Name: defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי (R01 NS048353, R01 NS109655), המכון הלאומי לסרטן (R01 CA122804), משרד ההגנה (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073, ו- W81XWH-15-1-0193), והקרן לגידול ילדים (2014-04-001 ו-2015-05-007).

לפני ביצוע הליכים כלשהם עם עכברים, כל ההליכים חייבים להיבדק ולאשר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה. פרוטוקול זה בוצע על ידי צוות מיומן כראוי בהתאם להנחיו?...

<ol>
	<li>Ricciuti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates+for+lung+cancer+in+the+era+of+personalized+oncology.">Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology.</a> Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).</li><li>Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+axis+in+glioblastoma+multiforme.">PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).</li><li>Roskoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+FDA-approved+small+molecule+protein+kinase+inhibitors.">Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors.</a> Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).</li><li>Heffner, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+conditional+mouse+mutagenesis+with+a+comprehensive+cre+characterization+resource.">Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource.</a> Nature Communications. 3, 1218 (2012).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB4+promotes+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis+via+Ras-independent+mechanisms.">ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms.</a> Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).</li><li>Kazmi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+overexpressing+neuregulin-1+model+neurofibroma-malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+progression+and+implicate+specific+chromosomal+copy+number+variations+in+tumorigenesis.">Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).</li><li>Brosius, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+overexpression+and+Trp53+haploinsufficiency+cooperatively+promote+de+novo+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis.">Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis.</a> Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).</li><li>Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.+A+clinicopathologic+study+of+120+cases.">Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases.</a> Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).</li><li>Gassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+neural+and+cardiac+development+in+mice+lacking+the+ErbB4+neuregulin+receptor.">Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor.</a> Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).</li><li>Tidcombe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+and+mammary+gland+defects+in+ErbB4+knockout+mice+genetically+rescued+from+embryonic+lethality.">Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality.</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).</li><li>Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+characteristics+of+a+nervous+system-specific+erbB4+knock-out+mouse.">Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse.</a> Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).</li><li>Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+neuropathies+and+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+in+transgenic+mice+overexpressing+glial+growth+factor+beta3+in+myelinating+Schwann+cells.">Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells.</a> Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).</li><li>Jackson-Fisher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Neu/ErbB2-induced+mammary+tumors+is+unaffected+by+loss+of+ErbB4.">Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4.</a> Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).</li><li>Byer, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen+inhibits+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+growth+in+an+estrogen+receptor-independent+manner.">Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner.</a> Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+utility+of+SOX10+to+distinguish+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+from+synovial+sarcoma,+including+intraneural+synovial+sarcoma.">Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma.</a> Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genomic+characterization+of+a+sporadic+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+line.">Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cstf2t+regulates+expression+of+histones+and+histone-like+proteins+in+male+germ+cells.">Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells.</a> Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).</li><li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63,+MHC+class+1,+and+CD47+identify+subsets+of+extracellular+vesicles+containing+distinct+populations+of+noncoding+RNAs.">CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+promote+regenerative+growth+in+sensory+neurons.">Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normalization+and+differential+expression+analyses+using+RNA-Seq+data+from+726+individual+Drosophila+melanogaster.">Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 17, 28 (2016).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Huang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DAVID+Gene+Functional+Classification+Tool:+a+novel+biological+module-centric+algorithm+to+functionally+analyze+large+gene+lists.">The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists.</a> Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+map:+a+network-based+method+for+gene-set+enrichment+visualization+and+interpretation.">Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation.</a> PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).</li><li>Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+gene-set+enrichment+analysis+of+RNA-Seq+data+with+small+replicates.">Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates.</a> PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).</li><li>Koch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+analysis+of+RNA+sequencing+data.">A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).</li><li>Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+xenografting+of+human+luciferase-tagged+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells+for+in+vivo+testing+of+candidate+therapeutic+agents.">Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).</li><li>Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G*Power+3:+a+flexible+statistical+power+analysis+program+for+the+social,+behavioral,+and+biomedical+sciences.">G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences.</a> Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+the+embryonic+nerve+roots+for+NF1-associated+plexiform+neurofibroma.">Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma.</a> Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).</li><li>Mo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+neurofibroma+model+from+induced+pluripotent+stem+cells+delineates+tumor+pathogenesis+and+developmental+origins.">Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).</li><li>Chau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+therapeutic+efficacy+of+a+novel+pharmacologic+inducer+of+apoptosis+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.">Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).</li><li>Dodd, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF1(+/-)+Hematopoietic+cells+accelerate+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+development+without+altering+chemotherapy+response.">NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response.</a> Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).</li><li>Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+beta+and+neuregulin-1+alpha+differentially+affect+the+migration+and+invasion+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells.">Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells.</a> Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).</li></ol>

