Name: defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353, R01 NS109655), del National Cancer Institute (R01 CA122804), del Dipartimento della Difesa (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 e W81XWH-15-1-0193) e della Children's Tumor Foundation (2014-04-001 e 2015-05-007).

Prima di eseguire qualsiasi procedura con i topi, tutte le procedure devono essere riviste e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Il protocollo descritto in questo manoscritto è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Medical University of South Carolina. Questo protocollo è stato eseguito da personale adeguatamente addestrato seguendo le linee guida istituzionali per la cura degli animali del MUSC.
1. Generazione di topi che sv...

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I metodi dettagliati qui presentati sono stati sviluppati utilizzando un modello GEM di MPNST. Tuttavia, se il tessuto tumorale di interesse può essere disperso in singole cellule, queste metodologie sono facilmente adattabili a vari tipi di tumore che si presentano nei GEM. È importante assicurarsi che l'allele floxed non si traduca in i) una diminuzione della sopravvivenza che può rendere difficile ottenere topi sufficienti per lo screening dei tumori, o ii) una maggiore latenza tumorale che può rendere difficile o...

Prima degli ultimi due decenni, il trattamento dei tumori umani si basava fortemente sulla radioterapia e sugli agenti chemioterapici che miravano ampiamente alle popolazioni cellulari in rapida proliferazione danneggiando il DNA o inibendo la sintesi del DNA. Sebbene questi approcci abbiano inibito la crescita delle cellule tumorali, hanno anche avuto effetti collaterali deleteri su normali tipi di cellule in rapida proliferazione come le cellule epiteliali intestinali e le cellule del follicolo pilifero. Più recentemente, la terapia del cancro ha iniziato a utilizzare agenti chemioterapici che colpiscono con precisione le proteine all'interno delle vie di segnalazione che sono di fondamentale importanza per la crescita della neoplasia di un singolo paziente. Questo approccio, comunemente indicato come "Medicina di precisione", ha portato allo sviluppo di un repertorio in continua espansione di anticorpi monoclonali e piccoli inibitori molecolari. Questi agenti inibiscono efficacemente la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule tumorali evitando gli effetti collaterali deleteri sui normali tipi di cellule osservati con agenti chemioterapici convenzionali e radioterapia. Gli anticorpi monoclonali utilizzati per il trattamento dei tumori umani più comunemente prendono di mira le molecole di superficie cellulare come i recettori del fattore di crescita1 (ad esempio, la grande famiglia di tirosin-chinasi del recettore di membrana) e i modulatori della risposta immunitaria2 (ad esempio, proteina di morte cellulare programmata 1, ligando di morte programmata 1). Piccoli inibitori molecolari possono inibire le proteine di superficie cellulare o le proteine di segnalazione che si trovano intracellulare3. Tuttavia, per impiegare efficacemente questi nuovi agenti terapeutici, è necessario stabilire che un particolare cancro dipende dalla molecola che viene presa di mira da un agente terapeutico candidato.
Sebbene questi nuovi agenti terapeutici abbiano effetti più mirati, molti di essi inibiscono ancora l'azione di più di una proteina. Inoltre, sono spesso disponibili più agenti con diversa efficacia e specificità per colpire una proteina specifica. Di conseguenza, durante le indagini precliniche, è consigliabile utilizzare approcci aggiuntivi come l'ablazione genetica per convalidare una proteina candidata come bersaglio terapeutico. Un approccio particolarmente utile per convalidare una proteina come bersaglio terapeutico è quello di ablare il gene che codifica la proteina candidata in un modello animale geneticamente modificato che sviluppa lo specifico tipo di cancro di interesse. Questo approccio può essere relativamente semplice se sono disponibili topi con una mutazione nulla (una mutazione naturale, una mutazione nulla geneticamente modificata [un "knockout"] o una mutazione nulla introdotta da una trappola genica) e i topi sono vitali nell'età adulta. Sfortunatamente, i topi con una mutazione nulla che soddisfano questi criteri spesso non sono disponibili, in genere perché la mutazione nulla provoca la morte embrionale o nei primi giorni di vita postnatale. In questa circostanza, i topi inclini a sviluppare il tipo di interesse tumorale possono invece essere incrociati con topi in cui segmenti chiave del gene di interesse sono affiancati da siti loxP ("floxed"), che consente al gene di essere ablato introducendo un transgene che esprime Cre ricombinasi nelle cellule tumorali (un knockout condizionale). Questo approccio offre diversi vantaggi. In primo luogo, se è disponibile un driver Cre che è espresso nel tumore ma non nel tipo di cellula che ha portato alla morte nei knockout convenzionali, questo approccio può potenzialmente convalidare il bersaglio terapeutico candidato. In secondo luogo, l'ablazione del gene che codifica per la proteina candidata nelle cellule tumorali ma non in altri elementi intratumorali come i fibroblasti associati al tumore o le cellule immunitarie consente allo sperimentatore di distinguere tra effetti autonomi delle cellule e non autonomi delle cellule del bersaglio terapeutico. Infine, un driver Cre inducibile da tamoxifene (CreERT2) consente allo sperimentatore di eliminare il gene di interesse in diverse fasi dello sviluppo del tumore e definire la finestra in cui l'agente terapeutico candidato ha maggiori probabilità di essere efficace.
