Name: defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353, R01 NS109655), National Cancer Institute (R01 CA122804), Forsvarsdepartementet (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 og W81XWH-15-1-0193), og The Children's Tumor Foundation (2014-04-001 og 2015-05-007).

Før du utfører noen prosedyrer med mus, må alle prosedyrer gjennomgås og godkjennes av Institutional Animal Care and Use Committee. Protokollen beskrevet i dette manuskriptet ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Medical University of South Carolina. Denne protokollen ble utført av riktig opplært personell i henhold til MUSCs institusjonelle retningslinjer for dyrepleie.
1. Generering av mus som utvikler MPNT homozygot for Erbb4 flox a...

<ol>
	<li>Ricciuti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates+for+lung+cancer+in+the+era+of+personalized+oncology.">Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology.</a> Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).</li><li>Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+axis+in+glioblastoma+multiforme.">PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).</li><li>Roskoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+FDA-approved+small+molecule+protein+kinase+inhibitors.">Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors.</a> Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).</li><li>Heffner, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+conditional+mouse+mutagenesis+with+a+comprehensive+cre+characterization+resource.">Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource.</a> Nature Communications. 3, 1218 (2012).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB4+promotes+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis+via+Ras-independent+mechanisms.">ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms.</a> Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).</li><li>Kazmi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+overexpressing+neuregulin-1+model+neurofibroma-malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+progression+and+implicate+specific+chromosomal+copy+number+variations+in+tumorigenesis.">Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).</li><li>Brosius, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+overexpression+and+Trp53+haploinsufficiency+cooperatively+promote+de+novo+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis.">Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis.</a> Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).</li><li>Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.+A+clinicopathologic+study+of+120+cases.">Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases.</a> Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).</li><li>Gassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+neural+and+cardiac+development+in+mice+lacking+the+ErbB4+neuregulin+receptor.">Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor.</a> Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).</li><li>Tidcombe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+and+mammary+gland+defects+in+ErbB4+knockout+mice+genetically+rescued+from+embryonic+lethality.">Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality.</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).</li><li>Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+characteristics+of+a+nervous+system-specific+erbB4+knock-out+mouse.">Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse.</a> Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).</li><li>Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+neuropathies+and+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+in+transgenic+mice+overexpressing+glial+growth+factor+beta3+in+myelinating+Schwann+cells.">Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells.</a> Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).</li><li>Jackson-Fisher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Neu/ErbB2-induced+mammary+tumors+is+unaffected+by+loss+of+ErbB4.">Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4.</a> Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).</li><li>Byer, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen+inhibits+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+growth+in+an+estrogen+receptor-independent+manner.">Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner.</a> Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+utility+of+SOX10+to+distinguish+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+from+synovial+sarcoma,+including+intraneural+synovial+sarcoma.">Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma.</a> Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genomic+characterization+of+a+sporadic+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+line.">Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cstf2t+regulates+expression+of+histones+and+histone-like+proteins+in+male+germ+cells.">Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells.</a> Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).</li><li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63,+MHC+class+1,+and+CD47+identify+subsets+of+extracellular+vesicles+containing+distinct+populations+of+noncoding+RNAs.">CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+promote+regenerative+growth+in+sensory+neurons.">Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normalization+and+differential+expression+analyses+using+RNA-Seq+data+from+726+individual+Drosophila+melanogaster.">Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 17, 28 (2016).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Huang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DAVID+Gene+Functional+Classification+Tool:+a+novel+biological+module-centric+algorithm+to+functionally+analyze+large+gene+lists.">The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists.</a> Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+map:+a+network-based+method+for+gene-set+enrichment+visualization+and+interpretation.">Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation.</a> PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).</li><li>Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+gene-set+enrichment+analysis+of+RNA-Seq+data+with+small+replicates.">Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates.</a> PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).</li><li>Koch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+analysis+of+RNA+sequencing+data.">A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).</li><li>Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+xenografting+of+human+luciferase-tagged+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells+for+in+vivo+testing+of+candidate+therapeutic+agents.">Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).</li><li>Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G*Power+3:+a+flexible+statistical+power+analysis+program+for+the+social,+behavioral,+and+biomedical+sciences.">G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences.</a> Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+the+embryonic+nerve+roots+for+NF1-associated+plexiform+neurofibroma.">Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma.</a> Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).</li><li>Mo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+neurofibroma+model+from+induced+pluripotent+stem+cells+delineates+tumor+pathogenesis+and+developmental+origins.">Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).</li><li>Chau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+therapeutic+efficacy+of+a+novel+pharmacologic+inducer+of+apoptosis+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.">Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).</li><li>Dodd, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF1(+/-)+Hematopoietic+cells+accelerate+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+development+without+altering+chemotherapy+response.">NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response.</a> Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).</li><li>Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+beta+and+neuregulin-1+alpha+differentially+affect+the+migration+and+invasion+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells.">Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells.</a> Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).</li></ol>

