Name: defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00
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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353, R01 NS109655), des National Cancer Institute (R01 CA122804), des Verteidigungsministeriums (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 und W81XWH-15-1-0193) und der Children's Tumor Foundation (2014-04-001 und 2015-05-007) unterstützt.

Vor der Durchführung von Verfahren mit Mäusen müssen alle Verfahren vom Institutional Animal Care and Use Committee überprüft und genehmigt werden. Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Medical University of South Carolina genehmigt. Dieses Protokoll wurde von ordnungsgemäß geschultem Personal gemäß den institutionellen Tierpflegerichtlinien von MUSC durchgeführt.
1. Generierung von Mäusen, die MPNSTs homozygot für <...

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	<li>Ricciuti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates+for+lung+cancer+in+the+era+of+personalized+oncology.">Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology.</a> Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).</li><li>Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+axis+in+glioblastoma+multiforme.">PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).</li><li>Roskoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+FDA-approved+small+molecule+protein+kinase+inhibitors.">Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors.</a> Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).</li><li>Heffner, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+conditional+mouse+mutagenesis+with+a+comprehensive+cre+characterization+resource.">Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource.</a> Nature Communications. 3, 1218 (2012).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB4+promotes+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis+via+Ras-independent+mechanisms.">ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms.</a> Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).</li><li>Kazmi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+overexpressing+neuregulin-1+model+neurofibroma-malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+progression+and+implicate+specific+chromosomal+copy+number+variations+in+tumorigenesis.">Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).</li><li>Brosius, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+overexpression+and+Trp53+haploinsufficiency+cooperatively+promote+de+novo+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis.">Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis.</a> Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).</li><li>Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.+A+clinicopathologic+study+of+120+cases.">Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases.</a> Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).</li><li>Gassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+neural+and+cardiac+development+in+mice+lacking+the+ErbB4+neuregulin+receptor.">Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor.</a> Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).</li><li>Tidcombe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+and+mammary+gland+defects+in+ErbB4+knockout+mice+genetically+rescued+from+embryonic+lethality.">Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality.</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).</li><li>Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+characteristics+of+a+nervous+system-specific+erbB4+knock-out+mouse.">Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse.</a> Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).</li><li>Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+neuropathies+and+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+in+transgenic+mice+overexpressing+glial+growth+factor+beta3+in+myelinating+Schwann+cells.">Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells.</a> Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).</li><li>Jackson-Fisher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Neu/ErbB2-induced+mammary+tumors+is+unaffected+by+loss+of+ErbB4.">Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4.</a> Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).</li><li>Byer, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen+inhibits+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+growth+in+an+estrogen+receptor-independent+manner.">Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner.</a> Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+utility+of+SOX10+to+distinguish+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+from+synovial+sarcoma,+including+intraneural+synovial+sarcoma.">Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma.</a> Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genomic+characterization+of+a+sporadic+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+line.">Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cstf2t+regulates+expression+of+histones+and+histone-like+proteins+in+male+germ+cells.">Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells.</a> Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).</li><li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63,+MHC+class+1,+and+CD47+identify+subsets+of+extracellular+vesicles+containing+distinct+populations+of+noncoding+RNAs.">CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+promote+regenerative+growth+in+sensory+neurons.">Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normalization+and+differential+expression+analyses+using+RNA-Seq+data+from+726+individual+Drosophila+melanogaster.">Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 17, 28 (2016).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Huang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DAVID+Gene+Functional+Classification+Tool:+a+novel+biological+module-centric+algorithm+to+functionally+analyze+large+gene+lists.">The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists.</a> Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+map:+a+network-based+method+for+gene-set+enrichment+visualization+and+interpretation.">Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation.</a> PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).</li><li>Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+gene-set+enrichment+analysis+of+RNA-Seq+data+with+small+replicates.">Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates.</a> PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).</li><li>Koch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+analysis+of+RNA+sequencing+data.">A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).</li><li>Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+xenografting+of+human+luciferase-tagged+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells+for+in+vivo+testing+of+candidate+therapeutic+agents.">Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).</li><li>Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G*Power+3:+a+flexible+statistical+power+analysis+program+for+the+social,+behavioral,+and+biomedical+sciences.">G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences.</a> Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+the+embryonic+nerve+roots+for+NF1-associated+plexiform+neurofibroma.">Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma.</a> Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).</li><li>Mo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+neurofibroma+model+from+induced+pluripotent+stem+cells+delineates+tumor+pathogenesis+and+developmental+origins.">Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).</li><li>Chau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+therapeutic+efficacy+of+a+novel+pharmacologic+inducer+of+apoptosis+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.">Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).</li><li>Dodd, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF1(+/-)+Hematopoietic+cells+accelerate+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+development+without+altering+chemotherapy+response.">NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response.</a> Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).</li><li>Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+beta+and+neuregulin-1+alpha+differentially+affect+the+migration+and+invasion+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells.">Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells.</a> Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).</li></ol>