Sfortunatamente, ci sono anche problemi tecnici che possono limitare l'uso di knockout condizionali nei tumori che si verificano nei modelli GEM. Ad esempio, un driver Cre che è espresso nelle cellule tumorali ed evita la delezione genica nelle cellule normali essenziali per la vita potrebbe non essere disponibile. Un altro problema, che può essere sottovalutato, è che i driver Cre e CreERT2 spesso ablano in modo variabile gli alleli floxati nei topi, con conseguente mosaicismo per la mutazione nulla in un cancro GEM. Quando ciò si verifica, le cellule tumorali in cui il gene bersaglio non è stato ablato continueranno a proliferare rapidamente, sovrascredendo le cellule tumorali con alleli ablatati. Il mosaicismo nelle linee driver cre può verificarsi a causa dell'espressione cre non onnipresente nel lignaggio mirato e della ricombinazione fallita in singole cellule indipendenti dall'espressione cre4. Questo è un fenomeno noto dei driver Cre che dipende dal tipo di cellula e dovrebbe essere considerato durante la progettazione sperimentale e l'interpretazione dei dati. Il mosaicismo può mascherare l'effetto del knockout e portare un investigatore a concludere erroneamente che il gene di interesse non è essenziale per la proliferazione e/o la sopravvivenza delle cellule tumorali e quindi non è un valido bersaglio terapeutico.
Molti di questi problemi sono stati riscontrati in uno studio precedente che ha tentato di determinare se il recettore tirosina chinasi erbB4 fosse un potenziale bersaglio terapeutico nelle cellule MPNST5. In questi studi, sono stati utilizzati topi che esprimono un transgene che codifica per il fattore di crescita gliale isoforma neuregulin-1 (NRG1) β3 (GGFβ3) sotto il controllo del promotore zero della proteina mielinica specifica della cellula di Schwann (topi P 0-GGFβ3). I topi P 0-GGFβ3 sviluppano neurofibromi plessiformi multipli che progrediscono fino a diventare MPNST attraverso un processo che ricapitola i processi di patogenesi del neurofibroma e della progressione del neurofibroma-MPNST plessiforme osservati in pazienti con la sindrome da suscettibilità tumorale autosomica dominante neurofibromatosi di tipo 1 (NF1)6. Quando incrociato a topi con una mutazione nulla Trp53, il risultante P 0-GGFβ3; I topi Trp53+/- sviluppano MPNST de novo come si vede in cis-Nf1+/-; Topi Trp53+/-.
Questi MPNNT ricapitolano la progressione dalle lesioni di grado II dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) a quelle di grado IV dell'OMS osservate negli esseri umani7. Nei topi P 0-GGFβ3, gli MPNNT insorgono all'interno di neurofibromi plessiformi preesistenti nel nervo trigemino (58%) e nelle radici del nervo dorsale spinale (68%)7; gli MPNST che si verificano in P 0-GGFβ3; I topi Trp53+/- hanno una distribuzione molto simile. Nell'uomo, gli MPNNT si presentano più comunemente nel nervo sciatico seguito dal plesso brachiale, dalle radici nervose spinali, dal vago, dal femore, dalla mediana, dal plesso sacrale, dall'otturatore popliteale e dai nervi tibiali e ulnari posteriori8. Questa distribuzione tumorale in questi modelli GEM è in qualche modo diversa da quella che si vede negli esseri umani. Tuttavia, gli MPNST che si presentano in P 0-GGFβ3 e P0-GGFβ3; I topi Trp53+/- sono istologicamente identici agli MPNNT umani, portano molte delle stesse mutazioni osservate negli MPNNT umani e ricapitolano il processo di progressione del neurofibroma-MPNST osservato nei pazienti NF1. La generazione di P 0-GGFβ3 o P0-GGFβ3; I topi Trp53+/- che erano Erbb4-/- non erano fattibili in quanto i topi con due alleli nulli Erbb4 muoiono in utero al giorno embrionale 10,5 secondari a difetti cardiaci9. Perché il salvataggio dell'espressione di Erbb4 nel cuore introducendo un transgene Erbb4 cardiaco-specifico (catena pesante α-miosina (MHC)-Erbb4) si traduce in topi Erbb4-/- vitali10, la generazione di topi con un complicato P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; È stato tentato il genotipo Erbb4-/-.
