, als er een Cre-driver beschikbaar is die tot expressie komt in de tumor, maar niet in het celtype dat tot de dood heeft geleid in conventionele knock-outs, kan deze aanpak mogelijk het kandidaat-therapeutische doelwit valideren. Ten tweede stelt het aborteren van het gen dat codeert voor het kandidaat-eiwit in tumorcellen, maar niet in andere intratumorale elementen zoals tumor-geassocieerde fibroblasten of immuuncellen, de onderzoeker in staat om onderscheid te maken tussen cel-autonome en niet-cel-autonome effecten van het therapeutische doelwit. Ten slotte stelt een tamoxifen-induceerbare Cre-driver (CreERT2) de onderzoeker in staat om het gen van belang in verschillende stadia van tumorontwikkeling te verwijderen en het venster te definiëren waarin het kandidaat-therapeutische middel het meest waarschijnlijk effectief is.
Helaas zijn er ook technische problemen die het gebruik van voorwaardelijke knock-outs in tumoren die ontstaan in GEM-modellen kunnen beperken. Een Cre-driver die bijvoorbeeld tot expressie komt in tumorcellen en gendeletie in normale cellen die essentieel zijn voor het leven vermijdt, is mogelijk niet beschikbaar. Een ander probleem, dat misschien wordt onderschat, is dat Cre- en CreERT2-drivers vaak variabel floxed allelen bij muizen aborteren, wat resulteert in mozaïcisme voor de nulmutatie in een GEM-kanker. Wanneer dit gebeurt, zullen tumorcellen waarin het beoogde gen niet is geableerd, zich snel blijven vermenigvuldigen en de tumorcellen overwoekeren met geableerde allelen. Mozaïcisme in Cre-driverlijnen kan optreden als gevolg van niet-alomtegenwoordige Cre-expressie in de beoogde afstamming en door mislukte recombinatie in individuele cellen onafhankelijk van Cre-expressie4. Dit is een bekend fenomeen van Cre-drivers dat afhankelijk is van het celtype en waarmee rekening moet worden gehouden tijdens experimenteel ontwerp en gegevensinterpretatie. Mozaïcisme kan het effect van de knock-out maskeren en ertoe leiden dat een onderzoeker ten onrechte concludeert dat het gen van belang niet essentieel is voor de proliferatie en / of overleving van tumorcellen en dus geen geldig therapeutisch doelwit is.
Verschillende van deze problemen werden aangetroffen in een eerdere studie die probeerde te bepalen of de receptor tyrosinekinase erbB4 een potentieel therapeutisch doelwit was in MPNST-cellen5. In deze studies werden muizen gebruikt die een transgen tot expressie brengen dat codeert voor de neureguline-1 (NRG1) isoforme gliagroeifactor-β3 (GGFβ3) onder controle van de Schwann-celspecifieke myeline-eiwit nulpromotor (P 0-GGFβ3-muizen). P 0-GGFβ3-muizen ontwikkelen multipele plexiforme neurofibromen die zich ontwikkelen tot MPNT's via een proces dat de processen van neurofibromapathogenese en plexiforme neurofibroma-MPNST-progressie recapituuleert die wordt gezien bij patiënten met het autosomaal dominante tumorgevoeligheidssyndroom neurofibromatose type 1 (NF1)6. Bij kruising met muizen met een Trp53 null-mutatie, de resulterende P 0-GGFβ3; Trp53+/- muizen ontwikkelen MPNSTs de novo zoals wordt gezien bij cis-Nf1+/-; Trp53+/- muizen.
Deze MPNT's recapituleren de progressie van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) graad II naar WHO graad IV laesies gezien bij mensen7. Bij P 0-GGFβ3-muizen ontstaan MPNST's binnen reeds bestaande plexiforme neurofibromen in de trigeminuszenuw (58%) en spinale dorsale zenuwwortels (68%)7; de MPNST's die in P 0-GGFβ3 voorkomen; Trp53+/- muizen hebben een zeer vergelijkbare verdeling. Bij mensen komen MPNST's meestal voor in de heupzenuw, gevolgd door de brachiale plexus, spinale zenuwwortels, vagus, femorale, mediane, sacrale plexus, popliteale obturator en achterste tibiale en ulnaire zenuwen8. Deze tumorverdeling in deze GEM-modellen is enigszins anders dan wat bij mensen wordt gezien. Echter, de MPNST's die ontstaan in P 0-GGFβ3 en P0-GGFβ3; Trp53+/- muizen zijn histologisch identiek aan menselijke MPNST's, dragen veel van dezelfde mutaties als in menselijke MPNST's en recapituleren het proces van neurofibroma-MPNST-progressie dat wordt gezien bij NF1-patiënten. De generatie van P 0-GGFβ3 of P0-GGFβ3; Trp53+/- muizen die Erbb4-/- waren, was niet haalbaar omdat muizen met twee Erbb4 nul-allelen sterven in utero op embryonale dag 10,5 secundair aan hartafwijkingen9. Omdat het redden van Erbb4-expressie in het hart door het introduceren van een hartspecifiek Erbb4-transgen (α-myosine zware keten (MHC)-Erbb4) resulteert in levensvatbare Erbb4-/- muizen10, de generatie muizen met een gecompliceerde P0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- genotype werd geprobeerd.