השיטות המפורטות שהוצגו כאן פותחו באמצעות מודל GEM של MPNSTs. עם זאת, אם ניתן לפזר את רקמת הגידול המעניינת לתאים בודדים, מתודולוגיות אלה ניתנות להתאמה בקלות לסוגי גידולים שונים הנובעים מ- GEMs. חשוב לוודא כי אלל floxed לא לגרום i) ירידה בהישרדות שיכולה להקשות על השגת עכברים מספיקים כדי לסנן גידולים, או...

לפני שני העשורים האחרונים, הטיפול בסרטן אנושי הסתמך במידה רבה על הקרנות וחומרים כימותרפיים שהתמקדו באופן נרחב באוכלוסיות תאיות המתרבות במהירות על ידי פגיעה בדנ"א או עיכוב סינתזת DNA. אף על פי שגישות אלה אכן עיכבו את צמיחת התאים הסרטניים, היו להן גם תופעות לוואי מזיקות על סוגי תאים נורמליים המתרבים במהירות, כגון תאי אפיתל במעיים ותאי זקיק שיער. לאחרונה, הטיפול בסרטן החל להשתמש בחומרים כימותרפיים המכוונים במדויק לחלבונים בתוך מסלולי איתות שהם בעלי חשיבות קריטית לצמיחת הניאופלזמה של המטופל הבודד. גישה זו, המכונה בדרך כלל "רפואה מדויקת", הובילה לפיתוח רפרטואר הולך ומתרחב של נוגדנים חד שבטיים ומעכבים מולקולריים קטנים. חומרים אלה מעכבים ביעילות את התפשטותם והישרדותם של תאי הגידול תוך הימנעות מתופעות הלוואי המזיקות על סוגי תאים תקינים הנראים בחומרים כימותרפיים קונבנציונליים ובהקרנות. נוגדנים חד-שבטיים המשמשים לטיפול בסרטן אנושי מתמקדים בדרך כלל במולקולות של פני השטח של התא, כגון קולטני גורם גדילה1 (למשל, המשפחה הגדולה של קולטן טירוזין קינאזות המשתרעות על פני ממברנה) ומודולטורים של תגובה חיסונית2 (למשל, חלבון מוות תאי מתוכנת 1, ליגנדת מוות מתוכנתת 1). מעכבים מולקולריים קטנים יכולים לעכב חלבונים על פני התא או חלבוני איתות הממוקמים בתוך התא3. עם זאת, כדי להשתמש ביעילות בחומרים טיפוליים חדשים אלה, יש לקבוע כי סרטן מסוים תלוי במולקולה הממוקדת על ידי סוכן טיפולי מועמד.
למרות שלסוכנים טיפוליים חדשים אלה יש השפעות ממוקדות יותר, רבים מהם עדיין מעכבים את פעולתו של יותר מחלבון אחד. בנוסף, סוכנים מרובים עם יעילות וספציפיות משתנות זמינים לעתים קרובות כדי להתמקד בחלבון מסוים. כתוצאה מכך, במהלך חקירות פרה-קליניות, כדאי להשתמש בגישות נוספות כגון אבלציה גנטית כדי לאמת חלבון מועמד כמטרה טיפולית. גישה שימושית במיוחד לאימות חלבון כמטרה טיפולית היא לנטרל את הגן המקודד את החלבון המועמד במודל חייתי מהונדס גנטית המפתח את סוג העניין הספציפי של הסרטן. גישה זו יכולה להיות פשוטה יחסית אם עכברים עם מוטציה אפסית (או מוטציה טבעית, מוטציה null מהונדסת גנטית ["נוקאאוט"], או מוטציה null שהוכנסה על ידי מלכודת גנים) זמינים, והעכברים הם בני קיימא לבגרות. למרבה הצער, עכברים עם מוטציה אפסית העונים על קריטריונים אלה לרוב אינם זמינים, בדרך כלל משום שמוטציית האפס גורמת למוות באופן עוברי או בימים הראשונים של החיים שלאחר הלידה. בנסיבות אלה, עכברים הנוטים לפתח את סוג העניין של הגידול עשויים במקום זאת להיות מוצלבים לעכברים שבהם מקטעים מרכזיים של הגן המעניין מוקפים על ידי אתרי loxP ("floxed"), מה שמאפשר לגן להיות אבלציה על ידי החדרת טרנסגן המבטא Cre רקומבינאז לתוך תאי הגידול (נוקאאוט מותנה). גישה זו מספקת מספר יתרונות. ראשית, אם קיים נהג Cre זמין המתבטא בגידול אך לא בסוג התא שהוביל למוות בנוקאאוטים קונבנציונליים, גישה זו יכולה לאמת את המטרה הטיפולית המועמדת. שנית, ניתוק הגן המקודד את החלבון המועמד בתאי הגידול, אך לא באלמנטים תוך-סרטניים אחרים כגון פיברובלסטים הקשורים לגידול או תאי חיסון, מאפשר לחוקר להבחין בין השפעות אוטונומיות של התאים לבין השפעות לא-אוטונומיות-תאיות של המטרה הטיפולית. לבסוף, נהג Cre (CreERT2) הניתן להשראה של טמוקסיפן מאפשר לחוקר למחוק את הגן המעניין בשלבים שונים בהתפתחות הגידול ולהגדיר את החלון שבו הסוכן הטיפולי המועמד הוא בעל הסבירות הגבוהה ביותר להיות יעיל.