Tuttavia, gli accoppiamenti non hanno prodotto topi nei rapporti mendeliani attesi, indicando che il genotipo desiderato era deleterio. Pertanto, la generazione di P 0-GGFβ3; Trp53+/- topi con alleli Erbb4 floxed 11 e un driver CreERT2 è stato tentato di consentire la delezione di Erbb4 negli MPNNT che si verificano in questi topi. In questi animali erano ancora presenti numerose cellule tumorali con alleli Erbb4 intatti (mosaicismo). Il mosaicismo osservato potrebbe derivare da una somministrazione inefficiente di tamoxifene, che ha comportato differenze nell'efficienza di ricombinazione all'interno del tessuto. La possibilità di meccanismi compensativi spontanei potrebbe contribuire ulteriormente al mosaicismo nella ricombinazione mediata da tamoxifene bypassando il requisito per l'espressione di Erbb4. È possibile che la perdita di Trp53 renda le cellule tumorali suscettibili ad ulteriori mutazioni spontanee "permissive" che potrebbero confondere l'interpretazione dei dati. Poiché sembrava probabile che le cellule MPNST intatte di Erbb4 avrebbero mascherato le conseguenze dell'ablazione di Erbb4 in altre cellule tumorali, questo approccio è stato abbandonato.
Questi ostacoli hanno portato allo sviluppo di una metodologia per l'ablazione di Erbb4 in cellule MPNST a passaggio molto precoce utilizzando un adenovirus che esprime Cre ricombinasi ed eGFP. Queste cellule possono essere separate dalle cellule non infette utilizzando FACS, che riduce notevolmente il mosaicismo per il gene Erbb4 ablato. Di seguito, vengono descritti i metodi utilizzati per raggiungere questo obiettivo, insieme ai metodi utilizzati per valutare gli effetti dell'ablazione genica in vitro e in vivo. Il seguente protocollo è un esempio di come produrre topi portatori di tumore che producono tumori portatori di alleli floxed di geni letali embrionali di interesse per l'escissione ex vivo prima della valutazione della crescita tumorale allotrapianto in vivo . Ciò include una descrizione degli approcci utilizzati per analizzare l'effetto che l'ablazione di Erbb4 esercita sulla proliferazione delle cellule tumorali, sulla sopravvivenza e sull'espressione genica in vitro e sulla proliferazione, la sopravvivenza e l'angiogenesi negli alloinnesti ortotopici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad5CMV-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad5CMVCre-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-1174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alexa 568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>GaR A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>http://www.bioconductor.org</td>
			<td>alternative statistical analysis tool used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td>mixture of chelators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)</td>
			<td>DAVID</td>
			<td>https://david.ncifcrf.gov</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>EP0701 and K1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab35374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HFR1: 05-1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeSpace Tools and Data Sources</td>
			<td>GenomeSpace</td>
			<td>https://genomespace.org/support/tools/</td>
			<td>general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice</td>
			<td>Envigo (Previously Harlan Labs)</td>
			<td>69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Hi Seq 2500</td>
			<td>DNA sequencer used for step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis</td>
			<td>DNAStar LaserGene software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software statistical and normalization analysis used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor basement membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRG1-beta</td>
			<td>In house</td>
			<td>Generated by SLC, also commercially available from R &#38; D Systems(396-HB-050/CF).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain Hoeschst 33342</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panther Gene Ontology Classification System</td>
			<td>Panther</td>
			<td>http://pantherdb.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partek (BWA aligner and analyzer)</td>
			<td>Partek, Ver 7</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment and statistical/normalization used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1: 5&#8242;-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT 
			GTCTG- 3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2: 5&#8242;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC 
			AGAAGC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Primer 3: 5&#8242;-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA 
			ACCCAG-3&#8242;
			</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 3: 350&#8201;bp wild-type ErbB4 product.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>51-351-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ARY003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9712</td>
			<td>bioluminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ToppGene Suite</td>
			<td>ToppGene</td>
			<td>https://toppgene.cchmc.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide Signal Amplification Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL721001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells

Lo sviluppo di nuovi farmaci che colpiscono con precisione le proteine chiave nei tumori umani sta alterando fondamentalmente le terapie contro il cancro. Tuttavia, prima che questi farmaci possano essere utilizzati, le loro proteine bersaglio devono essere convalidate come bersagli terapeutici in specifici tipi di cancro. Questa convalida viene spesso eseguita eliminando il gene che codifica per il bersaglio terapeutico candidato in un modello di cancro del topo geneticamente modificato (GEM) e determinando quale effetto questo ha sulla crescita del tumore. Sfortunatamente, questioni tecniche come la letalità embrionale nei knockout convenzionali e il mosaicismo nei knockout condizionali spesso limitano questo approccio. Per superare queste limitazioni, è stato sviluppato un approccio per ablare un gene letale embrionale floxed di interesse in colture a breve termine di tumori maligni della guaina del nervo periferico (MPNNT) generati in un modello GEM.
Questo articolo descrive come stabilire un modello murino con il genotipo appropriato, derivare colture tumorali a breve termine da questi animali e quindi ablare il gene letale embrionale flossato utilizzando un vettore adenovirale che esprime Cre ricombinasi e proteina fluorescente verde potenziata (eGFP). Viene quindi dettagliata la purificazione delle cellule trasdotte con adenovirus utilizzando lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e la quantificazione degli effetti che l'ablazione genica esercita sulla proliferazione cellulare, la vitalità, il trascrittoma e la crescita dell'allotrapianto ortotopico. Queste metodologie forniscono un approccio efficace e generalizzabile per identificare e convalidare bersagli terapeutici in vitro e in vivo. Questi approcci forniscono anche una fonte rinnovabile di cellule derivate da tumori a basso passaggio con artefatti di crescita in vitro ridotti. Ciò consente di studiare il ruolo biologico del gene bersaglio in diversi processi biologici come la migrazione, l'invasione, le metastasi e la comunicazione intercellulare mediata dal secretoma.

