Name: defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

이 연구는 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소 (R01 NS048353, R01 NS109655), 국립 암 연구소 (R01 CA122804), 국방부 (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 및 W81XWH-15-1-0193) 및 어린이 종양 재단 (2014-04-001 및 2015-05-007)의 보조금으로 지원되었습니다.

생쥐와 함께 절차를 수행하기 전에 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 검토하고 승인해야합니다. 이 원고에 설명 된 프로토콜은 사우스 캐롤라이나 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 MUSC의 제도적 동물 관리 지침에 따라 적절하게 훈련 된 인력에 의해 수행되었습니다.
1. Erbb4 flox 대립유전자에 대...

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여기에 제시된 상세한 방법은 MPNST의 GEM 모델을 사용하여 개발되었습니다. 그러나, 관심있는 종양 조직이 개별 세포 내로 분산될 수 있다면, 이들 방법론은 GEMs에서 발생하는 다양한 종양 유형에 대해 쉽게 적응할 수 있다. 플록스된 대립유전자가 i) 종양을 스크리닝하기에 충분한 마우스를 수득하는 것을 어렵게 만들 수 있는 감소된 생존, 또는 ii) 충분한 종양 보유 마우스를 수득하는 것을 어렵게...

지난 이십 년 전에 인간 암의 치료는 DNA를 손상시키거나 DNA 합성을 억제함으로써 빠르게 증식하는 세포 집단을 광범위하게 표적으로 삼는 방사선 요법 및 화학 요법제에 크게 의존했습니다. 이러한 접근법은 암세포 성장을 억제했지만, 장내 상피 세포 및 모낭 세포와 같은 정상적인 빠르게 증식하는 세포 유형에도 해로운 부작용이있었습니다. 최근에, 암 치료는 개별 환자의 신 생물의 성장에 매우 중요한 신호 전달 경로 내에서 단백질을 정확하게 표적화하는 화학 요법제를 활용하기 시작했습니다. 일반적으로 "정밀 의학"이라고하는이 접근법은 모노클로날 항체 및 소형 분자 억제제의 끊임없이 확장되는 레퍼토리의 개발로 이어졌습니다. 이들 제제는 종양 세포 증식 및 생존을 효과적으로 억제하면서 종래의 화학요법제 및 방사선요법으로 보이는 정상 세포 유형에 대한 해로운 부작용을 회피한다. 인간 암의 치료에 사용되는 모노클로날 항체는 가장 일반적으로 표적 세포 표면 분자, 예컨대 성장 인자 수용체 1 (예를 들어, 막-스패닝 수용체 티로신 키나제의 큰 패밀리) 및 면역 반응 조절제2 (예를 들어, 프로그램된 세포 사멸 단백질 1, 프로그램된 사멸-리간드1)를 표적으로 한다. 소분자 억제제는 세포내 표면 단백질 또는 세포내 위치하는 신호전달 단백질 중 하나를 억제할 수 있다3. 그러나, 이러한 새로운 치료제를 효과적으로 채용하기 위해서는, 특정 암이 후보 치료제에 의해 표적화되고 있는 분자에 의존한다는 것이 확립되어야 한다.
이러한 새로운 치료제는 더 집중된 효과를 가지고 있지만, 그들 중 다수는 여전히 하나 이상의 단백질의 작용을 억제한다. 또한, 다양한 효과 및 특이성을 갖는 다수의 제제가 종종 특정 단백질을 표적화하기 위해 이용가능하다. 결과적으로, 전임상 조사 동안, 후보 단백질을 치료 표적으로 검증하기 위해 유전자 절제와 같은 추가적인 접근법을 사용하는 것이 현명하다. 단백질을 치료 표적으로서 검증하는데 특히 유용한 접근법 중 하나는 관심있는 특정 암 유형을 개발하는 유전자 조작된 동물 모델에서 후보 단백질을 코딩하는 유전자를 절제하는 것이다. 이 접근법은 널 돌연변이 (자연 돌연변이, 유전자 조작 된 널 돌연변이 [ "녹아웃"), 또는 유전자 트랩에 의해 도입 된 널 돌연변이)를 가진 마우스가 이용 가능하고 마우스가 성인기까지 생존 할 수있는 경우 상대적으로 간단 할 수 있습니다. 불행히도, 이러한 기준을 충족하는 null 돌연변이를 가진 마우스는 종종 사용할 수 없으며, 일반적으로 null 돌연변이가 배아 적으로 또는 출생 후 삶의 첫날에 사망을 초래하기 때문입니다. 이러한 상황에서, 관심있는 종양 유형을 개발하기 쉬운 마우스는 대신 관심있는 유전자의 주요 세그먼트가 loxP 부위 ( "floxed")에 의해 측면 인 마우스로 교차 될 수 있으며, 이는 Cre 재조합 효소를 발현하는 이식 유전자를 종양 세포 내로 도입함으로써 유전자가 절제되도록 허용한다 (조건부 녹아웃). 이 방법은 몇 가지 이점을 제공합니다. 첫째, Cre 구동기가 종양에서 발현되지만 종래의 녹아웃에서 사망을 초래한 세포 유형에서는 발현되지 않는 경우, 이러한 접근법은 잠재적으로 후보 치료 표적을 검증할 수 있다. 둘째, 후보 단백질을 코딩하는 유전자를 종양 세포에서 절제하지만 종양-관련 섬유아세포 또는 면역 세포와 같은 다른 종양내 요소에서는 검출하지 못하도록, 조사자는 치료 표적의 세포-자율 및 비-세포-자율 효과를 구별할 수 있게 한다. 마지막으로, 타목시펜-유도성 Cre 구동기(CreERT2)는 조사자가 종양 발달의 여러 단계에서 관심있는 유전자를 삭제하고 후보 치료제가 효과적일 가능성이 가장 높은 창을 정의할 수 있게 한다.