De detaljerte metodene som presenteres her ble utviklet ved hjelp av en GEM-modell av MPNST-er. Men hvis tumorvevet av interesse kan spres i individuelle celler, er disse metodene lett tilpasningsdyktige for ulike tumortyper som oppstår i GEMs. Det er viktig å sikre at floxed allelet ikke resulterer i i) redusert overlevelse som kan gjøre det vanskelig å oppnå tilstrekkelige mus til å screene for svulster, eller ii) økt tumorforsinkelse som kan gjøre det vanskelig å oppnå nok tumorbærende mus. Hvis floxed alle...

Før de siste to tiårene var behandlingen av humane kreftformer avhengig av strålebehandling og kjemoterapeutiske midler som i stor grad målrettet raskt prolifererende cellulære populasjoner ved å skade DNA eller hemme DNA-syntese. Selv om disse tilnærmingene hemmet kreftcellevekst, hadde de også skadelige bivirkninger på normale raskt prolifererende celletyper som tarmepitelceller og hårsekkceller. Mer nylig har kreftbehandling begynt å bruke kjemoterapeutiske midler som nettopp retter seg mot proteiner i signalveier som er kritisk viktige for veksten av en enkelt pasients neoplasma. Denne tilnærmingen, ofte referert til som "presisjonsmedisin", har ført til utviklingen av et stadig voksende repertoar av monoklonale antistoffer og små molekylære hemmere. Disse midlene hemmer effektivt tumorcelleproliferasjon og overlevelse, samtidig som de unngår skadelige bivirkninger på normale celletyper sett med konvensjonelle kjemoterapeutiske midler og strålebehandling. Monoklonale antistoffer som brukes til behandling av humane kreftformer, retter seg oftest mot celleoverflatemolekyler som vekstfaktorreseptorer1 (f.eks. den store familien av membranspennende reseptortyrosinkinaser) og immunresponsmodulatorer2 (f.eks. programmert celledødsprotein 1, programmert dødligand 1). Små molekylære hemmere kan hemme enten celleoverflateproteiner eller signalproteiner som befinner seg intracellulært3. For å effektivt bruke disse nye terapeutiske midlene, må det imidlertid fastslås at en bestemt kreft er avhengig av molekylet som blir målrettet av et kandidat terapeutisk middel.
Selv om disse nye terapeutiske midlene har mer fokuserte effekter, hemmer mange av dem fortsatt virkningen av mer enn ett protein. I tillegg er flere midler med varierende effektivitet og spesifisitet ofte tilgjengelige for å målrette mot et bestemt protein. Derfor, under prekliniske undersøkelser, er det lurt å bruke flere tilnærminger som genetisk ablasjon for å validere et kandidatprotein som et terapeutisk mål. En spesielt nyttig tilnærming til å validere et protein som et terapeutisk mål er å ablate genet som koder kandidatproteinet i en genetisk konstruert dyremodell som utvikler den spesifikke krefttypen av interesse. Denne tilnærmingen kan være relativt enkel hvis mus med en nullmutasjon (enten en naturlig mutasjon, en genetisk konstruert nullmutasjon [en "knockout"] eller en nullmutasjon introdusert av en genfelle) er tilgjengelige, og musene er levedyktige i voksen alder. Dessverre er mus med en nullmutasjon som oppfyller disse kriteriene ofte ikke tilgjengelige, vanligvis fordi nullmutasjonen resulterer i død embryonalt eller i de første dagene av postnatallivet. I dette tilfellet kan mus som er utsatt for å utvikle tumortypen av interesse i stedet krysses til mus der nøkkelsegmenter av genet av interesse er flankert av loxP-steder ("floxed"), som gjør at genet kan ablated ved å introdusere et transgen som uttrykker Cre recombinase i tumorcellene (en betinget knockout). Denne tilnærmingen gir flere fordeler. For det første, hvis en Cre-driver er tilgjengelig som uttrykkes i svulsten, men ikke i celletypen som førte til døden i konvensjonelle knockouts, kan denne tilnærmingen potensielt validere kandidatens terapeutiske mål. For det andre, ved å ablisere genet som koder kandidatproteinet i tumorceller, men ikke i andre intratumorale elementer som tumorassosierte fibroblaster eller immunceller, kan etterforskeren skille mellom celleautonome og ikke-celle-autonome effekter av det terapeutiske målet. Til slutt tillater en tamoxifen-induserbar Cre-driver (CreERT2) etterforskeren å slette genet av interesse på forskjellige stadier i tumorutvikling og definere vinduet der kandidatens terapeutiske middel mest sannsynlig vil være effektivt.