De paringen produceerden echter geen muizen in de verwachte Mendeliaanse verhoudingen, wat aangeeft dat het gewenste genotype schadelijk was. Daarom de generatie van P 0-GGFβ3; Trp53+/- muizen met gevlokte Erbb4-allelen 11 en een CreERT2-driver werd geprobeerd de deletie van Erbb4 in de MPNGT's die bij deze muizen ontstaan toe te staan. Bij deze dieren waren nog talrijke tumorcellen met intacte Erbb4-allelen aanwezig (mozaïcisme). Het waargenomen mozaïcisme kan het gevolg zijn van inefficiënte tamoxifenafgifte, wat resulteerde in verschillen in recombinatie-efficiëntie in het weefsel. De mogelijkheid van spontane compenserende mechanismen zou verder kunnen bijdragen aan mozaïcisme in tamoxifen-gemedieerde recombinatie door de vereiste voor Erbb4-expressie te omzeilen. Het is mogelijk dat het verlies van Trp53 tumorcellen vatbaar maakt voor extra spontane "permissieve" mutaties die de interpretatie van de gegevens kunnen verwarren. Omdat het waarschijnlijk leek dat de Erbb4-intacte MPNST-cellen de gevolgen van het aborteren van Erbb4 in andere tumorcellen zouden maskeren, werd deze aanpak verlaten.
Deze obstakels leidden tot de ontwikkeling van een methodologie voor het aborteren van Erbb4 in mpnst-cellen met een adenovirus dat Cre-recombinase en eGFP tot expressie brengt. Deze cellen kunnen worden gescheiden van niet-geïnfecteerde cellen met behulp van FACS, wat het mozaïcisme voor het ablated Erbb4-gen aanzienlijk vermindert. Hieronder worden de methoden beschreven die worden gebruikt om dit te bereiken, samen met de methoden die worden gebruikt om de effecten van genablatie in vitro en in vivo te beoordelen. Het volgende protocol is een voorbeeld van het produceren van tumordragende muizen die tumoren opleveren met gevlokte allelen van embryonale letale genen die van belang zijn voor ex vivo excisie voorafgaand aan in vivo allograft tumorgroeibeoordeling. Dit omvat een beschrijving van de benaderingen die worden gebruikt om het effect te analyseren dat Erbb4-ablatie uitoefent op tumorcelproliferatie, overleving en genexpressie in vitro en proliferatie, overleving en angiogenese bij orthotopische allografts.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad5CMV-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad5CMVCre-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-1174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alexa 568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>GaR A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>http://www.bioconductor.org</td>
			<td>alternative statistical analysis tool used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td>mixture of chelators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)</td>
			<td>DAVID</td>
			<td>https://david.ncifcrf.gov</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>EP0701 and K1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab35374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HFR1: 05-1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeSpace Tools and Data Sources</td>
			<td>GenomeSpace</td>
			<td>https://genomespace.org/support/tools/</td>
			<td>general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice</td>
			<td>Envigo (Previously Harlan Labs)</td>
			<td>69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Hi Seq 2500</td>
			<td>DNA sequencer used for step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis</td>
			<td>DNAStar LaserGene software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software statistical and normalization analysis used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor basement membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRG1-beta</td>
			<td>In house</td>
			<td>Generated by SLC, also commercially available from R &#38; D Systems(396-HB-050/CF).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain Hoeschst 33342</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panther Gene Ontology Classification System</td>
			<td>Panther</td>
			<td>http://pantherdb.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partek (BWA aligner and analyzer)</td>
			<td>Partek, Ver 7</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment and statistical/normalization used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1: 5&#8242;-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT 
			GTCTG- 3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2: 5&#8242;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC 
			AGAAGC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Primer 3: 5&#8242;-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA 
			ACCCAG-3&#8242;
			</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 3: 350&#8201;bp wild-type ErbB4 product.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>51-351-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ARY003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9712</td>
			<td>bioluminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ToppGene Suite</td>
			<td>ToppGene</td>
			<td>https://toppgene.cchmc.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide Signal Amplification Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL721001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells

De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen die zich precies richten op belangrijke eiwitten in menselijke kankers, verandert fundamenteel de kankertherapieën. Voordat deze geneesmiddelen echter kunnen worden gebruikt, moeten hun doeleiwitten worden gevalideerd als therapeutische doelen in specifieke kankertypen. Deze validatie wordt vaak uitgevoerd door het gen dat codeert voor het kandidaat-therapeutische doelwit uit te schakelen in een genetisch gemanipuleerd muismodel (GEM) van kanker en te bepalen welk effect dit heeft op tumorgroei. Helaas beperken technische problemen zoals embryonale letaliteit in conventionele knock-outs en mozaïcisme in voorwaardelijke knock-outs deze aanpak vaak. Om deze beperkingen te overwinnen, werd een benadering ontwikkeld voor het aborteren van een gevlokt embryonaal dodelijk gen van belang in kortetermijnculturen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren (MPNST's) gegenereerd in een GEM-model.
Dit artikel beschrijft hoe een muismodel met het juiste genotype kan worden vastgesteld, tumorculturen op korte termijn van deze dieren kunnen worden afgeleid en vervolgens het gevloste embryonale letale gen kan worden afgezwakt met behulp van een adenovirale vector die Cre-recombinase en verbeterd groen fluorescerend eiwit (eGFP) tot expressie brengt. Zuivering van cellen getransduceerd met adenovirus met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en de kwantificering van de effecten die genablatie uitoefent op cellulaire proliferatie, levensvatbaarheid, het transcriptoom en orthotopische allograftgroei wordt vervolgens gedetailleerd beschreven. Deze methodologieën bieden een effectieve en generaliseerbare benadering voor het identificeren en valideren van therapeutische doelen in vitro en in vivo. Deze benaderingen bieden ook een hernieuwbare bron van tumor-afgeleide cellen met een lage passage met verminderde in vitro groeiartefacten. Hierdoor kan de biologische rol van het beoogde gen worden bestudeerd in diverse biologische processen zoals migratie, invasie, metastase en intercellulaire communicatie gemedieerd door het secretoom.