불행히도, GEM 모델에서 발생하는 종양에서 조건부 녹아웃의 사용을 제한 할 수있는 기술적 인 문제도 있습니다. 예를 들어, 종양 세포에서 발현되고 생명에 필수적인 정상 세포에서 유전자 결실을 피하는 Cre 구동기는 이용가능하지 않을 수 있다. 과소 평가 될 수있는 또 다른 문제는 Cre 및 CreERT2 드라이버가 종종 마우스에서 플록스 된 대립 유전자를 가변적으로 절제하여 GEM 암에서 null 돌연변이에 대한 모자이크증을 초래한다는 것입니다. 이것이 발생하면, 표적화된 유전자가 절제되지 않은 종양 세포는 계속해서 빠르게 증식할 것이고, 절제된 대립유전자로 종양 세포를 과성장시킬 것이다. Cre 구동선에서의 모자이크주의는 표적화된 혈통에서의 비유비쿼터스 Cre 발현으로 인해 그리고 Cre 발현4와 무관하게 개별 세포에서의 실패한 재조합에 의해 발생할 수 있다. 이것은 셀 유형에 의존하는 Cre 드라이버의 알려진 현상이며 실험 설계 및 데이터 해석 중에 고려해야합니다. 모자이시즘은 녹아웃의 효과를 가릴 수 있으며 관심있는 유전자가 종양 세포 증식 및 / 또는 생존에 필수적이지 않으므로 유효한 치료 표적이 아니라는 잘못된 결론을 내릴 수 있습니다.
이러한 문제 중 몇몇은 수용체 티로신 키나제 erbB4가 MPNST 세포5에서 잠재적인 치료 표적인지 여부를 결정하기 위해 시도된 이전 연구에서 직면되었다. 이들 연구에서, 마우스는 슈완 세포 특이적 미엘린 단백질의 조절하에 뉴레귤린-1 (NRG1) 이형아교세포 성장 인자-β3 (GGFβ3)를 코딩하는 전이유전자를 발현하는 것을 프로모터제로 사용하였다 (P0-GGFβ3 마우스). P0-GGFβ3 마우스는 상염색체 우성 종양 감수성 증후군 신경섬유종증 유형 1(NF1)6을 갖는 환자에서 보이는 신경섬유종 병인 및 신경섬유종-MPNST 진행의 과정을 되풀이하는 과정을 통해 MPNST가 되도록 진행하는 다발성 신경섬유종을 개발한다. Trp53 널 돌연변이를 갖는 마우스에 교차시, 생성된 P0-GGFβ3; Trp53+/- 마우스는 cis-Nf1+/-에서 볼 수 있는 바와 같이 MPNSTs de novo를 개발하고; Trp53+/- 마우스.
이러한 MPNST는 세계 보건기구 (WHO) 등급 II에서 인간7에서 볼 수있는 WHO 등급 IV 병변으로의 진행을 재조정합니다. P0-GGFβ3 마우스에서, MPNSTs는 삼차 신경 (58 %) 및 척추 등쪽 신경 뿌리 (68 %)에서 기존의 플렉시 폼 신경 섬유종 내에서 발생한다7; P0-GGFβ3에서 발생하는 MPNSTs; Trp53+/- 마우스는 매우 유사한 분포를 갖는다. 인간에서 MPNST는 좌골 신경에서 가장 흔하게 발생하며 상완 신경총, 척추 신경 뿌리, 미주, 대퇴골, 정측, 천골 신경총, 포플라이트 폐쇄기 및 후부 경골 및 척골 신경이 뒤 따른다 8. 이러한 GEM 모델에서의 이러한 종양 분포는 인간에서 보이는 것과는 다소 다르다. 그러나, P0-GGFβ3 및P0-GGFβ3에서 발생하는 MPNSTs; Trp53+/- 마우스는 조직학적으로 인간 MPNST와 동일하고, 인간 MPNST에서 보이는 많은 동일한 돌연변이를 가지고 있으며, NF1 환자에서 보이는 신경섬유종-MPNST 진행의 과정을 재분석한다. P0-GGFβ3 또는 P0-GGFβ3의 생성; Erbb4-/-였던 Trp53+/- 마우스는 두 개의 Erbb4 널 대립유전자를 가진 마우스가 심장 결함9에 이차적인 배아 10.5일째에 utero에서 죽기 때문에 실현가능하지 않았다. 심장 특이적 Erbb4 전이유전자 (α-미오신 중쇄 (MHC)-Erbb4)를 도입함으로써 심장에서 Erbb4 발현을 구출하는 것은 생존 가능한 Erbb4-/- 마우스 10을 초래하기 때문에, 복잡한P0-GGFβ3을 갖는 마우스의 생성; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- 유전자형을 시도하였다.
그러나, 교미는 예상된 멘델 비율에서 마우스를 생성하지 않았고, 이는 원하는 유전자형이 해롭다는 것을 나타낸다. 따라서, P0-GGFβ3의 생성; Floxed Erbb4 대립유전자11 및 CreERT2 드라이버를 갖는 Trp53+/- 마우스는 이들 마우스에서 발생하는 MPNST에서 Erbb4의 결실을 허용하도록 시도되었다. 이 동물들에서, 손상되지 않은 Erbb4 대립 유전자를 가진 수많은 종양 세포가 여전히 존재했다 (모자이크증). 관찰 된 모자이크주의는 비효율적 인 타목시펜 전달로 인해 조직 내 재결합 효율의 차이가 발생할 수 있습니다. 자발적인 보상 메커니즘의 가능성은 Erbb4 발현에 대한 요구 사항을 우회함으로써 타목시펜 매개 재조합에서 모자이크주의에 더 기여할 수 있습니다. Trp53의 손실로 인해 종양 세포는 데이터의 해석을 혼란스럽게 할 수있는 추가적인 자발적인 "허용적"돌연변이에 취약해질 수 있습니다. Erbb4-온전한 MPNST 세포가 다른 종양 세포에서 Erbb4를 절제하는 결과를 가릴 가능성이 높아 보였기 때문에이 접근법은 포기되었습니다.
이러한 장애물은 Cre 재조합효소 및 eGFP를 발현하는 아데노바이러스를 사용하는 매우 초기 통과 MPNST 세포에서 Erbb4를 절제하기 위한 방법론의 개발로 이어졌다. 이들 세포는 FACS를 사용하여 감염되지 않은 세포로부터 분리될 수 있으며, 이는 절제된 Erbb4 유전자에 대한 모자이크주의를 현저하게 감소시킨다. 이하에는, 이를 달성하기 위해 사용된 방법들이 시험관내 및 생체내에서 유전자 절제의 효과를 평가하기 위해 사용된 방법들과 함께, 설명된다. 다음 프로토콜은 생체내 동종이식편 종양 성장 평가 전에 생체외 절제에 대해 관심있는 배아 치사 유전자의 플록스 대립유전자를 운반하는 종양을 생산하는 종양 보유 마우스를 생산하는 방법의 예이다. 여기에는 Erbb4 절제가 동위원소 동종이식편에서의 종양 세포 증식, 생존 및 시험관내 및 증식, 생존 및 혈관신생에 미치는 영향을 분석하기 위해 사용되는 접근법에 대한 설명이 포함된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad5CMV-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad5CMVCre-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-1174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alexa 568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>GaR A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>http://www.bioconductor.org</td>