למרבה הצער, יש גם בעיות טכניות שיכולות להגביל את השימוש בנוקאאוטים מותנים בגידולים הנובעים במודלים של GEM. לדוגמה, ייתכן שנהג Cre המתבטא בתאי הגידול ונמנע ממחיקת גנים בתאים תקינים החיוניים לחיים אינו זמין. בעיה נוספת, שניתן לזלזל בה, היא שנהגי Cre ו-CreERT2 לעתים קרובות מתבלים באופן משתנה אללים מרופטים בעכברים, וכתוצאה מכך נוצר פסיפס למוטציה האפסית בסרטן GEM. כאשר זה קורה, תאים סרטניים שבהם הגן הממוקד לא היה אבלציה ימשיכו להתרבות במהירות, להגדיל את תאי הגידול עם אללים אבלים. פסיפס בקווי הנהג של Cre יכול להתרחש עקב ביטוי Cre שאינו בכל מקום בשושלת הממוקדת ועל ידי רקומבינציה כושלת בתאים בודדים ללא תלות בביטוי Cre4. זוהי תופעה ידועה של נהגי Cre התלויה בסוג התא ויש לקחת אותה בחשבון במהלך תכנון הניסוי ופרשנות הנתונים. פסיפסיזם יכול להסוות את השפעת הנוקאאוט ולהוביל חוקר למסקנה שגויה כי הגן המעניין אינו חיוני להתרבות ו/או להישרדות של תאי הגידול ולכן אינו מטרה טיפולית תקפה.
כמה מהבעיות הללו נתקלו במחקר קודם שניסה לקבוע אם הקולטן טירוזין קינאז erbB4 היה מטרה טיפולית פוטנציאלית בתאי MPNST5. במחקרים אלה נעשה שימוש בעכברים המבטאים טרנסגן המקודד את גורם הגדילה האיזופורמי של הנוירגולין-1 (NRG1) β3 (GGFβ3) תחת שליטתו של מקדם האפס של חלבון המיאלין הספציפי לתאי שוואן (P 0-GGFβ3). עכברי P 0-GGFβ3 מפתחים נוירופיברומות פלקסיפורמיות מרובות שמתקדמות והופכות ל- MPNSTs באמצעות תהליך המשחזר את התהליכים של נוירופיברומה פתוגנזה והתקדמות נוירופיברומה-MPNST פרספקסית שנראית בחולים עם תסמונת רגישות הגידול האוטוזומלית הדומיננטית נוירופיברומטוזיס סוג 1 (NF1)6. כאשר נחצה לעכברים עם מוטציה אפסית Trp53, וכתוצאה מכך P 0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים מפתחים MPNSTs דה נובו כפי שניתן לראות ב- cis-Nf1+/-; Trp53+/- עכברים.
MPNSTs אלה מסכמים את ההתקדמות מארגון הבריאות העולמי (WHO) דרגה II לנגעים בדרגה IV של ארגון הבריאות העולמי שנראו בבני אדם7. בעכברי P 0-GGFβ3, MPNSTs מופיעים בתוך נוירופיברומות פרספקס קיימות בעצב הטריגמינלי (58%) ובשורשי העצב הגבי בעמוד השדרה (68%)7; ה- MPNSTs הנובעים מ- P 0-GGFβ3; לעכברים Trp53+/- יש התפלגות דומה מאוד. בבני אדם, MPNSTs מופיעים בדרך כלל בעצב הסיאטי ואחריו מקלעת הברכיאל, שורשי העצבים בעמוד השדרה, הוואגוס, הירך, החציון, מקלעת העצה, האובטורטור הפופליטי, והעצבים הטיביאליים והאולנאריים האחוריים8. התפלגות גידול זו במודלים אלה של GEM שונה במקצת ממה שרואים בבני אדם. עם זאת, ה- MPNSTs המתעוררים ב- P 0-GGFβ3 ו- P0-GGFβ3; עכברי Trp53+/- זהים מבחינה היסטולוגית ל-MPNSTs אנושיים, נושאים רבות מאותן מוטציות שנראו ב-MPNSTs אנושיים, ומשחזרים את תהליך התקדמות הנוירופיברומה-MPNST שנראה בחולי NF1. הדור של P 0-GGFβ3 או P0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים שהיו Erbb4-/- לא היה אפשרי מכיוון שעכברים עם שני אללים ריקים של Erbb4 מתים ברחם ביום העוברי 10.5 משני למומים לבביים9. מכיוון שהצלת ביטוי Erbb4 בלב על ידי החדרת טרנסגן Erbb4 ספציפי ללב (שרשרת כבדה α-מיוזין (MHC)-Erbb4) גורמת לעכברים Erbb4-/- 10 בני קיימא, דור העכברים עם P 0-GGFβ3 מסובך; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- ניסה גנוטיפ.
עם זאת, ההזדווגויות לא הניבו עכברים ביחסים המנדליאניים הצפויים, מה שמעיד על כך שהגנוטיפ הרצוי היה מזיק. לכן, הדור של P 0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים עם אללים Erbb4 11 ונהג CreERT2 ניסה לאפשר את המחיקה של Erbb4 ב- MPNSTs הנובעים מעכברים אלה. בבעלי חיים אלה, תאי גידול רבים עם אללים שלמים Erbb4 עדיין היו נוכחים (פסיפס). הפסיפס שנצפה יכול לנבוע ממתן טמוקסיפן לא יעיל, מה שהביא להבדלים ביעילות הרקומבינציה בתוך הרקמה. האפשרות של מנגנוני פיצוי ספונטניים עשויה לתרום עוד יותר לפסיפסיזם ברקומבינציה בתיווך טמוקסיפן על ידי עקיפת הדרישה לביטוי Erbb4. זה אפשרי כי אובדן של Trp53 הופך את תאי הגידול רגישים למוטציות "מתירניות" ספונטניות נוספות שעלולות לבלבל את הפרשנות של הנתונים. מכיוון שנראה היה סביר שתאי ה-MPNST השלמים של Erbb4 יסתירו את ההשלכות של התבלטות Erbb4 בתאי גידול אחרים, גישה זו נזנחה.
