Name: defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux (R01 NS048353, R01 NS109655), du National Cancer Institute (R01 CA122804), du ministère de la Défense (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 et W81XWH-15-1-0193) et de la Children’s Tumor Foundation (2014-04-001 et 2015-05-007).

Avant d’effectuer des procédures avec des souris, toutes les procédures doivent être examinées et approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux en établissement. Le protocole décrit dans ce manuscrit a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Caroline du Sud. Ce protocole a été exécuté par du personnel dûment formé conformément aux directives de soins aux animaux en établissement du MUSC.
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Les méthodes détaillées présentées ici ont été développées à l’aide d’un modèle GEM de MPNST. Cependant, si le tissu tumoral d’intérêt peut être dispersé dans des cellules individuelles, ces méthodologies sont facilement adaptables à divers types de tumeurs survenant dans les GEM. Il est important de s’assurer que l’allèle floxé n’entraîne pas i) une diminution de la survie qui peut rendre difficile l’obtention de suffisamment de souris pour dépister les tumeurs, ou ii) une latence tumo...

Avant les deux dernières décennies, le traitement des cancers humains reposait fortement sur la radiothérapie et les agents chimiothérapeutiques qui ciblaient largement les populations cellulaires proliférant rapidement en endommageant l’ADN ou en inhibant la synthèse de l’ADN. Bien que ces approches aient inhibé la croissance des cellules cancéreuses, elles ont également eu des effets secondaires délétères sur des types cellulaires normaux qui prolifèrent rapidement, tels que les cellules épithéliales intestinales et les cellules du follicule pileux. Plus récemment, le traitement du cancer a commencé à utiliser des agents chimiothérapeutiques qui ciblent précisément les protéines dans les voies de signalisation qui sont d’une importance cruciale pour la croissance du néoplasme d’un patient individuel. Cette approche, communément appelée « médecine de précision », a conduit au développement d’un répertoire sans cesse croissant d’anticorps monoclonaux et de petits inhibiteurs moléculaires. Ces agents inhibent efficacement la prolifération et la survie des cellules tumorales tout en évitant les effets secondaires délétères sur les types de cellules normales observés avec les agents chimiothérapeutiques conventionnels et la radiothérapie. Les anticorps monoclonaux utilisés pour le traitement des cancers humains ciblent le plus souvent des molécules de surface cellulaire telles que les récepteurs du facteur de croissance1 (p. ex., la grande famille des tyrosine kinases du récepteur membranaire) et les modulateurs de la réponse immunitaire2 (p. ex., protéine de mort cellulaire programmée 1, ligand de mort programmé 1). Les petits inhibiteurs moléculaires peuvent inhiber soit les protéines de surface cellulaire, soit les protéines de signalisation situées intracellulairement3. Cependant, pour utiliser efficacement ces nouveaux agents thérapeutiques, il faut établir qu’un cancer particulier dépend de la molécule ciblée par un agent thérapeutique candidat.
Bien que ces nouveaux agents thérapeutiques aient des effets plus ciblés, beaucoup d’entre eux inhibent encore l’action de plus d’une protéine. De plus, plusieurs agents avec une efficacité et une spécificité variables sont souvent disponibles pour cibler une protéine spécifique. Par conséquent, lors des investigations précliniques, il est judicieux d’utiliser des approches supplémentaires telles que l’ablation génétique pour valider une protéine candidate comme cible thérapeutique. Une approche particulièrement utile pour valider une protéine en tant que cible thérapeutique consiste à ablation du gène codant pour la protéine candidate dans un modèle animal génétiquement modifié qui développe le type de cancer spécifique d’intérêt. Cette approche peut être relativement simple si des souris porteuses d’une mutation nulle (soit une mutation naturelle, une mutation nulle génétiquement modifiée [un « knockout»], ou une mutation nulle introduite par un piège génétique) sont disponibles et que les souris sont viables à l’âge adulte. Malheureusement, les souris avec une mutation nulle qui répondent à ces critères ne sont souvent pas disponibles, généralement parce que la mutation nulle entraîne la mort embryonnaire ou dans les premiers jours de la vie postnatale. Dans cette circonstance, les souris sujettes à développer le type de tumeur d’intérêt peuvent plutôt être croisées avec des souris dans lesquelles des segments clés du gène d’intérêt sont flanqués de sites loxP (« floxed »), ce qui permet au gène d’être ablée en introduisant un transgène exprimant la Cre recombinase dans les cellules tumorales (un knockout conditionnel). Cette approche offre plusieurs avantages. Tout d’abord, si un pilote de Cre est disponible qui est exprimé dans la tumeur mais pas dans le type de cellule qui a conduit à la mort dans les knockouts conventionnels, cette approche peut potentiellement valider la cible thérapeutique candidate. Deuxièmement, l’ablation du gène codant pour la protéine candidate dans les cellules tumorales mais pas dans d’autres éléments intratumoraux tels que les fibroblastes associés à la tumeur ou les cellules immunitaires permet à l’investigateur de distinguer les effets autonomes cellulaires et non autonomes de la cible thérapeutique. Enfin, un pilote cre inductible au tamoxifène (CreERT2) permet à l’investigateur de supprimer le gène d’intérêt à différents stades du développement tumoral et de définir la fenêtre dans laquelle l’agent thérapeutique candidat est le plus susceptible d’être efficace.