			<td>alternative statistical analysis tool used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td>mixture of chelators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)</td>
			<td>DAVID</td>
			<td>https://david.ncifcrf.gov</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>EP0701 and K1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab35374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HFR1: 05-1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeSpace Tools and Data Sources</td>
			<td>GenomeSpace</td>
			<td>https://genomespace.org/support/tools/</td>
			<td>general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice</td>
			<td>Envigo (Previously Harlan Labs)</td>
			<td>69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Hi Seq 2500</td>
			<td>DNA sequencer used for step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis</td>
			<td>DNAStar LaserGene software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software statistical and normalization analysis used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor basement membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRG1-beta</td>
			<td>In house</td>
			<td>Generated by SLC, also commercially available from R &#38; D Systems(396-HB-050/CF).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain Hoeschst 33342</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panther Gene Ontology Classification System</td>
			<td>Panther</td>
			<td>http://pantherdb.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partek (BWA aligner and analyzer)</td>
			<td>Partek, Ver 7</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment and statistical/normalization used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1: 5&#8242;-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT 
			GTCTG- 3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2: 5&#8242;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC 
			AGAAGC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Primer 3: 5&#8242;-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA 
			ACCCAG-3&#8242;
			</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 3: 350&#8201;bp wild-type ErbB4 product.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>51-351-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ARY003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9712</td>
			<td>bioluminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ToppGene Suite</td>
			<td>ToppGene</td>
			<td>https://toppgene.cchmc.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide Signal Amplification Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL721001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells

인간 암의 핵심 단백질을 정확하게 표적으로 삼는 신약 개발은 암 치료제를 근본적으로 변화시키고 있습니다. 그러나 이러한 약물을 사용하기 전에 표적 단백질이 특정 암 유형에서 치료 표적으로 검증되어야합니다. 이 검증은 종종 암의 유전자 조작 마우스 (GEM) 모델에서 후보 치료 표적을 코딩하는 유전자를 녹아웃하고 이것이 종양 성장에 어떤 영향을 미치는지 결정함으로써 수행됩니다. 불행히도, 기존의 녹아웃에서의 배아 치사율과 조건부 녹아웃에서의 모자이크주의와 같은 기술적 인 문제는 종종이 접근법을 제한합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, GEM 모델에서 생성된 악성 말초 신경 시스 종양(MPNSTs)의 단기 배양에 관심 있는 플록싱된 배아 치사 유전자를 절제하기 위한 접근법이 개발되었다.
이 논문은 적절한 유전자형을 갖는 마우스 모델을 확립하고, 이들 동물로부터 단기 종양 배양을 도출한 다음, Cre 재조합효소 및 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 플록싱된 배아 치사 유전자를 제거하는 방법을 기술한다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 아데노바이러스로 형질도입된 세포의 정제 및 유전자 절제가 세포 증식, 생존력, 전사체 및 동위원소 동종이식편 성장에 미치는 영향의 정량화를 상세화한 다음, 상세히 설명한다. 이러한 방법론은 시험관내 및 생체내에서 치료 표적을 확인하고 검증하기 위한 효과적이고 일반화 가능한 접근법을 제공한다. 이러한 접근법은 또한 감소된 시험관내 성장 아티팩트를 갖는 저통과 종양 유래 세포의 재생 가능한 공급원을 제공한다. 이를 통해 표적 유전자의 생물학적 역할은 분비물에 의해 매개되는 이동, 침윤, 전이 및 세포간 통신과 같은 다양한 생물학적 과정에서 연구될 수 있게 한다.