מכשולים אלה הובילו לפיתוח מתודולוגיה להפלת Erbb4 בתאי MPNST במעבר מוקדם מאוד באמצעות אדנו-וירוס המבטא Cre רקומבינאז ו- eGFP. ניתן להפריד בין תאים אלה לבין תאים שאינם נגועים באמצעות FACS, מה שמפחית במידה ניכרת את הפסיפסיות של הגן Erbb4 האבל. להלן מתוארות השיטות המשמשות להשגת מטרה זו, יחד עם השיטות המשמשות להערכת ההשפעות של אבלציה גנטית במבחנה וב - in vivo. הפרוטוקול הבא הוא דוגמה כיצד לייצר עכברים נושאי גידול המניבים גידולים הנושאים אללים מרופטים של גנים קטלניים עובריים בעלי עניין לכריתת ex vivo לפני הערכת גדילת הגידול in vivo allograft. זה כולל תיאור של הגישות המשמשות לניתוח ההשפעה שאבלציה Erbb4 מפעילה על התפשטות תאי הגידול, הישרדותם וביטוי גנים במבחנה והתפשטות, הישרדות ואנגיוגנזה באלוגרפטים אורתוטופיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad5CMV-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad5CMVCre-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-1174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alexa 568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>GaR A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>http://www.bioconductor.org</td>
			<td>alternative statistical analysis tool used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td>mixture of chelators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)</td>
			<td>DAVID</td>
			<td>https://david.ncifcrf.gov</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>EP0701 and K1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab35374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HFR1: 05-1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeSpace Tools and Data Sources</td>
			<td>GenomeSpace</td>
			<td>https://genomespace.org/support/tools/</td>
			<td>general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice</td>
			<td>Envigo (Previously Harlan Labs)</td>
			<td>69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Hi Seq 2500</td>
			<td>DNA sequencer used for step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis</td>
			<td>DNAStar LaserGene software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software statistical and normalization analysis used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor basement membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRG1-beta</td>
			<td>In house</td>
			<td>Generated by SLC, also commercially available from R &#38; D Systems(396-HB-050/CF).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain Hoeschst 33342</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panther Gene Ontology Classification System</td>
			<td>Panther</td>
			<td>http://pantherdb.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partek (BWA aligner and analyzer)</td>
			<td>Partek, Ver 7</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment and statistical/normalization used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1: 5&#8242;-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT 
			GTCTG- 3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2: 5&#8242;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC 
			AGAAGC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Primer 3: 5&#8242;-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA 
			ACCCAG-3&#8242;
			</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 3: 350&#8201;bp wild-type ErbB4 product.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>51-351-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ARY003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9712</td>
			<td>bioluminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ToppGene Suite</td>
			<td>ToppGene</td>
			<td>https://toppgene.cchmc.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide Signal Amplification Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL721001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells

פיתוח תרופות חדשות המכוונות במדויק לחלבונים מרכזיים בסרטן האדם משנה באופן יסודי את הטיפולים בסרטן. עם זאת, לפני שניתן יהיה להשתמש בתרופות אלה, חלבוני המטרה שלהן חייבים להיות מאומתים כמטרות טיפוליות בסוגי סרטן ספציפיים. אימות זה מבוצע לעתים קרובות על ידי דחיקת הגן המקודד את המטרה הטיפולית המועמדת במודל עכבר מהונדס גנטית (GEM) של סרטן וקביעת איזו השפעה יש לכך על צמיחת הגידול. למרבה הצער, סוגיות טכניות כמו קטלניות עוברית בנוקאאוטים קונבנציונליים ופסיפסיזם בנוקאאוטים מותנים מגבילים לעתים קרובות את הגישה הזו. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחה גישה לניצול גן קטלני עוברי מרופט בעל עניין בתרביות קצרות טווח של גידולי מעטפת עצבים היקפיים ממאירים (MPNSTs) שנוצרו במודל GEM.
מאמר זה מתאר כיצד לבסס מודל עכברים עם הגנוטיפ המתאים, להפיק תרביות גידול קצרות טווח מבעלי חיים אלה, ולאחר מכן להפוך את הגן הקטלני העוברי הפגום באמצעות וקטור אדנובירלי המבטא את Cre recombinase וחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP). לאחר מכן מפורט טיהור של תאים שעברו התמרה באמצעות אדנו-וירוס באמצעות מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנציה (FACS) וכימות ההשפעות שאבלציה גנטית מפעילה על התפשטות התאים, הכדאיות, השעתוק וצמיחת האלוגרפט האורתוטופי. מתודולוגיות אלה מספקות גישה יעילה וניתנת להכללה לזיהוי ואימות של מטרות טיפוליות במבחנה וב-in vivo. גישות אלה מספקות גם מקור מתחדש של תאים שמקורם בגידולים בעלי מעבר נמוך עם תוצרי גדילה מופחתים במבחנה . זה מאפשר לחקור את התפקיד הביולוגי של הגן הממוקד בתהליכים ביולוגיים מגוונים כמו הגירה, פלישה, גרורות ותקשורת בין-תאית המתווכת על ידי הסוד.

