Name: defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Instituto Nacional de Doenças Neurológicas e AVC (R01 NS048353, R01 NS109655), Instituto Nacional do Câncer (R01 CA122804), Departamento de Defesa (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 e W81XWH-15-1-0193) e The Children's Tumor Foundation (2014-04-001 e 2015-05-007).

Antes de realizar qualquer procedimento com camundongos, todos os procedimentos devem ser revistos e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais. O protocolo descrito neste manuscrito foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica da Carolina do Sul. Este protocolo foi realizado por pessoal devidamente treinado seguindo as diretrizes institucionais de cuidados com animais do MUSC.
1. Geração de camundongos que desenvolvem MPNST...

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	<li>Ricciuti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates+for+lung+cancer+in+the+era+of+personalized+oncology.">Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology.</a> Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).</li><li>Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+axis+in+glioblastoma+multiforme.">PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).</li><li>Roskoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+FDA-approved+small+molecule+protein+kinase+inhibitors.">Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors.</a> Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).</li><li>Heffner, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+conditional+mouse+mutagenesis+with+a+comprehensive+cre+characterization+resource.">Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource.</a> Nature Communications. 3, 1218 (2012).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB4+promotes+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis+via+Ras-independent+mechanisms.">ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms.</a> Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).</li><li>Kazmi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+overexpressing+neuregulin-1+model+neurofibroma-malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+progression+and+implicate+specific+chromosomal+copy+number+variations+in+tumorigenesis.">Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).</li><li>Brosius, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+overexpression+and+Trp53+haploinsufficiency+cooperatively+promote+de+novo+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis.">Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis.</a> Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).</li><li>Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.+A+clinicopathologic+study+of+120+cases.">Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases.</a> Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).</li><li>Gassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+neural+and+cardiac+development+in+mice+lacking+the+ErbB4+neuregulin+receptor.">Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor.</a> Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).</li><li>Tidcombe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+and+mammary+gland+defects+in+ErbB4+knockout+mice+genetically+rescued+from+embryonic+lethality.">Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality.</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).</li><li>Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+characteristics+of+a+nervous+system-specific+erbB4+knock-out+mouse.">Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse.</a> Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).</li><li>Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+neuropathies+and+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+in+transgenic+mice+overexpressing+glial+growth+factor+beta3+in+myelinating+Schwann+cells.">Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells.</a> Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).</li><li>Jackson-Fisher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Neu/ErbB2-induced+mammary+tumors+is+unaffected+by+loss+of+ErbB4.">Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4.</a> Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).</li><li>Byer, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen+inhibits+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+growth+in+an+estrogen+receptor-independent+manner.">Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner.</a> Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+utility+of+SOX10+to+distinguish+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+from+synovial+sarcoma,+including+intraneural+synovial+sarcoma.">Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma.</a> Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genomic+characterization+of+a+sporadic+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+line.">Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cstf2t+regulates+expression+of+histones+and+histone-like+proteins+in+male+germ+cells.">Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells.</a> Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).</li><li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63,+MHC+class+1,+and+CD47+identify+subsets+of+extracellular+vesicles+containing+distinct+populations+of+noncoding+RNAs.">CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+promote+regenerative+growth+in+sensory+neurons.">Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normalization+and+differential+expression+analyses+using+RNA-Seq+data+from+726+individual+Drosophila+melanogaster.">Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 17, 28 (2016).