Dessverre er det også tekniske problemer som kan begrense bruken av betingede knockouts i svulster som oppstår i GEM-modeller. For eksempel kan en Cre-driver som uttrykkes i tumorceller og unngår gensletting i normale celler som er essensielle for livet, ikke være tilgjengelig. Et annet problem, som kan undervurderes, er at Cre- og CreERT2-drivere ofte varierer floxed alleler hos mus, noe som resulterer i mosaikk for nullmutasjonen i en GEM-kreft. Når dette skjer, vil tumorceller der det målrettede genet ikke har blitt ablated fortsette å spre seg raskt, overgrowing tumorcellene med ablated alleler. Mosaicism i Cre driver linjer kan oppstå på grunn av ikke-allestedsnærværende Cre uttrykk i avstamningen målrettet og ved mislykket rekombinasjon i individuelle celler uavhengig av Cre uttrykk4. Dette er et kjent fenomen av Cre-drivere som er celletypeavhengige og bør vurderes under eksperimentell design og datatolkning. Mosaicism kan maskere effekten av knockout og føre en etterforsker til feilaktig å konkludere med at genet av interesse ikke er avgjørende for tumorcelleproliferasjon og / eller overlevelse og dermed ikke er et gyldig terapeutisk mål.
Flere av disse problemene ble oppdaget i en tidligere studie som forsøkte å avgjøre om reseptortyrosinkinase erbB4 var et potensielt terapeutisk mål i MPNST-celler5. I disse studiene ble mus brukt som uttrykker et transgen som koder for neuregulin-1 (NRG1) isoform glialvekstfaktor-β3 (GGFβ3) under kontroll av Schwann-cellespesifikt myelinprotein nullpromotor (P 0-GGFβ3 mus). P 0-GGFβ3 mus utvikler flere pleksiforme nevrofibromer som utvikler seg til å bli MPNT via en prosess som rekapitulerer prosessene for nevrofibroma patogenese og pleksiform nevrofibroma-MPNST progresjon sett hos pasienter med autosomal dominant tumor følsomhet syndrom nevrofibromatose type 1 (NF1)6. Når krysset til mus med en Trp53 null mutasjon, den resulterende P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus utvikler MPNSTs de novo som ses i cis-Nf1+/-; Trp53+/- mus.
Disse MPNST-ene rekapitulerer progresjonen fra lesjoner i Verdens helseorganisasjon (WHO) grad II til WHO grad IV sett hos mennesker7. Hos P 0-GGFβ3-mus oppstår MPNT i eksisterende pleksiforme nevrofibromer i trigeminusnerven (58 %) og spinale dorsale nerverøtter (68 %)7; MPNT-ene som oppstår i P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus har en svært lik fordeling. Hos mennesker oppstår MPNT oftest i isjiasnerven etterfulgt av plexus brachialis, spinalnerverøtter, vagus, femoral, median, sakral plexus, popliteal obturator og bakre tibial og ulnarnerve8. Denne tumorfordelingen i disse GEM-modellene er noe forskjellig fra det som ses hos mennesker. Imidlertid MPNT-ene som oppstår i P 0-GGFβ3 og P0-GGFβ3; Trp53+/- mus er histologisk identiske med humane MPNT-er, bærer mange av de samme mutasjonene som ses i humane MPNT-er, og rekapitulerer prosessen med nevrofibroma-MPNST-progresjon sett hos NF1-pasienter. Genereringen av P 0-GGFβ3 eller P0-GGFβ3; Trp53+/- mus som var Erbb4-/- var ikke gjennomførbare da mus med to Erbb4 null alleler dør in utero ved embryonal dag 10,5 sekundært til hjertefeil9. Fordi redning av Erbb4-uttrykk i hjertet ved å introdusere et hjertespesifikt Erbb4-transgen (α-myosin tung kjede (MHC)-Erbb4) resulterer i levedyktige Erbb4-/- mus10, generasjonen av mus med en komplisert P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- genotype ble forsøkt.
Parringene produserte imidlertid ikke mus i de forventede mendelske forholdene, noe som indikerer at den ønskede genotypen var skadelig. Derfor generasjonen av P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus med floxed Erbb4 alleler11 og en CreERT2 driver ble forsøkt å tillate sletting av Erbb4 i MPNSTene som oppstår i disse musene. I disse dyrene var mange tumorceller med intakte Erbb4-alleler fortsatt tilstede (mosaikk). Mosaikken som ble observert kunne skyldes ineffektiv tamoxifen-levering, noe som resulterte i forskjeller i rekombinasjonseffektivitet i vevet. Muligheten for spontane kompenserende mekanismer kan ytterligere bidra til mosaikk i tamoxifen-mediert rekombinasjon ved å omgå kravet til Erbb4-uttrykk. Det er mulig at tapet av Trp53 gjør tumorceller utsatt for ytterligere spontane "permissive" mutasjoner som kan forvirre tolkningen av dataene. Da det virket sannsynlig at Erbb4-intakte MPNST-celler ville maskere konsekvensene av å ablisere Erbb4 i andre tumorceller, ble denne tilnærmingen forlatt.