Die hier vorgestellten detaillierten Methoden wurden unter Verwendung eines GEM-Modells von MPNSTs entwickelt. Wenn das interessierende Tumorgewebe jedoch in einzelne Zellen zerstreut werden kann, sind diese Methoden leicht für verschiedene Tumorarten anpassbar, die in GEMs auftreten. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das floxierte Allel nicht zu i) vermindertem Überleben führt, das es schwierig machen kann, genügend Mäuse zu erhalten, um nach Tumoren zu suchen, oder ii) einer erhöhten Tumorlatenz, die es schwie...

Vor den letzten zwei Jahrzehnten stützte sich die Behandlung von menschlichen Krebserkrankungen stark auf Strahlentherapie und Chemotherapeutika, die im Großen und Ganzen auf sich schnell vermehrende Zellpopulationen abzielten, indem sie die DNA schädigten oder die DNA-Synthese hemmten. Obwohl diese Ansätze das Wachstum von Krebszellen hemmten, hatten sie auch schädliche Nebenwirkungen auf normale, sich schnell vermehrende Zelltypen wie Darmepithelzellen und Haarfollikelzellen. In jüngerer Zeit hat die Krebstherapie begonnen, Chemotherapeutika zu verwenden, die genau auf Proteine innerhalb von Signalwegen abzielen, die für das Wachstum des Neoplasmas eines einzelnen Patienten von entscheidender Bedeutung sind. Dieser Ansatz, der gemeinhin als "Precision Medicine" bezeichnet wird, hat zur Entwicklung eines ständig wachsenden Repertoires an monoklonalen Antikörpern und kleinen molekularen Inhibitoren geführt. Diese Wirkstoffe hemmen effektiv die Proliferation und das Überleben von Tumorzellen und vermeiden gleichzeitig die schädlichen Nebenwirkungen auf normale Zelltypen, die bei herkömmlichen Chemotherapeutika und Strahlentherapie beobachtet werden. Monoklonale Antikörper, die zur Behandlung von Krebs beim Menschen eingesetzt werden, zielen am häufigsten auf Zelloberflächenmoleküle wie Wachstumsfaktorrezeptoren 1 (z. B. die große Familie membranübergreifender Rezeptor-Tyrosinkinasen) und Immunantwortmodulatoren 2 (z. B. programmiertes Zelltodprotein 1, programmierter Todesligand1) ab. Kleine molekulare Inhibitoren können entweder Zelloberflächenproteine oder Signalproteine, die sich intrazellulär befinden, hemmen3. Um diese neuen therapeutischen Wirkstoffe effektiv einsetzen zu können, muss jedoch festgestellt werden, dass eine bestimmte Krebserkrankung von dem Molekül abhängt, auf das ein Therapiekandidat abzielt.
Obwohl diese neuen Therapeutika fokussiertere Wirkungen haben, hemmen viele von ihnen immer noch die Wirkung von mehr als einem Protein. Darüber hinaus sind oft mehrere Wirkstoffe mit unterschiedlicher Wirksamkeit und Spezifität verfügbar, um auf ein bestimmtes Protein abzuzielen. Daher ist es ratsam, bei präklinischen Studien zusätzliche Ansätze wie die genetische Ablation zu verwenden, um ein Kandidatenprotein als therapeutisches Ziel zu validieren. Ein besonders nützlicher Ansatz zur Validierung eines Proteins als therapeutisches Ziel besteht darin, das Gen, das für das Kandidatenprotein kodiert, in einem gentechnisch veränderten Tiermodell abzutragen, das die spezifische Krebsart von Interesse entwickelt. Dieser Ansatz kann relativ einfach sein, wenn Mäuse mit einer Nullmutation (entweder eine natürliche Mutation, eine gentechnisch veränderte Nullmutation [ein "Knockout") oder eine Nullmutation, die durch eine Genfalle eingeführt wurde) verfügbar sind und die Mäuse bis ins Erwachsenenalter lebensfähig sind. Leider sind Mäuse mit einer Nullmutation, die diese Kriterien erfüllen, oft nicht verfügbar, typischerweise weil die Nullmutation zum embryonalen Tod oder in den ersten Tagen des postnatalen Lebens führt. Unter diesen Umständen können Mäuse, die dazu neigen, den interessierenden Tumortyp zu entwickeln, stattdessen zu Mäusen gekreuzt werden, bei denen Schlüsselsegmente des interessierenden Gens von loxP-Stellen flankiert werden ("floxed"), wodurch das Gen abgetragen werden kann, indem eine transgenexprimierende Cre-Rekombinase in die Tumorzellen eingeführt wird (ein bedingter Knockout). Dieser Ansatz bietet mehrere Vorteile. Erstens, wenn ein Cre-Treiber verfügbar ist, der im Tumor exprimiert wird, aber nicht in dem Zelltyp, der bei herkömmlichen Knockouts zum Tod führte, kann dieser Ansatz möglicherweise das therapeutische Ziel validieren. Zweitens ermöglicht die Ablation des Gens, das für das Kandidatenprotein kodiert, in Tumorzellen, aber nicht in anderen intratumoralen Elementen wie tumorassoziierten Fibroblasten oder Immunzellen, dem Prüfarzt, zwischen zellautonomen und nicht-zellautonomen Effekten des therapeutischen Ziels zu unterscheiden. Schließlich ermöglicht ein Tamoxifen-induzierbarer Cre-Treiber (CreERT2) dem Prüfarzt, das Gen von Interesse in verschiedenen Stadien der Tumorentwicklung zu löschen und das Fenster zu definieren, in dem der therapeutische Wirkstoffkandidat am wahrscheinlichsten wirksam ist.