איור 4 ממחיש תוצאה אופיינית המתקבלת בעת התמרות P 0-GGFβ3; Trp53-/+; תאי MPNST מסוג Erbb4fl/fl עם אדנו-וירוס Ad5CMV-eGFP או אדנו-וירוס Ad5CMV-Cre/eGFP (איור 4A). תרביות נצפות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לזהות תאים המבטאים eGFP ועל ידי מיקרוסקופיה של ניג...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע נוקאאוטים של גנים שהם in vivo קטלניים עובריים בגידולים שמקורם במודלים של עכברים מהונדסים גנטית, ולאחר מכן מעריכים את ההשפעה שיש לנוקאאוט על צמיחת הגידול, התפשטותו, הישרדותו, הגירה, פלישה, והתעתיק in vitro ו- in vivo.

הגדרת תפקודי גנים בגידולים סרטניים על ידי אבלציה Ex vivo של אללים פלוקסים בתאי גידול מעטפת עצב היקפית ממאירה

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

פרוטוקול זה מספק שיטת in vivo חלופית לחקר תפקיד גדילת הגידול של נוקאאוט גן קטלני עוברי. היתרון של שיטה זו הוא שניתן לבצע נוקאאוטים של גנים שהם בדרך כלל קטלניים עובריים בגידולים שמקורם במודל עכבר מהונדס גנטית כדי לחקור את אובדן ההשפעות התפקודיות שלהם in vivo. ניתן ליישם טכניקה זו על מחלות הדורשות לחקור את תפקידם של גנים חיוניים עובריים שאינם ניתנים להשגה ממודלים מסורתיים של עכברי נוקאאוט גנים.יצירת המודל של בעלי החיים לוקחת זמן ונדרשות בדיקות אמפיריות כדי לקבוע את ה- MOI האופטימלי לזיהום אדנו-ויראלי כדי להבטיח כי רקומבינציה מתאימה מושגת. ראשית, זהה את העכבר עם הגנוטיפ הרצוי. כאשר עכבר נושא גידול מגיע לנקודת הקצה ההומאנית שלו, הרדים את העכבר והשתמשו בסכין אזמל סטרילית כדי להסיר את הגידול.נתחו את הגידול לשלושה חלקים בחיתוכים בסגנון כיכר לחם באמצעות סכין אזמל כדי ליצור את מקטעי הרקמה לפרפין קיבוע פורמלין המטביע יצירת תרביות מעבר מוקדמות והקפאת הבזק לניתוחים אנליטיים. הכתימו חתך רקמה עבה של חמישה מיקרומטרים עם המטוקסילין ואאוזין עם המטוקסילין ואאוזין. ברגע שפתולוג מאשר את הגידול, בצע את הכתם האימונוהיסטוכימי כדי לאשר את אבחנת הגידול.מניחים את רקמת הגידול של נדן העצב ההיקפי הממאיר שנאספה זה עתה ב-10 מיליליטרים של PBS סטרילי קר כקרח על קרח, ולאחר מכן מעבירים אותה לאזור עבודה סטרילי כדי ליצור תרביות מעבר מוקדמות. מצמצמים את רקמת הגידול לחתיכות של שניים עד ארבעה מילימטרים ומקציפים שמונה עד 10 פעמים בצלחת תרבית רקמה מטופלת של 10 סנטימטרים רבועים המכילה 10 מיליליטרים של מדיום גדילה. תרבית רקמות אלה במדיום גדילה DMEM-10 עתיר גלוקוז בתוספת 10 ננומולר נוירגולין-1 בטא ושני פורסקולין מיקרומולריים.