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Huang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DAVID+Gene+Functional+Classification+Tool:+a+novel+biological+module-centric+algorithm+to+functionally+analyze+large+gene+lists.">The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists.</a> Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+map:+a+network-based+method+for+gene-set+enrichment+visualization+and+interpretation.">Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation.</a> PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).</li><li>Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+gene-set+enrichment+analysis+of+RNA-Seq+data+with+small+replicates.">Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates.</a> PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).</li><li>Koch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+analysis+of+RNA+sequencing+data.">A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).</li><li>Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+xenografting+of+human+luciferase-tagged+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells+for+in+vivo+testing+of+candidate+therapeutic+agents.">Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).</li><li>Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G*Power+3:+a+flexible+statistical+power+analysis+program+for+the+social,+behavioral,+and+biomedical+sciences.">G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences.</a> Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+the+embryonic+nerve+roots+for+NF1-associated+plexiform+neurofibroma.">Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma.</a> Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).</li><li>Mo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+neurofibroma+model+from+induced+pluripotent+stem+cells+delineates+tumor+pathogenesis+and+developmental+origins.">Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).</li><li>Chau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+therapeutic+efficacy+of+a+novel+pharmacologic+inducer+of+apoptosis+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.">Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).</li><li>Dodd, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF1(+/-)+Hematopoietic+cells+accelerate+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+development+without+altering+chemotherapy+response.">NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response.</a> Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).</li><li>Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+beta+and+neuregulin-1+alpha+differentially+affect+the+migration+and+invasion+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells.">Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells.</a> Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).</li></ol>

Os métodos detalhados aqui apresentados foram desenvolvidos utilizando-se um modelo GEM de MPNSTs. No entanto, se o tecido tumoral de interesse pode ser dispersado em células individuais, essas metodologias são facilmente adaptáveis para vários tipos de tumores surgidos em GEMs. É importante garantir que o alelo floxed não resulte em i) diminuição da sobrevida que pode dificultar a obtenção de camundongos suficientes para a triagem de tumores, ou ii) aumento da latência tumoral que pode dificultar a obtençã...

Antes das últimas duas décadas, o tratamento dos cânceres humanos dependia fortemente de radioterapia e agentes quimioterápicos que visavam rapidamente proliferar populações celulares, danificando o DNA ou inibindo a síntese de DNA. Embora essas abordagens tenham inibido o crescimento de células cancerosas, elas também tiveram efeitos colaterais deletérios em tipos celulares normais que proliferam rapidamente, como células epiteliais intestinais e células folículos capilares. Mais recentemente, a terapia oncológica começou a utilizar agentes quimioterápicos que visam precisamente proteínas dentro de vias de sinalização que são criticamente importantes para o crescimento da neoplasia de um paciente individual. Essa abordagem, comumente referida como "Medicina de Precisão", levou ao desenvolvimento de um repertório cada vez maior de anticorpos monoclonais e pequenos inibidores moleculares. Esses agentes efetivamente inibem a proliferação e a sobrevivência das células tumorais, evitando os efeitos colaterais deletérios em tipos celulares normais vistos com agentes quimioterápicos convencionais e radioterapia. Anticorpos monoclonais usados para o tratamento de cânceres humanos mais comumente visam moléculas de superfície celular, como receptores de fator de crescimento1 (por exemplo, a grande família de quinases receptoras de membrana) e moduladores de resposta imune2 (por exemplo, proteína de morte celular programada 1, liga-morte programada 1). Pequenos inibidores moleculares podem inibir proteínas da superfície celular ou proteínas de sinalização que estão localizadas intracelularmente3. No entanto, para efetivamente empregar esses novos agentes terapêuticos, deve-se estabelecer que um determinado câncer depende da molécula que está sendo alvo de um agente terapêutico candidato.