Leider gibt es auch technische Probleme, die die Verwendung von bedingten Knockouts bei Tumoren, die in GEM-Modellen auftreten, einschränken können. Zum Beispiel ist ein Cre-Treiber, der in Tumorzellen exprimiert wird und Gendeletion in normalen lebensnotwendigen Zellen vermeidet, möglicherweise nicht verfügbar. Ein weiteres Problem, das unterschätzt werden kann, ist, dass Cre- und CreERT2-Treiber oft variabel floxierte Allele in Mäusen abtragen, was zu Mosaikismus für die Nullmutation in einem GEM-Krebs führt. Wenn dies geschieht, werden Tumorzellen, in denen das Zielgen nicht abgetragen wurde, weiterhin schnell vermehren und die Tumorzellen mit abgetragenen Allelen überwuchern. Mosaikismus in Cre-Treiberlinien kann aufgrund einer nicht allgegenwärtigen Cre-Expression in der Ziellinie und durch fehlgeschlagene Rekombination in einzelnen Zellen unabhängig von der Cre-Expressionauftreten 4. Dies ist ein bekanntes Phänomen von Cre-Treibern, das vom Zelltyp abhängig ist und bei der Versuchsplanung und Dateninterpretation berücksichtigt werden sollte. Mosaikismus kann die Wirkung des Knockouts maskieren und einen Forscher dazu bringen, fälschlicherweise zu dem Schluss zu kommen, dass das Gen von Interesse für die Proliferation und/oder das Überleben von Tumorzellen nicht essentiell ist und somit kein gültiges therapeutisches Ziel ist.
Mehrere dieser Probleme traten in einer früheren Studie auf, in der versucht wurde zu bestimmen, ob die Rezeptor-Tyrosinkinase erbB4 ein potenzielles therapeutisches Ziel in MPNST-Zellenwar 5. In diesen Studien wurden Mäuse verwendet, die ein Transgen exprimieren, das für denneuregulin-1 (NRG1) isoformen glialen Wachstumsfaktor-β3 (GGFβ3) kodiert, unter der Kontrolle des Schwann-Zell-spezifischen Myelinprotein-Nullpromotors (P 0-GGFβ3-Mäuse). P 0-GGFβ3-Mäuse entwickeln mehrere plexiforme Neurofibrome, die über einen Prozess, der die Prozesse der Neurofibrom-Pathogenese und der plexiformen Neurofibrom-MPNST-Progression rekapituliert, die bei Patienten mit dem autosomal-dominanten Tumorsuszeptibilitätssyndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1)6 beobachtet wurden, zu MPNSTs werden. Bei Kreuzung mit Mäusen mit einer Trp53-Nullmutation ergibt sich das resultierende P 0-GGFβ3; Trp53+/- Mäuse entwickeln MPNSTs de novo, wie sie in cis-Nf1+/-; Trp53+/- Mäuse.
Diese MPNSTs rekapitulieren die Entwicklung von Läsionen der Weltgesundheitsorganisation (WHO) Grad II zu WHO-Grad IV, die beim Menschen beobachtet wurden7. Bei P 0-GGFβ3-Mäusen entstehen MPNSTs innerhalb bereits bestehender plexiformer Neurofibrome im Trigeminusnerv (58%) und spinalen dorsalen Nervenwurzeln (68%)7; die MPNSTs, die in P 0-GGFβ3 entstehen; Trp53+/- Mäuse haben eine sehr ähnliche Verteilung. Beim Menschen entstehen MPNSTs am häufigsten im Ischiasnerv, gefolgt vom Plexus brachialis, den Spinalnervenwurzeln, dem Vagus, dem Femur, dem Median, dem Plexus sacralis, dem Obturator popliteus und den hinteren Tibia- und Ulnarnerven8. Diese Tumorverteilung in diesen GEM-Modellen unterscheidet sich etwas von dem, was beim Menschen beobachtet wird. Die MPNSTs, die in P 0-GGFβ3 und P0-GGFβ3 auftreten; Trp53+/- Mäuse sind histologisch identisch mit menschlichen MPNSTs, tragen viele der gleichen Mutationen, die bei menschlichen MPNSTs beobachtet wurden, und rekapitulieren den Prozess der Neurofibrom-MPNST-Progression, der bei NF1-Patienten beobachtet wurde. Die Erzeugung von P 0-GGFβ3 oder P0-GGFβ3; Trp53+/- Mäuse, die Erbb4-/- waren, waren nicht durchführbar, da Mäuse mit zwei Erbb4-Null-Allelen in utero am Embryonaltag 10,5 nach Herzfehlernstarben 9. Denn die Rettung der Erbb4-Expression im Herzen durch die Einführung eines herzspezifischen Erbb4-Transgens (α-Myosin-Schwerkette (MHC)-Erbb4) führt zu lebensfähigen Erbb4-/-Mäusen 10, der Erzeugung von Mäusen mit einem komplizierten P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- Genotyp wurde versucht.
Die Paarungen produzierten jedoch keine Mäuse in den erwarteten Mendelschen Verhältnissen, was darauf hindeutet, dass der gewünschte Genotyp schädlich war. Daher ist die Erzeugung von P 0-GGFβ3; Trp53+/- Mäuse mit floxierten Erbb4-Allelen11 und einem CreERT2-Treiber wurde versucht, die Löschung von Erbb4 in den MPNSTs, die in diesen Mäusen entstehen, zu ermöglichen. Bei diesen Tieren waren noch zahlreiche Tumorzellen mit intakten Erbb4-Allelen vorhanden (Mosaikismus). Der beobachtete Mosaikismus könnte auf eine ineffiziente Tamoxifenabgabe zurückzuführen sein, die zu Unterschieden in der Rekombinationseffizienz innerhalb des Gewebes führte. Die Möglichkeit spontaner Kompensationsmechanismen könnte weiter zum Mosaikismus in der Tamoxifen-vermittelten Rekombination beitragen, indem die Anforderung an die Erbb4-Expression umgangen wird. Es ist möglich, dass der Verlust von Trp53 Tumorzellen anfällig für zusätzliche spontane "permissive" Mutationen macht, die die Interpretation der Daten verwirren könnten. Da es wahrscheinlich schien, dass die Erbb4-intakten MPNST-Zellen die Folgen der Ablagerung von Erbb4 in anderen Tumorzellen maskieren würden, wurde dieser Ansatz aufgegeben.