La Figura 4 illustra un risultato tipico ottenuto durante la trasduzione di P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Cellule MPNST Erbb4fl/fl con adenovirus Ad5CMV-eGFP o adenovirus Ad5CMV-Cre/eGFP (Figura 4A). Le colture vengono visualizzate con microscopia a fluorescenza per identificare le cellule che esprimono eGFP e mediante microscopia a contrasto di fase per determinare il numero totale di cellule presenti nello stesso camp...

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Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire knockout genici che sono embrionali letali in vivo in tumori derivati da modelli murini geneticamente modificati e quindi valutare l'effetto che il knockout ha sulla crescita, proliferazione, sopravvivenza, migrazione, invasione e trascrittoma in vitro e in vivo.

Definizione delle funzioni geniche nella tumorigenesi mediante ablazione ex vivo di alleli floxed in cellule tumorali maligne della guaina del nervo periferico

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Questo protocollo fornisce un metodo alternativo in vivo per studiare il ruolo di crescita tumorale di un knockout genico letale embrionale. Il vantaggio di questo metodo è che i knockout genici che sono normalmente letali embrionali possono essere eseguiti in tumori derivati da un modello murino geneticamente modificato per studiare i loro effetti di perdita di funzione in vivo. Questa tecnica può essere applicata a malattie che richiedono lo studio del ruolo in vivo di geni essenziali embrionali irraggiungibili dai tradizionali modelli murini knockout genici.La generazione del modello animale richiede tempo e sono necessari test empirici per determinare il MOI ottimale per l'infezione adenovirale per garantire che venga raggiunta una ricombinazione appropriata. Per cominciare, identifica il mouse con il genotipo desiderato. Quando un topo portatore di tumore raggiunge il suo punto finale umano, eutanasizzare il topo e utilizzare un coltello da bisturi sterile per rimuovere il tumore.Sezionare il tumore in tre sezioni in tagli in stile pagnotta di pane usando un coltello a bisturi per generare i segmenti di tessuto per la paraffina di fissazione della formalina incorporando la generazione di colture a passaggio precoce e il congelamento flash per le analisi analitiche. Macchiare una sezione di tessuto fissata in formalina di cinque micrometri e incorporata in paraffina con ematossilina ed eosina. Una volta che un patologo conferma il tumore, eseguire la colorazione immunoistochimica per confermare la diagnosi del tumore.Posizionare il tessuto tumorale della guaina del nervo periferico maligno appena raccolto in 10 millilitri di PBS sterile ghiacciato su ghiaccio, quindi trasferirlo in un'area di lavoro sterile per stabilire colture di passaggio precoce. Tritare il tessuto tumorale in pezzi da due a quattro millimetri e triturare da otto a 10 volte in un piatto di coltura tissutale trattato con 10 centimetri quadrati contenente 10 millilitri di terreno di coltura. Coltivare questi tessuti in mezzo di crescita DMEM-10 ad alto contenuto di glucosio integrato con 10 neuregulin-1 beta nanomolari e due forskolin micromolari.Seminare le cellule tumorali a passaggio precoce ad una densità di 1,5 volte 10 alla sesta cellula per un piatto di coltura tissutale trattato di 10 centimetri quadrati contenente terreno di coltura DMEM-10. Dopo 12-16 ore, lavare le colture aderenti con due o quattro millilitri di DPBS e infettare le cellule con adenovirus a circa 400 unità di formazione della placca per cellula in 10 millilitri di DMEM privo di siero. Dopo 48 ore dall'infezione, controllare brevemente le cellule per il segnale EGFP su un microscopio a fluorescenza per garantire un'infezione efficiente con circa il 50-100% di cellule positive, quindi FACS ordina le cellule infette EGFP-positive.Dopo lo smistamento FACS, lasciare che le cellule recuperino in un incubatore di colture tissutali per almeno 24-48 ore, quindi preparare le cellule per analisi cellulari in vitro o innesti in vivo. Confermare la delezione di Erbb4 eseguendo la PCR utilizzando DNA genomico isolato da una porzione delle cellule EGFP-positive ordinate. Eseguire i test di proliferazione nei prossimi sette giorni su cellule tumorali selezionate placcate in una piastra a 96 pozzetti utilizzando un citometro automatizzato basato su immagini.Colora le cellule con ganci e coloranti allo ioduro di propidio e cattura le immagini delle cellule usando un lettore automatico di lastre per contare il numero di cellule vive e morte in ciascun pozzetto. Isolare l'RNA totale da cellule tumorali selezionate utilizzando il fenolo guanidinio acido standard e il metodo a base di cloroformio. Aprire il software per eseguire l'allineamento della sequenza di RNA seguendo i passaggi specifici del programma utilizzando le impostazioni predefinite.Selezionare il metodo di analisi, la ricerca dell'RNA, quindi selezionare il genoma di riferimento del topo. Caricare il file BED se fornito dal nucleo di sequenziazione. Caricare i file di sequenziazione FASTQ e assegnare nomi di replica univoci ai file.Raggruppare i file FASTQ e designare i file in un set di replica. Per l'analisi statistica e di normalizzazione per identificare i segnali