זרעו את תאי הגידול המוקדמים שעברו בצפיפות של פי 1.5 10 עד התאים השישיים לכל צלחת תרבית רקמה שטופלה ב-10 מ"ר המכילה מדיום גדילה DMEM-10. לאחר 12 עד 16 שעות, שטפו את התרביות הדבקות בשניים עד ארבעה מיליליטרים של DPBS, והדביקו את התאים באדנו-וירוס בכ-400 יחידות יוצרות פלאק לכל תא ב-10 מיליליטרים של DMEM ללא סרום. לאחר 48 שעות של זיהום, בדקו לזמן קצר את התאים לאיתור אות EGFP במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח זיהום יעיל עם כ-50 עד 100% תאים חיוביים, ולאחר מכן FACS ממיינים את התאים הנגועים החיוביים ל-EGFP.לאחר מיון FACS, תנו לתאים להתאושש באינקובטור תרבית רקמה למשך 24 עד 48 שעות לפחות, ולאחר מכן הכינו את התאים לניתוחים מבוססי תאים במבחנה או להשתלת in vivo. אשרו את מחיקת Erbb4 על ידי ביצוע PCR באמצעות דנ"א גנומי שבודד מחלק מהתאים החיוביים ל-EGFP הממוינים. בצע את מבחני ההתפשטות במהלך שבעת הימים הבאים על תאי גידול ממוינים המצופים בלוחית בעלת 96 בארות באמצעות ציטומטר אוטומטי מבוסס תמונה.הכתימו את התאים בקרסים ובצבעי פרופידיום יודיד וצלמו את התמונות של התאים באמצעות קורא לוחות אוטומטי כדי לספור את מספר התאים החיים והמתים בכל באר. לבודד RNA כולל מתאי גידול ממוינים באמצעות חומצה סטנדרטית guanidinium phenol ושיטה מבוססת כלורופורם. פתח את התוכנה כדי לבצע את יישור רצף ה- RNA לאחר השלבים הספציפיים לתוכנית באמצעות הגדרות ברירת המחדל.בחר את שיטת הניתוח, חפש RNA ולאחר מכן בחר את גנום הייחוס של העכבר. העלה את קובץ BED אם הוא מסופק על-ידי ליבת הריצוף. העלה את קבצי הריצוף של FASTQ והקצה שמות משוכפלים ייחודיים לקבצים.קבץ לשכפל את קבצי FASTQ ולייעד את הקבצים לערכת שכפול. כדי שהניתוח הסטטיסטי והנורמליזציה יזהה את אותות ביטוי הגנים הדיפרנציאליים בעוצמה סטטיסטית חזקה, פתח את תוכנת הניתוח ובחר בקבצי GFP FASTQ כמערכת נתוני הבקרה. לאחר מכן, בחר DESeq2 כשיטת הסטטיסטיקה והנורמליזציה והתחל את ההרכבה והניתוח.השתמש בערכות הנתונים האונטולוגיות של הגנים המשולבות בכלי ניתוח ההעשרה הפונקציונלית בגישה פתוחה כדי לבצע את ניתוח ההעשרה הפונקציונלית על ה- DEG המתווך Erbb4 בעל מובהקות סטטיסטית שזוהתה כדי לקבוע את המובהקות הביולוגית והמסלולית של אובדן הגן Erbb4. הזריקו את תאי הגידול לעצב הסיאטי של העכבר המרדים כדי להעריך את פוטנציאל הגדילה של in vivo allograft בתאים שלאחר ההדבקה. ברגע שהגידול מגיע לגודל הנדרש, נתחו את הגידול מעכבר מורדם בשניים-שלושה חלקים כפי שהוכח קודם לכן.לתקן קטע רקמה אחד ב 4% Paraformaldehyde לילה, ולאחר מכן להטמיע את החלק הקבוע בפרפין. לאחר ביצוע מקטעים עבים של חמישה מיקרומטרים מרקמת ה- FFPE, הרכיב את החלק על השקופיות ואישר את נוכחותם של תאי הגידול ברקמה המושתלת באמצעות H&E ו- immunostaining כפי שהוכח בעבר. כדי לאשר את ההבדלים בביטוי in vivo Erbb4 בין שני מצבי הניסוי, הכתימו את הרקמה הקבועה בפורמלין, משובצת פרפין, בנוגדנים ספציפיים ל-Erbb4.