Diese Hindernisse führten zur Entwicklung einer Methodik zur Ablation von Erbb4 in sehr frühen Passage MPNST-Zellen unter Verwendung eines Adenovirus, das Cre-Rekombinase und eGFP exprimiert. Diese Zellen können mit FACS von nicht infizierten Zellen getrennt werden, was den Mosaikismus für das ablatierte Erbb4-Gen deutlich reduziert. Im Folgenden werden die Methoden beschrieben, die verwendet werden, um dies zu erreichen, zusammen mit den Methoden, die verwendet werden, um die Auswirkungen der Genablation in vitro und in vivo zu bewerten. Das folgende Protokoll ist ein Beispiel dafür, wie tumortragende Mäuse erzeugt werden können, die Tumore mit gefloxten Allelen embryonaler tödlicher Gene hervorbringen, die für die Ex-vivo-Exzision vor der Beurteilung des In-vivo-Allotransplantat-Tumorwachstums von Interesse sind. Dazu gehört eine Beschreibung der Ansätze, die verwendet werden, um die Wirkung zu analysieren, die die Erbb4-Ablation auf die Proliferation, das Überleben und die Genexpression von Tumorzellen in vitro sowie auf Proliferation, Überleben und Angiogenese in orthotopen Allotransplantaten ausübt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad5CMV-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad5CMVCre-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-1174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alexa 568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>GaR A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>http://www.bioconductor.org</td>
			<td>alternative statistical analysis tool used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td>mixture of chelators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)</td>
			<td>DAVID</td>
			<td>https://david.ncifcrf.gov</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>EP0701 and K1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab35374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HFR1: 05-1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeSpace Tools and Data Sources</td>
			<td>GenomeSpace</td>
			<td>https://genomespace.org/support/tools/</td>
			<td>general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice</td>
			<td>Envigo (Previously Harlan Labs)</td>
			<td>69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Hi Seq 2500</td>
			<td>DNA sequencer used for step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis</td>
			<td>DNAStar LaserGene software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software statistical and normalization analysis used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor basement membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRG1-beta</td>
			<td>In house</td>
			<td>Generated by SLC, also commercially available from R &#38; D Systems(396-HB-050/CF).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain Hoeschst 33342</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panther Gene Ontology Classification System</td>
			<td>Panther</td>
			<td>http://pantherdb.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partek (BWA aligner and analyzer)</td>
			<td>Partek, Ver 7</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment and statistical/normalization used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1: 5&#8242;-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT 
			GTCTG- 3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2: 5&#8242;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC 
			AGAAGC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Primer 3: 5&#8242;-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA 
			ACCCAG-3&#8242;
			</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 3: 350&#8201;bp wild-type ErbB4 product.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>51-351-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ARY003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9712</td>
			<td>bioluminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ToppGene Suite</td>
			<td>ToppGene</td>
			<td>https://toppgene.cchmc.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide Signal Amplification Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL721001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells

Die Entwicklung neuer Medikamente, die genau auf Schlüsselproteine bei menschlichen Krebserkrankungen abzielen, verändert die Krebstherapeutika grundlegend. Bevor diese Medikamente jedoch eingesetzt werden können, müssen ihre Zielproteine als therapeutische Ziele bei bestimmten Krebsarten validiert werden. Diese Validierung wird häufig durchgeführt, indem das Gen, das für das therapeutische Ziel in einem gentechnisch veränderten Mausmodell (GEM) von Krebs kodiert, ausgeschaltet und bestimmt wird, welche Auswirkungen dies auf das Tumorwachstum hat. Leider schränken technische Probleme wie die embryonale Letalität bei konventionellen Knockouts und der Mosaikismus bei bedingten Knockouts diesen Ansatz oft ein. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein Ansatz zur Ablation eines abgeloxierten embryonalen tödlichen Gens entwickelt, das in Kurzzeitkulturen von bösartigen peripheren Nervenscheidentumoren (MPNSTs) von Interesse ist, die in einem GEM-Modell erzeugt wurden.
Dieses Papier beschreibt, wie man ein Mausmodell mit dem entsprechenden Genotyp etabliert, kurzfristige Tumorkulturen von diesen Tieren ableitet und dann das floxierte embryonale tödliche Gen mit einem adenoviralen Vektor abträgt, der Cre-Rekombinase und verbessertes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) exprimiert. Die Reinigung von Zellen, die mit Adenovirus transduziert wurden, mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) und die Quantifizierung der Auswirkungen, die die Genablation auf die Zellproliferation, Lebensfähigkeit, das Transkriptom und das orthotope Allotransplantatwachstum ausübt, wird dann detailliert beschrieben. Diese Methoden bieten einen effektiven und generalisierbaren Ansatz zur Identifizierung und Validierung therapeutischer Ziele in vitro und in vivo. Diese Ansätze bieten auch eine erneuerbare Quelle für von Tumoren abgeleitete Zellen mit niedriger Passage mit reduzierten In-vitro-Wachstumsartefakten. Auf diese Weise kann die biologische Rolle des Zielgens in verschiedenen biologischen Prozessen wie Migration, Invasion, Metastasierung und interzellulärer Kommunikation, die durch das Sekretom vermittelt werden, untersucht werden.