di espressione genica differenziale con una robusta potenza statistica, aprire il software di analisi e selezionare i file GFP FASTQ come set di dati di controllo. Quindi, selezionare DESeq2 come metodo statistico e di normalizzazione e avviare l'assemblaggio e l'analisi.Utilizzare i set di dati di ontologia genica integrati negli strumenti di analisi dell'arricchimento funzionale ad accesso aperto per eseguire l'analisi di arricchimento funzionale sul DEG mediato da Erbb4 statisticamente significativo identificato per determinare il significato biologico e del percorso della perdita del gene Erbb4. Iniettare le cellule tumorali nel nervo sciatico del topo anestetizzato per valutare il potenziale di crescita dell'allotrapianto in vivo nelle cellule post-infette. Una volta che il tumore raggiunge le dimensioni richieste, sezionare il tumore da un topo eutanasizzato in due-tre sezioni, come dimostrato in precedenza.Fissare una sezione di tessuto in 4% Paraformaldeide durante la notte, quindi incorporare la sezione fissa nella paraffina. Dopo aver realizzato sezioni spesse cinque micrometri dal tessuto FFPE, montare la sezione sui vetrini e confermare la presenza di cellule tumorali nel tessuto innestato utilizzando H & E e immunocolorazione come dimostrato in precedenza. Per confermare in vivo le differenze di espressione di Erbb4 tra le due condizioni sperimentali, colorare il tessuto fissato con formalina e incorporato nella paraffina con anticorpi specifici di Erbb4.È stata analizzata la trasduzione delle cellule tumorali maligne della guaina del nervo periferico con adenovirus. Le cellule che esprimono EGFP sono state rilevate utilizzando la microscopia a fluorescenza e il numero totale di cellule è stato determinato utilizzando la microscopia a contrasto di fase. Dopo l'ablazione genica mediata da Cre, a seconda dell'efficienza della trasfezione, la genotipizzazione PCR ha mostrato un knockout genico completo e una popolazione eterogenea di cellule indotte e non indotte rispetto alla trasduzione di controllo.L'istopatologia caratteristica riscontrata negli alloinnesti ortotopici dei tessuti tumorali maligni della guaina nervosa periferica rispetto ai tumori derivati dai modelli animali originali geneticamente modificati ha dimostrato una differenza nella morfologia cellulare. L'ablazione di Erbb4 ha ridotto la densità cellulare e la proliferazione cellulare nelle cellule adeno5-CMV-Cre-ablate controlla le cellule adeno5-CMV-GFP-trasdotte. L'espressione di Erbb4 nelle cellule tumorali trasdotte con adeno5-CMV-Cre, o virus EGFP, è diminuita nel risultato in alloinnesti trasdotti adeno5-CMV-Cre rispetto ai tumori alloinnesto trattati con adeno5-CMV-EGFP di controllo.La densità vascolare è stata valutata tramite il rilevamento dell'immunoreattività per CD31 e i risultati rappresentativi hanno mostrato una densità vascolare marcatamente ridotta negli alloinnesti di cellule adeno5-CMV-Cre-trasdotte rispetto alle cellule trasdotte da adeno5-CMV-EGFP di controllo. Dopo l'ablazione genica, le cellule possono essere utilizzate per molti diversi tipi di saggi basati su cellule come proliferazione, migrazione, crescita 3D o alterazioni del microambiente, nonché per iniezioni ortotopiche in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

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Ex Vivo Imaging dei linfociti T CD8 residente nel tumore del polmone umano mediante microscopia confocale a fette

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

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In Vivo EPR valutazione di pH, pO2, lo stato Redox e le concentrazioni di fosfato e glutatione nel microambiente tumorale

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

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Un modello In Vivo murino nervo sciatico di invasione perineurale

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Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

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Rilevazione in tempo reale nell'apoptosi delle cellule tumorali in Vitro indotta da CD8+ T cellule per studiare funzioni immuni soppressive di tumore-infiltrazione di cellule mieloidi

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Screening di immunogenicità delle vescicole extracellulari derivate dal tumore mediante citometria a flusso delle cellule T della milza

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Modello organoide delle delezioni geniche mediate da Adenovirus-Cre in cellule uroteliali di topo

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Coltura e imaging di fette tumorali ex vivo di pseudomixoma peritonei organotipico da campioni tumorali umani resecati

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Genome-Scale Screening to Identify and Compare Therapeutic Targets in Tumors

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Finding New Therapeutic Targets for Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Through Genome-Scale shRNA Screens (Video) | JoVE

Profilazione genetica e screening dell'abbandono su scala genomica per identificare bersagli terapeutici in modelli murini di tumore maligno della guaina nervosa periferica

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...