Figuur 4 illustreert een typisch resultaat dat wordt verkregen bij het transduceren van P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl MPNST-cellen met het Ad5CMV-eGFP adenovirus of Ad5CMV-Cre/eGFP adenovirus (figuur 4A). Culturen worden bekeken met fluorescentiemicroscopie om eGFP-expressiecellen te identificeren en door fasecontrastmicroscopie om het totale aantal cellen in hetzelfde veld te bepalen op 10x (boven) en 40x (o...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van gen knock-outs die embryonaal dodelijk zijn in vivo in genetisch gemanipuleerde muismodel-afgeleide tumoren en vervolgens het effect beoordelen dat de knock-out heeft op tumorgroei, proliferatie, overleving, migratie, invasie en het transcriptoom in vitro en in vivo.

Het definiëren van genfuncties in tumorigenese door ex vivo ablatie van gevlochten allelen in kwaadaardige perifere zenuwschedetumorcellen

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Dit protocol biedt een alternatieve in vivo methode om de tumorgroeirol van een embryonale letale gen knock-out te bestuderen. Het voordeel van deze methode is dat gen knock-outs die normaal embryonaal dodelijk zijn, kunnen worden uitgevoerd in tumoren die zijn afgeleid van een genetisch gemanipuleerd muismodel om hun verlies van functie-effecten in vivo te bestuderen. Deze techniek kan worden toegepast op ziekten die het bestuderen van de in vivo rol van embryonale essentiële genen vereisen die onbereikbaar zijn van traditionele gen knock-out muismodellen.Het genereren van het diermodel kost tijd en empirische tests zijn nodig om de optimale MOI voor adenovirale infectie te bepalen om ervoor te zorgen dat de juiste recombinatie wordt bereikt. Identificeer om te beginnen de muis met het gewenste genotype. Wanneer een tumordragende muis zijn humane eindpunt bereikt, euthanaseert u de muis en gebruikt u een steriel scalpelmes om de tumor te verwijderen.Ontleed de tumor in drie secties in broodbroodachtige sneden met behulp van een scalpelmes om de weefselsegmenten te genereren voor formalinefixatieparaffine die vroege passagecultuurgeneratie insluit en flash freezing voor analytische analyses. Kleur een vijf micrometer dikke formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsectie met hematoxyline en eosine. Zodra een patholoog de tumor bevestigt, voert u de immunohistochemische kleuring uit om de tumordiagnose te bevestigen.Plaats het vers verzamelde kwaadaardige perifere zenuwschedetumorweefsel in 10 milliliter ijskoude steriele PBS op ijs en breng het vervolgens over naar een steriel werkgebied om vroege passageculturen vast te stellen. Gehakt het tumorweefsel in stukjes van twee tot vier millimeter en triturate acht tot 10 keer in een behandelde weefselkweekschaal van 10 vierkante centimeter met 10 milliliter groeimedium. Kweek deze weefsels in hoog glucose DMEM-10 groeimedium aangevuld met 10 nanomoleculaire neureguline-1 bèta en twee micromolaire forskoline.Zaai de vroeg gepasseerde tumorcellen met een dichtheid van 1,5 keer 10 tot de zesde cellen per één behandelde weefselkweekschaal van 10 vierkante centimeter die DMEM-10 groeimedium bevat. Was na 12 tot 16 uur de aanhangende culturen met twee tot vier milliliter DPBS en infecteer de cellen met adenovirus met ongeveer 400 plaquevormende eenheden per cel in 10 milliliter serumvrije DMEM. Controleer na 48 uur van de infectie kort de cellen op egfp-signaal op een fluorescentiemicroscoop om een efficiënte infectie met ongeveer 50 tot 100% positieve cellen te garanderen, en vervolgens sorteert FACS de EGFP-positieve geïnfecteerde cellen.Laat de cellen na FACS-sortering gedurende ten minste 24 tot 48 uur herstellen in een weefselkweekincubator en bereid de cellen vervolgens voor op in vitro cel gebaseerde analyses of in vivo transplantatie. Bevestig Erbb4-deletie door PCR uit te voeren met behulp van genomisch DNA geïsoleerd uit een deel van de gesorteerde EGFP-positieve cellen. Voer de proliferatietests in de komende zeven dagen uit op gesorteerde tumorcellen die zijn geplateerd in een 96-well-plaat met behulp van een op afbeeldingen gebaseerde geautomatiseerde cytometer.Kleur de cellen met haken en propidiumjodidekleurstoffen en leg de afbeeldingen van de cellen vast met behulp van een geautomatiseerde platenlezer om het aantal levende en dode cellen in elke put te tellen. Isoleer totaal RNA uit gesorteerde tumorcellen met behulp van standaardzuur guanidiniumfenol en op chloroform gebaseerde methode. Open de software om de uitlijning van de RNA-sequentie uit te voeren volgens de programmaspecifieke stappen met behulp van de standaardinstellingen.Selecteer de analysemethode, RNA-zoekopdracht en selecteer vervolgens het muisreferentiegenoom. Upload het BED-bestand indien opgegeven door de