Abbildung 4 zeigt ein typisches Ergebnis, das bei der Umleitung von P 0-GGFβ3 erzielt wird; Trp53-/+; Erbb4 fl/fl MPNST-Zellen entweder mit dem Ad5CMV-eGFP-Adenovirus oder Ad5CMV-Cre/eGFP-Adenovirus (Abbildung 4A). Kulturen werden mit Fluoreszenzmikroskopie betrachtet, um eGFP-exprimierende Zellen zu identifizieren, und mit Phasenkontrastmikroskopie, um die Gesamtzahl der im selben Feld vorhandenen Zellen bei 1...

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Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Hier stellen wir ein Protokoll für die Durchführung von Gen-Knockouts vor, die in vivo in gentechnisch veränderten Mausmodell-abgeleiteten Tumoren embryonal tödlich sind, und bewerten dann die Wirkung, die der Knockout auf Tumorwachstum, Proliferation, Überleben, Migration, Invasion und das Transkriptom in vitro und in vivo hat.

Definition von Genfunktionen in der Tumorgenese durch Ex-vivo-Ablation von Flox-Allelen in bösartigen peripheren Nervenscheidentumorzellen

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Dieses Protokoll bietet eine alternative In-vivo-Methode, um die Tumorwachstumsrolle eines embryonalen tödlichen Gen-Knockouts zu untersuchen. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass Gen-Knockouts, die normalerweise embryonal tödlich sind, in Tumoren durchgeführt werden können, die aus einem gentechnisch veränderten Mausmodell stammen, um ihre Funktionsverlusteffekte in vivo zu untersuchen. Diese Technik kann auf Krankheiten angewendet werden, die eine Untersuchung der In-vivo-Rolle embryonaler essentieller Gene erfordern, die von herkömmlichen Gen-Knockout-Mausmodellen nicht erreichbar sind.Die Erstellung des Tiermodells erfordert Zeit, und empirische Tests sind erforderlich, um den optimalen MOI für eine adenovirale Infektion zu bestimmen, um sicherzustellen, dass eine geeignete Rekombination erreicht wird. Identifizieren Sie zunächst die Maus mit dem gewünschten Genotyp. Wenn eine tumortragende Maus ihren humanen Endpunkt erreicht, euthanasieren Sie die Maus und verwenden Sie ein steriles Skalpellmesser, um den Tumor zu entfernen.Sezieren Sie den Tumor in drei Abschnitte in Brotlaib-Schnitten mit einem Skalpellmesser, um die Gewebesegmente für die Formalinfixierung Paraffin zu erzeugen, die frühe Passagekulturerzeugung und das Einfrieren von Flash für analytische Analysen einbettet. Färben Sie einen fünf Mikrometer dicken formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeabschnitt mit Hämatoxylin und Eosin. Sobald ein Pathologe den Tumor bestätigt, führen Sie die immunhistochemische Färbung durch, um die Tumordiagnose zu bestätigen.Legen Sie das frisch gesammelte maligne periphere Nervenscheidentumorgewebe in 10 Milliliter eiskaltes steriles PBS auf Eis und übertragen Sie es dann in einen sterilen Arbeitsbereich, um frühe Passagekulturen zu etablieren. Zerkleinern Sie das Tumorgewebe in zwei bis vier Millimeter große Stücke und ritutieren Sie es acht- bis 10-mal in einer 10 Quadratzentimeter großen behandelten Gewebekulturschale mit 10 Millilitern Wachstumsmedium. Kultivieren Sie diese Gewebe in einem DMEM-10-Wachstumsmedium mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 nanomolaren Neuregulin-1-beta und zwei mikromolaren Forskolin.Samen Sie die früh durchgangenen Tumorzellen in einer Dichte von 1,5 mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro einer 10 