도 4는 P0-GGFβ3을 형질도입할 때 얻어지는 전형적인 결과를 도시한다; Trp53-/+; Ad5CMV-eGFP 아데노바이러스 또는 Ad5CMV-Cre/eGFP 아데노바이러스를 갖는 Erbb4fl/fl MPNST 세포(그림 4A). 배양물을 형광 현미경으로 관찰하여 eGFP 발현 세포를 확인하고 위상차 현미경으로 10x (상단) 및 40x (하단)에서 동일한 분야에 존재하는 총 세?...

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Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

여기에서, 우리는 유전자 조작된 마우스 모델 유래 종양 에서 생체내에서 배아 치사되는 유전자 녹아웃을 수행하기 위한 프로토콜을 제시하고, 이어서 녹아웃이 종양 성장, 증식, 생존, 이동, 침윤 및 시험 관내 및 생체내에서 전사체에 미치는 영향을 평가한다.

악성 말초 신경 시스 종양 세포에서 Floxed 대립 유전자의 Ex vivo 절제에 의한 종양 발생에서 유전자 기능 정의

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

이 프로토콜은 배아 치사 유전자 녹아웃의 종양 성장 역할을 연구하기 위한 대안적인 생체내 방법을 제공한다. 이 방법의 장점은 일반적으로 배아 치사성인 유전자 녹아웃이 생체 내에서 그들의 기능 상실 효과를 연구하기 위해 유전자 조작된 마우스 모델로부터 유래된 종양에서 수행될 수 있다는 것이다. 이 기술은 전통적인 유전자 녹아웃 마우스 모델로부터 달성할 수 없는 배아 필수 유전자의 생체내 역할을 연구할 필요가 있는 질환에 적용될 수 있다.동물 모델을 생성하는 데는 적절한 재조합이 달성되도록 하기 위해 아데노바이러스 감염에 대한 최적의 MOI를 결정하기 위해 시간이 걸리고 경험적 테스트가 요구된다. 우선, 원하는 유전자형을 가진 마우스를 확인하십시오. 종양을 가진 마우스가 인간 종말점에 도달하면 마우스를 안락사시키고 멸균 메스 나이프를 사용하여 종양을 제거하십시오.메스 나이프를 사용하여 빵 덩어리 스타일의 절단으로 종양을 세 개의 절편으로 해부하여 초기 통과 배양 생성 및 분석 분석을 위해 플래시 동결을 포매하는 포르말린 고정 파라핀을위한 조직 세그먼트를 생성합니다. 다섯 마이크로미터 두께의 포르말린 고정, 파라핀 포매된 조직 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색합니다. 병리학자가 종양을 확인하면 면역 조직 화학 염색을 수행하여 종양 진단을 확인하십시오.갓 채취한 악성 말초 신경 외피 종양 조직을 얼음 위에 얼음처럼 차가운 멸균 PBS 10밀리리터에 넣은 다음, 이를 멸균 작업 영역으로 옮겨 조기 통과 배양을 확립한다. 종양 조직을 두 개 내지 4밀리미터 조각으로 분쇄하고, 10 밀리리터의 성장 배지를 함유하는 10 평방 센티미터 처리된 조직 배양 접시에 여덟 내지 10회 트리투레이트한다. 이들 조직을 10 나노몰 뉴레귤린-1 베타 및 2개의 마이크로몰 포스콜린으로 보충된 고 글루코스 DMEM-10 성장 배지에서 배양한다.조기에 계대된 종양 세포를 1.5배의 밀도로 10 내지 10 평방 센티미터 당 여섯 번째 세포로 시드하고 DMEM-10 성장 배지를 함유하는 조직 배양 접시를 처리하였다. 12 내지 16시간 후, 부착성 배양물을 2 내지 4밀리리터의 DPBS로 세척하고, 세포를 무혈청 DMEM의 10 밀리리터에서 세포당 대략 400개의 플라크 형성 단위로 아데노바이러스로 감염시킨다. 감염 48시간 후, 약 50 내지 100% 양성 세포로 효율적으로 감염되었는지 확인하기 위해 형광 현미경으로 EGFP 신호에 대한 세포를 간략하게 확인한 다음, FACS가 EGFP 양성 감염된 세포를 분류한다.FACS 분류 후, 세포를 조직 배양 배양기에서 적어도 24 내지 48시간 동안 회수하게 하고, 이어서 시험관내 세포 기반 분석 또는 생체내 이식을 위한 세포를 준비한다. 분류된 EGFP 양성 세포의 일부로부터 분리된 게놈 DNA를 사용하여 PCR을 수행하여 Erbb4 결실을 확인하였다. 이미지 기반 자동 세포계를 사용하여 96-웰 플레이트에 플레이팅된 분류된 종양 세포 상에서 다음 7일에 걸쳐 증식 검정을 수행한다.후크와 프로피듐 요오드화 염료로 세포를 얼룩지게하고 자동화 된 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 계산하여 세포의 이미지를 캡처하십시오. 표준 산 구아니디늄 페놀 및 클로로포름 기반 방법을 사용하여 분류된 종양 세포로부터 총 RNA를 분리하십시오. 소프트웨어를 열어 기본 설정을 사용하여 프로그램별 단계에 따라 RNA 서열 정렬을 수행합니다.분석 방법, RNA 탐색을 선택한 다음 마우스 참조 게놈을 선택합니다. 