sequencingkern. Upload de FASTQ-sequencingbestanden en wijs unieke replicatienamen toe aan de bestanden.Groepeer de FASTQ-bestanden en wijs de bestanden toe aan een replicatieset. Voor de statistische en normalisatieanalyse om de differentiële genexpressiesignalen met robuuste statistische kracht te identificeren, opent u de analysesoftware en selecteert u de GFP FASTQ-bestanden als de controlegegevensset. Selecteer vervolgens DESeq2 als de statistische en normalisatiemethode en start de assemblage en analyse.Gebruik de genontologiegegevenssets die zijn geïntegreerd in de open access functionele verrijkingsanalysetools om de functionele verrijkingsanalyse uit te voeren op de geïdentificeerd statistisch significante Erbb4-gemedieerde DEG om de biologische en pathway-significantie van Erbb4-genverlies te bepalen. Injecteer de tumorcellen in de heupzenuw van de verdoofde muis om het in vivo allograftgroeipotentieel in post-geïnfecteerde cellen te beoordelen. Zodra de tumor de vereiste grootte heeft bereikt, ontleedt u de tumor van een geëuthanaseerde muis in twee-drie secties zoals eerder aangetoond.Fixeer een weefselsectie 's nachts in 4% Paraformaldehyde en integreer vervolgens het vaste gedeelte in de paraffine. Na het maken van vijf micrometer dikke secties van het FFPE-weefsel, monteer de sectie op de dia's en bevestig de aanwezigheid van tumorcellen in het getransplanteerde weefsel met behulp van H &E en immunostaining zoals eerder aangetoond. Om in vivo Erbb4-expressieverschillen tussen de twee experimentele omstandigheden te bevestigen, kleurt u het formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde weefsel met Erbb4-specifieke antilichamen.De transductie van de kwaadaardige perifere zenuwschede tumorweefselcellen met adenovirus werd geanalyseerd. De EGFP-expressiecellen werden gedetecteerd met behulp van fluorescentiemicroscopie en het totale aantal cellen werd bepaald met behulp van fasecontrastmicroscopie. Na de Cre-gemedieerde genablatie vertoonde de PCR-genotypering, afhankelijk van de transfectie-efficiëntie, een volledige gen knock-out en een heterogene populatie van geïnduceerde en niet-geïnduceerde cellen in vergelijking met de controletransductie.De karakteristieke histopathologie gevonden in de orthotopische allograften van kwaadaardige perifere zenuwschede tumorweefsels in vergelijking met de tumoren afgeleid van de oorspronkelijke genetisch gemanipuleerde diermodellen toonde een verschil in de celmorfologie. De Erbb4-ablatie verminderde de cellulaire dichtheid en cellulaire proliferatie in adeno5-CMV-Cre-ablated cellen controleren adeno5-CMV-GFP-getransduceerde cellen. De expressie van Erbb4 in de tumorcellen getransduceerd met adeno5-CMV-Cre, of EGFP-virus, was verminderd in het resultaat in adeno5-CMV-Cre getransduceerde allografts in vergelijking met de controle adeno5-CMV-EGFP-behandelde allografttumoren.De vasculaire dichtheid werd beoordeeld via immunoreactiviteitsdetectie voor CD31 en de representatieve resultaten toonden een duidelijk verminderde vasculaire dichtheid in allografts van adeno5-CMV-Cre-getransduceerde cellen in vergelijking met de controle-adeno5-CMV-EGFP-getransduceerde cellen. Na genablatie kunnen de cellen worden gebruikt voor veel verschillende soorten celgebaseerde testen, zoals proliferatie, migratie, 3D-groei of veranderingen in de micro-omgeving, evenals voor in vivo orthotopische injecties.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Beeldvorming van Resident CD8 T lymfocyten in menselijke longen Tumor plakjes met behulp van confocale microscopie

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR beoordeling van pH, pO2, Redox Status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

Een In Vivo lymfkliertest Ischiaszenuw Model van Perineural invasie

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Immunogeniciteitsscreening van tumor-afgeleide extracellulaire blaasjes door flowcytometrie van milt-T-cellen

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoïde model van Adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizen urotheelcellen

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Cultuur en beeldvorming van ex vivo organotypische pseudomyxoma peritonei tumorplakken van gereseceerde menselijke tumorspecimens

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Genome-Scale Screening to Identify and Compare Therapeutic Targets in Tumors

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Finding New Therapeutic Targets for Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Through Genome-Scale shRNA Screens (Video) | JoVE

Genetische profilering en drop-outscreening op genoomschaal om therapeutische doelen te identificeren in muismodellen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...