Disse hindringene førte til utviklingen av en metodikk for ablating Erbb4 i svært tidlig passasje MPNST celler ved hjelp av en adenovirus uttrykker Cre recombinase og eGFP. Disse cellene kan skilles fra ikke-infiserte celler ved hjelp av FACS, noe som markant reduserer mosaikk for det ablerte Erbb4-genet . Nedenfor beskrives metodene som brukes for å oppnå dette, sammen med metodene som brukes til å vurdere effekten av genablasjon in vitro og in vivo. Følgende protokoll er et eksempel på hvordan man produserer tumorbærende mus som gir svulster som bærer floxed alleler av embryonale dødelige gener av interesse for ex vivo eksisjon før in vivo allograft tumorvekstvurdering. Dette inkluderer en beskrivelse av tilnærmingene som brukes til å analysere effekten som Erbb4-ablasjon utøver på tumorcelleproliferasjon, overlevelse og genuttrykk in vitro og proliferasjon, overlevelse og angiogenese i ortotopiske allotransplantater.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad5CMV-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad5CMVCre-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-1174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alexa 568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>GaR A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>http://www.bioconductor.org</td>
			<td>alternative statistical analysis tool used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td>mixture of chelators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)</td>
			<td>DAVID</td>
			<td>https://david.ncifcrf.gov</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>EP0701 and K1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab35374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HFR1: 05-1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeSpace Tools and Data Sources</td>
			<td>GenomeSpace</td>
			<td>https://genomespace.org/support/tools/</td>
			<td>general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice</td>
			<td>Envigo (Previously Harlan Labs)</td>
			<td>69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Hi Seq 2500</td>
			<td>DNA sequencer used for step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis</td>
			<td>DNAStar LaserGene software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software statistical and normalization analysis used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor basement membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRG1-beta</td>
			<td>In house</td>
			<td>Generated by SLC, also commercially available from R &#38; D Systems(396-HB-050/CF).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain Hoeschst 33342</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panther Gene Ontology Classification System</td>
			<td>Panther</td>
			<td>http://pantherdb.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partek (BWA aligner and analyzer)</td>
			<td>Partek, Ver 7</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment and statistical/normalization used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1: 5&#8242;-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT 
			GTCTG- 3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2: 5&#8242;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC 
			AGAAGC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Primer 3: 5&#8242;-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA 
			ACCCAG-3&#8242;
			</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 3: 350&#8201;bp wild-type ErbB4 product.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>51-351-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ARY003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9712</td>
			<td>bioluminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ToppGene Suite</td>
			<td>ToppGene</td>
			<td>https://toppgene.cchmc.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide Signal Amplification Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL721001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells

Utviklingen av nye legemidler som nettopp retter seg mot nøkkelproteiner i humane kreftformer, endrer kreftbehandlingen fundamentalt. Men før disse stoffene kan brukes, må deres målproteiner valideres som terapeutiske mål i bestemte krefttyper. Denne valideringen utføres ofte ved å slå ut genet som koder for kandidatens terapeutiske mål i en genetisk konstruert musemodell (GEM) av kreft og bestemme hvilken effekt dette har på tumorvekst. Dessverre begrenser tekniske problemer som embryonal dødelighet i konvensjonelle knockouts og mosaikk i betingede knockouts ofte denne tilnærmingen. For å overvinne disse begrensningene ble det utviklet en tilnærming til å ablisere et floxed embryonalt dødelig gen av interesse for kortsiktige kulturer av ondartede perifere nerveskjedetumorer (MPNST) generert i en GEM-modell.
Dette papiret beskriver hvordan man etablerer en musemodell med riktig genotype, utleder kortsiktige tumorkulturer fra disse dyrene, og deretter ablate det floxed embryonale dødelige genet ved hjelp av en adenoviral vektor som uttrykker Cre recombinase og forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP). Rensing av celler transducert med adenovirus ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og kvantifisering av effektene som genablasjon utøver på cellulær proliferasjon, levedyktighet, transkriptom og ortotopisk allograftvekst blir deretter detaljert. Disse metodene gir en effektiv og generaliserbar tilnærming til å identifisere og validere terapeutiske mål in vitro og in vivo. Disse tilnærmingene gir også en fornybar kilde til lavpassasje tumoravledede celler med reduserte in vitro vekstartefakter. Dette gjør at den biologiske rollen til det målrettede genet kan studeres i ulike biologiske prosesser som migrasjon, invasjon, metastase og intercellulær kommunikasjon formidlet av sekretomet.