ההעברה של תאי רקמת הגידול של מעטפת העצב ההיקפית הממאירה עם אדנו-וירוס נותחה. התאים המבטאים EGFP זוהו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, והמספר הכולל של התאים נקבע באמצעות מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה. לאחר אבלציה של גנים בתיווך Cre, בהתאם ליעילות הטרנספקציה, הגנוטיפ PCR הראה נוקאאוט גנים שלם ואוכלוסייה הטרוגנית של תאים מושרים ולא מושרים בהשוואה להתמרת הבקרה.ההיסטופתולוגיה האופיינית שנמצאה באלוגרפטים האורתטופיים של רקמות גידול מעטפת עצב היקפית ממאירה בהשוואה לגידולים שנגזרו מהמודלים המקוריים של בעלי חיים מהונדסים גנטית הדגימה הבדל במורפולוגיה של התא. האבלציה של Erbb4 הפחיתה את צפיפות התאים ואת התפשטות התאים בתאי אדנו5-CMV-Cre-אבלציה שולטים בתאים שעברו אדנו5-CMV-GFP. הביטוי של Erbb4 בתאי הגידול שעברו התמרה עם adeno5-CMV-Cre, או נגיף EGFP, פחת בתוצאה של אלוגרפטים מתמרים adeno5-CMV-Cre בהשוואה לגידולי allograft שטופלו על ידי אדנו5-CMV-EGFP.צפיפות כלי הדם הוערכה באמצעות זיהוי אימונו-ראקטיביות עבור CD31, והתוצאות הייצוגיות הראו ירידה ניכרת בצפיפות כלי הדם באלוגרפטים של תאים שעברו מותמרים אדנו5-CMV-Cre בהשוואה לתאי הבקרה שעברו אדנו5-CMV-EGFP. לאחר אבלציה גנטית, התאים יכולים לשמש עבור סוגים רבים ושונים של בדיקות מבוססות תאים כגון התפשטות, הגירה, גדילה תלת-ממדית או שינויים במיקרו-סביבה, כמו גם עבור זריקות אורתוטופיות in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

לשעבר Vivo הדמיה של לימפוציטים מסוג T CD8 תושב באמבריולוגיה הגידול פרוסות משתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

אין ויוו הערכת EPR pH, pO2, מצב חמצון-חיזור, ואת ריכוזים של פוספט גלוטתיון ב Microenvironment הגידול

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

מודל מאתר בעצב In Vivo של הפלישה Perineural

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

ב-Vivo הקרנה אימונוגנית של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בגידול על ידי ציטומטריית זרימה של תאי T טחול

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

אקס ויוו מודל אורגנואידי של מחיקות גנים בתיווך אדנו-וירוס-Cre בתאי אורותל של עכבר

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

תרבית והדמיה של פרוסות גידול Pseudomyxoma peritonei אורגנוטיפיות Ex vivo מדגימות גידול אנושי מנותחות

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Genome-Scale Screening to Identify and Compare Therapeutic Targets in Tumors

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Finding New Therapeutic Targets for Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Through Genome-Scale shRNA Screens (Video) | JoVE

פרופיילינג גנטי וסינון נשירה בקנה מידה גנומי לזיהוי מטרות טיפוליות במודלים עכבריים של גידול ממאיר במעטפת עצב היקפית

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...