Quadratzentimeter behandelten Gewebekulturschale, die DMEM-10-Wachstumsmedium enthält. Nach 12 bis 16 Stunden waschen Sie die adhärenten Kulturen mit zwei bis vier Millilitern DPBS und infizieren Sie die Zellen mit Adenovirus bei etwa 400 plaquebildenden Einheiten pro Zelle in 10 Millilitern serumfreiem DMEM. Überprüfen Sie nach 48 Stunden der Infektion kurz die Zellen auf EGFP-Signal auf einem Fluoreszenzmikroskop, um eine effiziente Infektion mit etwa 50 bis 100% positiven Zellen sicherzustellen, und sortieren Sie dann die EGFP-positiven infizierten Zellen durch FACS.Lassen Sie die Zellen nach der FACS-Sortierung mindestens 24 bis 48 Stunden in einem Gewebekultur-Inkubator erholen und bereiten Sie die Zellen dann für In-vitro-Zellanalysen oder In-vivo-Transplantationen vor. Bestätigen Sie die Erbb4-Deletion, indem Sie eine PCR mit genomischer DNA durchführen, die aus einem Teil der sortierten EGFP-positiven Zellen isoliert wurde. Führen Sie die Proliferationsassays in den nächsten sieben Tagen an sortierten Tumorzellen durch, die in einer 96-Well-Platte mit einem bildbasierten automatisierten Zytometer plattiert sind.Färben Sie die Zellen mit Haken und Propidiumiodidfarbstoffen und erfassen Sie die Bilder der Zellen mit einem automatisierten Plattenleser, um die Anzahl der lebenden und toten Zellen in jedem Bohrloch zu zählen. Isolieren Sie die Gesamt-RNA aus sortierten Tumorzellen mit Standard-Säure-Guanidinium-Phenol und Chloroform-basierter Methode. Öffnen Sie die Software, um die RNA-Sequenzausrichtung nach den programmspezifischen Schritten mit den Standardeinstellungen durchzuführen.Wählen Sie die Analysemethode, RNA seek, und wählen Sie dann das Mausreferenzgenom aus. Laden Sie die BED-Datei hoch, wenn sie vom Sequenzierungskern bereitgestellt wird. Laden Sie die FASTQ-Sequenzierungsdateien hoch und weisen Sie den Dateien eindeutige Replikatnamen zu.Gruppe replizieren die FASTQ-Dateien und legen die Dateien einem Replikatsatz fest. Für die statistische und Normalisierungsanalyse zur Identifizierung der differentiellen Genexpressionssignale mit robuster statistischer Aussagekraft öffnen Sie die Analysesoftware und wählen Sie die GFP FASTQ-Dateien als Steuerdatensatz aus. Wählen Sie als Nächstes DESeq2 als statistische und Normalisierungsmethode aus, und starten Sie die Baugruppe und Analyse.Verwenden Sie die Genontologie-Datensätze, die in die Open-Access-Tools zur funktionellen Anreicherungsanalyse integriert sind, um die funktionelle Anreicherungsanalyse an der identifizierten statistisch signifikanten Erbb4-vermittelten DEG durchzuführen, um die biologische und Signalwegsbedeutung des Erbb4-Genverlusts zu bestimmen. Injizieren Sie die Tumorzellen in den Ischiasnerv der betäubten Maus, um das Wachstumspotenzial des In-vivo-Allotransplantats in postinfizierten Zellen zu beurteilen. Sobald der Tumor die erforderliche Größe erreicht hat, sezieren Sie den Tumor von einer eingeschläferten Maus in zwei bis drei Abschnitten, wie zuvor gezeigt.Fixieren Sie einen Gewebeabschnitt in 4% Paraformaldehyd über Nacht und betten Sie dann den festen Abschnitt in das Paraffin ein. Nachdem Sie fünf Mikrometer dicke Abschnitte aus dem FFPE-Gewebe hergestellt haben, montieren Sie den Abschnitt auf den Objektträgern und bestätigen Sie das Vorhandensein von Tumorzellen im transplantierten Gewebe mit H & E und Immunfärbung, wie zuvor gezeigt. Um die in vivo