Malheureusement, il existe également des problèmes techniques qui peuvent limiter l’utilisation de knockouts conditionnels dans les tumeurs survenant dans les modèles GEM. Par exemple, un facteur cre qui est exprimé dans les cellules tumorales et évite la délétion de gènes dans les cellules normales essentielles à la vie peut ne pas être disponible. Un autre problème, qui peut être sous-estimé, est que les pilotes Cre et CreERT2 ablatent souvent de manière variable les allèles floxés chez la souris, ce qui entraîne un mosaïcisme pour la mutation nulle dans un cancer GEM. Lorsque cela se produit, les cellules tumorales dans lesquelles le gène ciblé n’a pas été ablation continueront à proliférer rapidement, envahissant les cellules tumorales avec des allèles ablés. Le mosaïcisme dans les lignes pilotes de Cre peut se produire en raison de l’expression non omniprésente de Cre dans la lignée ciblée et par l’échec de la recombinaison dans des cellules individuelles indépendantes de l’expression de Cre4. Il s’agit d’un phénomène connu des facteurs de Cre qui dépend du type cellulaire et doit être pris en compte lors de la conception expérimentale et de l’interprétation des données. Le mosaïcisme peut masquer l’effet de l’assommage et amener un chercheur à conclure à tort que le gène d’intérêt n’est pas essentiel à la prolifération et/ou à la survie des cellules tumorales et n’est donc pas une cible thérapeutique valide.
Plusieurs de ces problèmes ont été rencontrés dans une étude précédente qui tentait de déterminer si le récepteur tyrosine kinase erbB4 était une cible thérapeutique potentielle dans les cellules MPNST5. Dans ces études, des souris ont été utilisées qui expriment un transgène codant pour le facteur de croissance gliale isoforme neuréguline-1 (NRG1) β3 (GGFβ3) sous le contrôle du promoteur zéro de la protéine de myéline spécifique à la cellule de Schwann (souris P 0-GGFβ3). Les souris P 0-GGFβ3 développent plusieurs neurofibromes plexiformes qui progressent pour devenir des MPNST via un processus qui récapitule les processus de pathogenèse du neurofibrome et de progression du neurofibrome plexiforme-MPNST observé chez les patients atteints du syndrome de susceptibilité tumorale autosomique dominante neurofibromatose de type 1 (NF1)6. Lorsqu’il est croisé avec des souris avec une mutation nulle Trp53, le P 0-GGFβ3 résultant; Les souris Trp53+/- développent des MPNST de novo comme on le voit dans cis-Nf1+/-; Trp53+/- souris.
Ces MPNST récapitulent la progression des lésions de grade II de l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) aux lésions de grade IV de l’OMS observées chez l’homme7. Chez les souris P 0-GGFβ3, les MPNST apparaissent dans les neurofibromes plexiformes préexistants dans le nerf trijumeau (58%) et les racines du nerf dorsal spinal (68%)7; les MPNST apparaissant dans P 0-GGFβ3; Les souris Trp53+/- ont une distribution très similaire. Chez l’homme, les MPNST surviennent le plus souvent dans le nerf sciatique, suivi du plexus brachial, des racines du nerf spinal, du vagus, du fémur, de la médiane, du plexus sacré, de l’obturateur poplité et des nerfs tibia et ulnaire postérieurs8. Cette distribution tumorale dans ces modèles GEM est quelque peu différente de ce qui est vu chez l’homme. Cependant, les MPNST qui apparaissent dans P 0-GGFβ3 et P0-GGFβ3; Les souris Trp53+/- sont histologiquement identiques aux MPNST humains, portent bon nombre des mêmes mutations observées chez les MPNST humains et récapitulent le processus de progression du neurofibrome-MPNST observé chez les patients NF1. La génération de P 0-GGFβ3 ou P0-GGFβ3; Trp53+/- souris qui étaient Erbb4-/- n’était pas faisable car les souris avec deux allèles nuls Erbb4 meurent in utero au jour embryonnaire 10,5 secondaire à des malformations cardiaques9. Parce que sauver l’expression d’Erbb4 dans le cœur en introduisant un transgène Erbb4 spécifique au cœur (chaîne lourde α-myosine (CMH)-Erbb4) donne des souris Erbb4-/- viables 10, la génération de souris avec un P 0-GGFβ3 compliqué; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Le génotype Erbb4-/- a été tenté.