시퀀싱 코어에서 제공하는 경우 BED 파일을 업로드합니다. FASTQ 시퀀싱 파일을 업로드하고 파일에 고유한 복제 이름을 할당합니다.그룹은 FASTQ 파일을 복제하고 파일을 복제 세트로 지정합니다. 강력한 통계적 파워로 차등 유전자 발현 신호를 식별하기 위한 통계 및 정규화 분석을 위해, 분석 소프트웨어를 열고 GFP FASTQ 파일을 제어 데이터 세트로 선택하십시오. 그런 다음 통계 및 정규화 방법으로 DESeq2를 선택하고 어셈블리 및 분석을 시작합니다.오픈 액세스 기능적 농축 분석 도구에 통합된 유전자 온톨로지 데이터 세트를 사용하여 통계적으로 유의한 확인된 Erbb4 매개된 DEG에 대한 기능적 농축 분석을 수행하여 Erbb4 유전자 손실의 생물학적 및 경로 유의성을 결정한다. 종양 세포를 마취된 마우스의 좌골 신경에 주입하여 감염 후 세포에서 생체내 동종이식편 성장 잠재력을 평가한다. 종양이 필요한 크기에 도달하면, 이전에 입증된 바와 같이 안락사된 마우스로부터 종양을 두세 개의 절편으로 해부한다.하룻밤 사이에 하나의 조직 절편을 4% 파라포름알데히드에 고정시킨 다음, 고정된 부분을 파라핀에 내장시킨다. FFPE 조직에서 다섯 마이크로 미터 두께의 절편을 만든 후 슬라이드에 섹션을 장착하고 이전에 입증 된 바와 같이 H & E 및 면역 염색을 사용하여 이식 된 조직에서 종양 세포의 존재를 확인하십시오. 두 실험 조건 간의 생체내 Erbb4 발현 차이를 확인하기 위해, 포르말린 고정, 파라핀 포매된 조직을 Erbb4 특이적 항체로 염색한다.악성 말초 신경 외피 종양 조직 세포의 형질도입을 아데노바이러스로 분석하였다. EGFP 발현 세포를 형광현미경을 이용하여 검출하고, 총 세포 수는 위상차 현미경을 이용하여 측정하였다. 형질감염 효율에 따라 Cre 매개 유전자 절제 후, PCR 유전자형은 대조군 형질도입에 비해 완전한 유전자 녹아웃 및 유도 및 유도되지 않은 세포의 이종 집단을 나타내었다.악성 말초 신경 시스 종양 조직의 동위원소 동종이식편에서 발견된 특징적인 조직병리학은 원래의 유전자 조작된 동물 모델로부터 유래된 종양과 비교하여 세포 형태학의 차이를 입증하였다. Erbb4 절제는 아데노5-CMV-Cre-ablated 세포 조절 아데노5-CMV-GFP-형질도입된 세포에서 세포 밀도 및 세포 증식을 감소시켰다. 아데노5-CMV-Cre 또는 EGFP 바이러스로 형질도입된 종양 세포에서 Erbb4의 발현은, 대조군 아데노5-CMV-EGFP 처리된 동종이식편 종양에 비해 아데노5-CMV-Cre 형질도입된 동종이식편에서 감소하였다.혈관 밀도는 CD31에 대한 면역반응성 검출을 통해 평가되었고, 대표적인 결과는 대조군 아데노5-CMV-EGFP 형질도입된 세포에 비해 아데노5-CMV-Cre 형질도입된 세포의 동종이식편에서 현저하게 감소된 혈관 밀도를 나타냈다. 유전자 절제 후, 세포는 증식, 이동, 3D 성장 또는 미세 환경 변경뿐만 아니라 생체 내 동위원소 주사와 같은 많은 다른 유형의 세포 기반 분석에 사용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

연구

암 연구학

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실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

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생체 내 비장 T 세포의 유세포 분석기에 의한 종양 유래 세포밖 소포의 면역원성 스크리닝

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

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Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

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절제된 인간 종양 표본에서 생체 외 유기형 가성 점액종 복막 종양 절편의 배양 및 이미징

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Genome-Scale Screening to Identify and Compare Therapeutic Targets in Tumors

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Finding New Therapeutic Targets for Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Through Genome-Scale shRNA Screens (Video) | JoVE

악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...