Erbb4-Expressionsunterschiede zwischen den beiden experimentellen Bedingungen zu bestätigen, färben Sie das formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebe mit Erbb4-spezifischen Antikörpern.Die Transduktion der malignen peripheren Nervenscheidentumorgewebezellen mit Adenovirus wurde analysiert. Die EGFP-exprimierenden Zellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen und die Gesamtzahl der Zellen mittels Phasenkontrastmikroskopie bestimmt. Nach der Cre-vermittelten Genablation zeigte die PCR-Genotypisierung je nach Transfektionseffizienz einen vollständigen Gen-Knockout und eine heterogene Population von induzierten und uninduzierten Zellen im Vergleich zur Kontrolltransduktion.Die charakteristische Histopathologie, die in den orthotopen Allotransplantaten von malignen peripheren Nervenscheidentumorgeweben im Vergleich zu den Tumoren gefunden wurde, die von den ursprünglichen gentechnisch veränderten Tiermodellen abgeleitet wurden, zeigte einen Unterschied in der Zellmorphologie. Die Erbb4-Ablation verringerte die Zelldichte und die Zellproliferation in adeno5-CMV-Cre-ablatierten Zellen kontrollieren adeno5-CMV-GFP-transduzierte Zellen. Die Expression von Erbb4 in den Tumorzellen, die mit Adeno5-CMV-Cre oder EGFP-Virus transduziert wurden, war im Ergebnis in adeno5-CMV-Cre-transduzierten Allotransplantaten im Vergleich zu den mit Adeno5-CMV-EGFP behandelten Allotransplantattumoren verringert.Die vaskuläre Dichte wurde durch Immunreaktivitätsnachweis für CD31 bewertet, und die repräsentativen Ergebnisse zeigten eine deutlich reduzierte vaskuläre Dichte in Allotransplantaten von adeno5-CMV-Cre-transduzierten Zellen im Vergleich zu den Kontroll-Adeno5-CMV-EGFP-transduzierten Zellen. Nach der Genablation können die Zellen für viele verschiedene Arten von zellbasierten Assays wie Proliferation, Migration, 3D-Wachstum oder Veränderungen der Mikroumgebung sowie für orthotope In-vivo-Injektionen verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Forschung

Krebsforschung

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR-Bewertung der pH, pO2, Redox-Status, und Konzentrationen von Phosphat und Glutathion in der Tumor-Mikroumgebung

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

Eine In Vivo murinen Ischiasnerv Modell Perineural Invasion

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Im lebenden Organismus Immunogenitätsscreening von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln durch Durchflusszytometrie von Milz-T-Zellen

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex vivo Organoid-Modell von Adenovirus-Cre-vermittelten Gendeletionen in Urothelzellen der Maus

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Kultivierung und Bildgebung von ex vivo organotypischen Pseudomyxoma-Peritonei-Tumorschnitten aus resezierten humanen Tumorproben

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Genome-Scale Screening to Identify and Compare Therapeutic Targets in Tumors

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Finding New Therapeutic Targets for Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Through Genome-Scale shRNA Screens (Video) | JoVE

Genetisches Profiling und Dropout-Screening im Genommaßstab zur Identifizierung therapeutischer Ziele in Mausmodellen für bösartige periphere Nervenscheidentumoren

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...