Cependant, les accouplements n’ont pas produit de souris dans les rapports mendéliens attendus, ce qui indique que le génotype souhaité était délétère. Par conséquent, la génération de P 0-GGFβ3; Des souris Trp53+/- avec des allèles Erbb4 floxés 11 et un pilote CreERT2 ont été tentées pour permettre la suppression d’Erbb4 dans les MPNST survenant chez ces souris. Chez ces animaux, de nombreuses cellules tumorales avec des allèles Erbb4 intacts étaient encore présentes (mosaïcisme). Le mosaïcisme observé pourrait résulter d’un apport inefficace de tamoxifène, ce qui a entraîné des différences dans l’efficacité de la recombinaison dans le tissu. La possibilité de mécanismes compensatoires spontanés pourrait contribuer davantage au mosaïcisme dans la recombinaison médiée par le tamoxifène en contournant l’exigence d’expression d’Erbb4. Il est possible que la perte de Trp53 rende les cellules tumorales sensibles à d’autres mutations spontanées « permissives » qui pourraient confondre l’interprétation des données. Comme il semblait probable que les cellules MPNST intactes d’Erbb4 masqueraient les conséquences de l’ablation d’Erbb4 dans d’autres cellules tumorales, cette approche a été abandonnée.
Ces obstacles ont conduit au développement d’une méthodologie pour ablation d’Erbb4 dans les cellules MPNST à passage très précoce à l’aide d’un adénovirus exprimant la Cre recombinase et l’eGFP. Ces cellules peuvent être séparées des cellules non infectées à l’aide de FACS, ce qui réduit considérablement le mosaïcisme du gène Erbb4 ablée. Ci-dessous, les méthodes utilisées pour y parvenir, ainsi que les méthodes utilisées pour évaluer les effets de l’ablation génique in vitro et in vivo, sont décrites. Le protocole suivant est un exemple de la façon de produire des souris porteuses de tumeurs qui produisent des tumeurs portant des allèles floxés de gènes létaux embryonnaires d’intérêt pour l’excision ex vivo avant l’évaluation de la croissance tumorale par allogreffe in vivo . Cela comprend une description des approches utilisées pour analyser l’effet que l’ablation d’Erbb4 exerce sur la prolifération des cellules tumorales, la survie et l’expression des gènes in vitro et la prolifération, la survie et l’angiogenèse dans les allogreffes orthotopiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad5CMV-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad5CMVCre-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-1174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alexa 568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>GaR A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>http://www.bioconductor.org</td>
			<td>alternative statistical analysis tool used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td>mixture of chelators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)</td>
			<td>DAVID</td>
			<td>https://david.ncifcrf.gov</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>EP0701 and K1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab35374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HFR1: 05-1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeSpace Tools and Data Sources</td>
			<td>GenomeSpace</td>
			<td>https://genomespace.org/support/tools/</td>
			<td>general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice</td>
			<td>Envigo (Previously Harlan Labs)</td>
			<td>69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Hi Seq 2500</td>
			<td>DNA sequencer used for step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis</td>
			<td>DNAStar LaserGene software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software statistical and normalization analysis used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor basement membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRG1-beta</td>
			<td>In house</td>
			<td>Generated by SLC, also commercially available from R &#38; D Systems(396-HB-050/CF).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain Hoeschst 33342</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panther Gene Ontology Classification System</td>
			<td>Panther</td>
			<td>http://pantherdb.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partek (BWA aligner and analyzer)</td>
			<td>Partek, Ver 7</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment and statistical/normalization used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1: 5&#8242;-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT 
			GTCTG- 3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2: 5&#8242;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC 
			AGAAGC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Primer 3: 5&#8242;-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA 
			ACCCAG-3&#8242;
			</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 3: 350&#8201;bp wild-type ErbB4 product.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>51-351-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ARY003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9712</td>
			<td>bioluminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ToppGene Suite</td>
			<td>ToppGene</td>
			<td>https://toppgene.cchmc.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide Signal Amplification Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL721001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells

Le développement de nouveaux médicaments qui ciblent précisément les protéines clés dans les cancers humains modifie fondamentalement les thérapies anticancéreuses. Cependant, avant que ces médicaments puissent être utilisés, leurs protéines cibles doivent être validées en tant que cibles thérapeutiques dans des types de cancer spécifiques. Cette validation est souvent effectuée en éliminant le gène codant pour la cible thérapeutique candidate dans un modèle de cancer de souris génétiquement modifiée (GEM) et en déterminant l’effet que cela a sur la croissance tumorale. Malheureusement, des problèmes techniques tels que la létalité embryonnaire dans les knockouts conventionnels et le mosaïcisme dans les knockouts conditionnels limitent souvent cette approche. Pour surmonter ces limites, une approche d’ablation d’un gène létal embryonnaire floxé d’intérêt dans des cultures à court terme de tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique (MPNST) générées dans un modèle GEM a été développée.
Cet article décrit comment établir un modèle murin avec le génotype approprié, dériver des cultures tumorales à court terme de ces animaux, puis ablation du gène létal embryonnaire floxé à l’aide d’un vecteur adénoviral qui exprime la Cre recombinase et la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP). La purification des cellules transduites avec l’adénovirus à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et la quantification des effets que l’ablation génique exerce sur la prolifération cellulaire, la viabilité, le transcriptome et la croissance de l’allogreffe orthotopique sont ensuite détaillées. Ces méthodologies fournissent une approche efficace et généralisable pour identifier et valider des cibles thérapeutiques in vitro et in vivo. Ces approches fournissent également une source renouvelable de cellules dérivées de tumeurs à faible passage avec des artefacts de croissance in vitro réduits. Cela permet d’étudier le rôle biologique du gène ciblé dans divers processus biologiques tels que la migration, l’invasion, les métastases et la communication intercellulaire médiée par le sécrétome.