Figur 4 illustrerer et typisk resultat oppnådd ved transdusering av P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl MPNST-celler med enten Ad5CMV-eGFP-adenovirus eller Ad5CMV-Cre/eGFP adenovirus (figur 4A). Kulturer ses med fluorescensmikroskopi for å identifisere eGFP-uttrykkende celler og ved fasekontrastmikroskopi for å bestemme totalt antall celler tilstede i samme felt ved 10x (topp) og 40x (bunn). Prosentandelen av ce...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Her presenterer vi en protokoll for å utføre gen knockouts som er embryonale dødelige in vivo i genetisk utviklede musemodellavledede svulster og deretter vurdere effekten som knockout har på tumorvekst, spredning, overlevelse, migrasjon, invasjon og transkriptomet in vitro og in vivo.

Definere genfunksjoner i tumorigenese ved ex vivo ablasjon av floxede alleler i ondartede perifere nerveskjede tumorceller

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Denne protokollen gir en alternativ in vivo metode for å studere tumorvekstrollen til et embryonalt dødelig gen knockout. Fordelen med denne metoden er at gen knockouts som normalt er embryonale dødelige, kan utføres i svulster avledet fra en genetisk konstruert musemodell for å studere deres tap av funksjonseffekter in vivo. Denne teknikken kan brukes på sykdommer som krever å studere in vivo-rollen som embryonale essensielle gener som ikke kan oppnås fra tradisjonelle gen knockout-musemodeller.Generering av dyremodellen tar tid, og empirisk testing er nødvendig for å bestemme optimal MOI for adenoviral infeksjon for å sikre at passende rekombinasjon oppnås. Til å begynne med, identifiser musen med ønsket genotype. Når en tumorbærende mus når sitt humane endepunkt, avliv musen og bruk en steril skalpellkniv for å fjerne svulsten.Disseker svulsten i tre seksjoner i brødbrødlignende kutt ved hjelp av en skalpellkniv for å generere vevssegmentene for formalinfikseringsparafin som legger inn tidlig passasjekulturgenerering og flashfrysing for analytiske analyser. Beis en fem mikrometer tykk formalinfast, parafininnstøpt vevsseksjon med hematoksylin og eosin. Når en patolog bekrefter svulsten, utfør den immunhistokjemiske fargingen for å bekrefte tumordiagnosen.Plasser det nyoppsamlede ondartede perifere nerveskjedetumorvevet i 10 milliliter iskald steril PBS på is, og overfør det deretter til et sterilt arbeidsområde for å etablere tidlige passasjekulturer. Hakk svulstvevet i to til fire millimeter stykker og triturer åtte til 10 ganger i en 10-kvadrat centimeter behandlet vevskulturskål som inneholder 10 milliliter vekstmedium. Dyrk disse vevene i høyt glukose DMEM-10 vekstmedium supplert med 10 nanomolar neuregulin-1 beta og to mikromolar forskolin.Frø de tidlige passerte tumorcellene med en tetthet på 1,5 ganger 10 til de sjette cellene per en 10-kvadrat centimeter behandlet vevskulturskål som inneholder DMEM-10 vekstmedium. Etter 12 til 16 timer, vask de tilhørende kulturer med to til fire milliliter DPBS, og infiser cellene med adenovirus ved ca. 400 plakkdannende enheter per celle i 10 ml serumfri DMEM. Etter 48 timer med infeksjonen, sjekk kort cellene for EGFP-signal på et fluorescensmikroskop for å sikre effektiv infeksjon med omtrent 50 til 100% positive celler, og deretter sorterer FACS de EGFP-positive infiserte cellene.Etter FACS-sortering, la cellene komme seg i en vevskulturinkubator i minst 24 til 48 timer, og klargjør deretter cellene for in vitro cellebaserte analyser eller in vivo podning. Bekreft Erbb4-sletting ved å utføre PCR ved hjelp av genomisk DNA isolert fra en del av de sorterte EGFP-positive cellene. Utfør proliferasjonsanalysene i løpet av de neste syv dagene på sorterte tumorceller belagt i en 96-brønns plate ved hjelp av et bildebasert automatisert cytometer.Beis cellene med kroker og propidiumjodidfarger og ta bilder av cellene ved hjelp av en automatisert plateleser for å telle antall levende og døde celler i hver brønn. Isoler totalt RNA fra sorterte tumorceller ved hjelp av standard syre guanidiniumfenol og kloroformbasert metode. Åpne programvaren for å utføre RNA-sekvensjusteringen ved å følge de programspesifikke trinnene ved hjelp av standardinnstillingene.Velg analysemetoden, RNA-søk, og velg deretter musereferansegenomet. Last opp BED-filen hvis du får en av sekvenseringskjernen. Last opp FASTQ-sekvenseringsfilene og tilordne unike replikasjonsnavn til filene.Gruppe replikere FASTQ-filene, og angi filene til et replikasjonssett. For statistisk og normaliseringsanalyse