La figure 4 illustre un résultat typique obtenu lors de la transduction de P 0-GGFβ3 ; Trp53-/+; Cellules MPNST Erbb4fl/fl avec l’adénovirus Ad5CMV-eGFP ou l’adénovirus Ad5CMV-Cre/eGFP (Figure 4A). Les cultures sont visualisées par microscopie à fluorescence pour identifier les cellules exprimant l’eGFP et par microscopie à contraste de phase pour déterminer le nombre total de cellules présentes d...

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Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Ici, nous présentons un protocole pour effectuer des knockouts génétiques qui sont létaux embryonnaires in vivo dans des tumeurs génétiquement modifiées dérivées de modèles murins, puis évaluer l’effet que le knockout a sur la croissance tumorale, la prolifération, la survie, la migration, l’invasion et le transcriptome in vitro et in vivo.

Définition des fonctions géniques dans la tumorigenèse par ablation ex vivo d’allèles floxés dans des cellules tumorales malignes de la gaine nerveuse périphérique

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Ce protocole fournit une méthode alternative in vivo pour étudier le rôle de croissance tumorale d’un gène embryonnaire létal knockout. L’avantage de cette méthode est que des knockouts de gènes qui sont normalement létaux embryonnaires peuvent être effectués dans des tumeurs dérivées d’un modèle murin génétiquement modifié pour étudier leurs effets de perte de fonction in vivo. Cette technique peut être appliquée à des maladies qui nécessitent d’étudier le rôle in vivo de gènes essentiels embryonnaires inaccessibles à partir de modèles murins traditionnels de gènes knockout.La génération du modèle animal prend du temps et des tests empiriques sont nécessaires pour déterminer la MOI optimale pour l’infection adénovirale afin de s’assurer qu’une recombinaison appropriée est réalisée. Pour commencer, identifiez la souris avec le génotype souhaité. Lorsqu’une souris porteuse de tumeur atteint son point d’extrémité humain, euthanasiez la souris et utilisez un couteau à scalpel stérile pour enlever la tumeur.Disséquez la tumeur en trois sections dans des coupes de type pain à l’aide d’un couteau à scalpel pour générer les segments tissulaires pour la fixation du formol en intégrant la génération de culture de passage précoce et la congélation éclair pour les analyses analytiques. Tacher une section de tissu fixée au formol de cinq micromètres et incorporée à la paraffine avec de l’hématoxyline et de l’éosine. Une fois qu’un pathologiste confirme la tumeur, effectuez la coloration immunohistochimique pour confirmer le diagnostic de la tumeur.Placez le tissu tumoral de la gaine nerveuse périphérique maligne fraîchement collecté dans 10 millilitres de PBS stérile glacé sur de la glace, puis transférez-le dans une zone de travail stérile pour établir des cultures de passage précoce. Hacher le tissu tumoral en morceaux de deux à quatre millimètres et triturer huit à 10 fois dans une boîte de culture tissulaire traitée de 10 centimètres carrés contenant 10 millilitres de milieu de croissance. Cultivez ces tissus dans un milieu de croissance DMEM-10 à haute teneur en glucose complété par 10 nanomolaires neuréguline-1 bêta et deux forskolines micromolaires.Ensemencez les cellules tumorales à passage précoce à une densité de 1,5 fois 10 à la sixième cellule par boîte de culture tissulaire traitée de 10 centimètres carrés contenant un milieu de croissance DMEM-10. Après 12 à 16 heures, laver les cultures adhérentes avec deux à quatre millilitres de DPBS et infecter les cellules avec un adénovirus à environ 400 unités formant de la plaque par cellule dans 10 millilitres de DMEM sans sérum. Après 48 heures de l’infection, vérifiez brièvement les cellules pour le signal EGFP sur un microscope à fluorescence pour assurer une infection efficace avec environ 50 à 100% de cellules positives, puis FACS trier les cellules infectées EGFP-positives.Après le tri FACS, laissez les cellules récupérer dans un incubateur de culture tissulaire pendant au moins 24 à 48 heures, puis préparez les cellules pour des analyses cellulaires in vitro ou une greffe in vivo. Confirmer la délétion d’Erbb4 en effectuant une PCR à l’aide d’ADN génomique isolé d’une partie des cellules EGFP positives triées. Effectuer les tests de prolifération au cours des sept prochains jours sur des cellules tumorales triées plaquées dans une plaque de 96 puits à l’aide d’un cytomètre automatisé basé sur l’image.Colorez les cellules avec des crochets et des colorants à l’iodure de propidium et capturez les images des cellules à l’aide d’un lecteur de plaques automatisé pour compter le nombre de cellules vivantes et mortes dans chaque puits. Isolez l’ARN total à partir de cellules tumorales triées en utilisant la méthode standard à base de guanidinium phénol et de chloroforme. Ouvrez le logiciel pour effectuer l’alignement de la séquence d’ARN en suivant les étapes spécifiques au programme à l’aide des paramètres par défaut.Sélectionnez la méthode d’analyse, recherche d’ARN, puis sélectionnez le génome de référence de la souris. Téléchargez le fichier BED s’il en fournit un par le noyau de séquençage. Téléchargez les fichiers de séquençage FASTQ et attribuez des noms de réplication uniques aux fichiers.Regroupez la réplication des fichiers FASTQ et désignez les fichiers dans un jeu de réplication. Pour l’analyse statistique et de normalisation afin d’identifier les signaux d’expression génique différentielle avec une puissance statistique robuste, ouvrez le logiciel d’analyse et sélectionnez les fichiers GFP FASTQ comme ensemble de données de contrôle. Ensuite, sélectionnez DESeq2 comme méthode statistique et de normalisation et démarrez l’assemblage et l’analyse.Utilisez les ensembles de données d’ontologie génique intégrés dans les outils d’analyse de l’enrichissement fonctionnel en libre accès pour effectuer l’analyse de l’enrichissement fonctionnel sur le DEG identifié statistiquement significatif médié par Erbb4 afin de déterminer la signification biologique et la signification de la voie de la perte du gène Erbb4. Injecter les cellules tumorales dans le nerf sciatique de la souris anesthésiée pour évaluer le potentiel de croissance de l’allogreffe in vivo dans les cellules post-infectées. Une fois que la tumeur atteint la taille requise, disséquez la tumeur d’une souris euthanasiée en deux-trois sections comme démontré précédemment.Fixez une section de tissu dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit, puis incorporez la section fixe dans la paraffine. Après avoir fait des sections de cinq micromètres d’épaisseur à partir du tissu FFPE, montez la section sur les lames et confirmez la présence de cellules tumorales dans le tissu greffé en utilisant H & E et immunocoloration comme démontré précédemment. Pour confirmer in vivo les différences d’expression d’Erbb4 entre les deux conditions expérimentales, colorez le tissu fixé au formol et incorporé à la paraffine avec des anticorps spécifiques à Erbb4.La transduction des cellules du tissu tumoral de la gaine nerveuse périphérique maligne avec l’adénovirus a été analysée. Les cellules exprimant l’EGFP ont été détectées à l’aide de la microscopie à fluorescence et le nombre total de cellules a été déterminé à l’aide de la microscopie à contraste de phase. Après l’ablation du gène à médiation Cre, en fonction de l’efficacité de la transfection, le génotypage par PCR a montré un knockout complet du gène et une population hétérogène de cellules induites et non induites par rapport à la transduction témoin.L’histopathologie caractéristique trouvée dans les allogreffes orthotopiques des tissus tumoraux malins de la gaine nerveuse périphérique par rapport aux tumeurs dérivées des modèles animaux génétiquement modifiés originaux a démontré une différence dans la morphologie cellulaire. L’ablation d’Erbb4 a diminué la densité cellulaire et la prolifération cellulaire dans les cellules adéno5-CMV-créblées contrôlent les cellules transduites adéno5-CMV-GFP. L’expression d’Erbb4 dans les cellules tumorales transduites avec l’adéno5-CMV-Cre, ou virus EGFP, a diminué dans le résultat des allogreffes transduites adéno5-CMV-Cre par rapport aux tumeurs allogreffes traitées par adéno-CMV-EGFP de contrôle.La densité vasculaire a été évaluée par détection d’immunoréactivité pour CD31, et les résultats représentatifs ont montré une densité vasculaire nettement réduite dans les allogreffes de cellules transduites adéno5-CMV-Cre par rapport aux cellules adéno5-CMV-EGFP-transduites témoins. Après l’ablation génique, les cellules peuvent être utilisées pour de nombreux types de tests cellulaires tels que la prolifération, la migration, la croissance 3D ou les altérations du microenvironnement, ainsi que pour des injections orthotopiques in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

le<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l&#39;expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

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Détection en temps réel de dans l’apoptose des cellules tumorales in Vitro induite par CD8+ T Cells pour étudier les fonctions immunitaires de suppresseurs de tumeur-infiltration de cellules myéloïdes

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Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture et imagerie de tranches tumorales organotypiques ex vivo de pseudomyxomes péritonei à partir de spécimens tumoraux humains réséqués

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Genome-Scale Screening to Identify and Compare Therapeutic Targets in Tumors

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Finding New Therapeutic Targets for Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Through Genome-Scale shRNA Screens (Video) | JoVE

Profilage génétique et criblage de décrochage à l’échelle du génome pour identifier des cibles thérapeutiques dans des modèles murins de tumeur maligne de la gaine nerveuse périphérique

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...