for å identifisere de differensielle genuttrykkssignalene med robust statistisk kraft, åpne analyseprogramvaren og velg GFP FASTQ-filene som kontrolldatasett. Velg deretter DESeq2 som statistisk og normaliseringsmetode og start montering og analyse.Bruk genontologidatasettene integrert i open access funksjonelle berikelsesanalyseverktøy for å utføre funksjonell berikelsesanalyse på den identifiserte statistisk signifikante Erbb4-medierte DEG for å bestemme den biologiske og veibetydningen av Erbb4-gentap. Injiser tumorcellene inn i isjiasnerven til den bedøvede musen for å vurdere in vivo allotransplantatvekstpotensialet i postinfiserte celler. Når svulsten når den nødvendige størrelsen, dissekerer du svulsten fra en avlivet mus i to-tre seksjoner som vist tidligere.Fest en vevsseksjon i 4% Paraformaldehyd over natten, og legg deretter inn den faste delen i parafinen. Etter å ha laget fem mikrometer tykke seksjoner fra FFPE-vevet, monter seksjonen på lysbildene og bekreft tilstedeværelsen av tumorceller i det podede vevet ved hjelp av H &E og immunostaining som vist tidligere. For å bekrefte in vivo Erbb4-ekspresjonsforskjeller mellom de to eksperimentelle forholdene, flekker det formalinfaste, paraffin-innebygde vevet med Erbb4-spesifikke antistoffer.Transduksjonen av de ondartede perifere nerveskjede tumorvevscellene med adenovirus ble analysert. EGFP-ekspresscellene ble påvist ved fluorescensmikroskopi, og totalt antall celler ble bestemt ved hjelp av fasekontrastmikroskopi. Etter Cre-mediert genablasjon, avhengig av transfeksjonseffektiviteten, viste PCR-genotypingen en komplett gen knockout og en heterogen populasjon av induserte og uinducerte celler sammenlignet med kontrolltransduksjonen.Den karakteristiske histopatologien som finnes i ortotopiske allotransplantater av ondartet perifert nerveskjedetumorvev sammenlignet med svulstene avledet fra de opprinnelige genetisk utviklede dyremodellene, viste en forskjell i cellemorfologien. Erbb4-ablasjonen reduserte cellulær tetthet og cellulær proliferasjon i adeno5-CMV-Cre-ablated celler kontrollerer adeno5-CMV-GFP-transducerte celler. Ekspresjonen av Erbb4 i tumorcellene transducert med adeno5-CMV-Cre, eller EGFP-virus, ble redusert i resultatet i adeno5-CMV-Cre transinduserte allotransplantater sammenlignet med kontroll adeno5-CMV-EGFP-behandlede allografttumorer.Vaskulær tetthet ble vurdert via immunoreaktivitetsdeteksjon for CD31, og de representative resultatene viste markert redusert vaskulær tetthet i allotransplantater av adeno5-CMV-Cre-transducerte celler sammenlignet med kontroll adeno5-CMV-EGFP-transducerte celler. Etter genablasjon kan cellene brukes til mange forskjellige typer cellebaserte analyser som proliferasjon, migrasjon, 3D-vekst eller mikromiljøendringer, samt for in vivo ortotopiske injeksjoner.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Avbildning av bosatt CD8 T-lymfocytter i menneskelig lunge svulst skiver bruker AC Confocal mikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

I Vivo EPR vurdering av pH, pO2, Redox Status, og konsentrasjoner av fosfat og glutation i svulst Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

En i Vivo Murine Sciatic Nerve modell Perineural invasjon

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses for svulst målrettede Immunomodulation: Design og evaluering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Sanntid påvisning av i Vitro svulst celle apoptose indusert av CD8+ T celler å studere immun undertrykkende funksjoner av svulst-infiltrere myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenisitet Screening av tumor-avledede ekstracellulære vesicles av Flow Cytometry av splenic T-celler

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Eks Vivo Organoid modell av Adenovirus-Cre medierte genslettinger i mus urotelceller

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Kultur og avbildning av Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Skiver fra resected Human Tumor Specimens

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Genome-Scale Screening to Identify and Compare Therapeutic Targets in Tumors

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Finding New Therapeutic Targets for Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Through Genome-Scale shRNA Screens (Video) | JoVE

Genetisk profilering og genomskala frafallsscreening for å identifisere terapeutiske mål i musemodeller av ondartet perifer nerveskjede tumor

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...