Embora esses novos agentes terapêuticos tenham efeitos mais focalizadas, muitos deles ainda inibem a ação de mais de uma proteína. Além disso, vários agentes com eficácia e especificidade variadas estão frequentemente disponíveis para atingir uma proteína específica. Consequentemente, durante investigações pré-clínicas, é prudente usar abordagens adicionais, como a ablação genética para validar uma proteína candidata como alvo terapêutico. Uma abordagem especialmente útil para validar uma proteína como alvo terapêutico é ablate o gene codificando a proteína candidata em um modelo animal geneticamente modificado que desenvolve o tipo específico de câncer de interesse. Essa abordagem pode ser relativamente simples se ratos com uma mutação nula (ou uma mutação natural, uma mutação nula geneticamente modificada [um "nocaute"], ou uma mutação nula introduzida por uma armadilha genética) estiverem disponíveis, e os camundongos forem viáveis até a idade adulta. Infelizmente, camundongos com uma mutação nula que atendem a esses critérios muitas vezes não estão disponíveis, tipicamente porque a mutação nula resulta em morte embrionária ou nos primeiros dias de vida pós-natal. Nesta circunstância, camundongos propensos a desenvolver o tipo de interesse tumoral podem, em vez disso, ser cruzados para camundongos nos quais segmentos-chave do gene de interesse são flanqueados por locais loxP ("floxed"), o que permite que o gene seja ablado introduzindo um transgene expressando Cre recombinase nas células tumorais (um nocaute condicional). Essa abordagem oferece várias vantagens. Primeiro, se um driver Cre estiver disponível que seja expresso no tumor, mas não no tipo celular que levou à morte em nocautes convencionais, essa abordagem pode potencialmente validar o alvo terapêutico do candidato. Em segundo lugar, a ablação do gene que codifica a proteína candidata em células tumorais, mas não em outros elementos intratumorais, como fibroblastos ou células imunes associadas ao tumor, permite ao pesquisador distinguir entre efeitos célula-autônomos e não-células-autônomas do alvo terapêutico. Finalmente, um driver Cre indutível de tamoxifen (CreERT2) permite que o investigador exclua o gene de interesse em diferentes estágios no desenvolvimento do tumor e defina a janela em que o agente terapêutico candidato é mais provável que seja eficaz.
Infelizmente, há também questões técnicas que podem limitar o uso de nocautes condicionais em tumores surgidos em modelos GEM. Por exemplo, um driver Cre que é expresso em células tumorais e evita a exclusão genética em células normais essenciais para a vida pode não estar disponível. Outra questão, que pode ser subestimada, é que os drivers Cre e CreERT2 muitas vezes variavelmente ablatam alelos floxed em camundongos, resultando em mosaico para a mutação nula em um câncer GEM. Quando isso ocorrer, as células tumorais nas quais o gene alvo não foi ablado continuarão a proliferar rapidamente, superculcendo as células tumorais com alelos ablados. O mosaicismo nas linhas de driver cre pode ocorrer devido à expressão cre não onipresente na linhagem direcionada e pela recombinação fracassada em células individuais independentes da expressão Cre4. Este é um fenômeno conhecido dos drivers Cre que é dependente do tipo celular e deve ser considerado durante o desenho experimental e interpretação de dados. O mosaico pode mascarar o efeito do nocaute e levar um investigador a concluir erroneamente que o gene de interesse não é essencial para a proliferação e/ou sobrevivência das células tumorais e, portanto, não é um alvo terapêutico válido.
Vários desses problemas foram encontrados em um estudo anterior que tentou determinar se o receptor tyrosine quinase erbB4 era um alvo terapêutico potencial nas células MPNST5. Nesses estudos, foram utilizados camundongos que expressam um transgene codificando o fator de crescimento gliano isoforme-β3 (GGFβ3) sob o controle do promotor zero de proteína de mielina específico da célula Schwann (camundongos P 0-GGFβ3). Os camundongos P 0-GGFβ3 desenvolvem neurofibromas plexiformes múltiplos que avançam para se tornarem MPNSTs através de um processo que recapitula os processos de patogênese neurofibroma e progressão neurofibroma-MPNST plexiforme observada em pacientes com a síndrome de susceptibilidade do tumor autossômico dominante neurofibromatose tipo 1 (NF1)6. Quando atravessado para camundongos com uma mutação nula Trp53, o P 0-GGFβ3 resultante; Os camundongos Trp53+/- desenvolvem MPNSTs de novo como é visto no cis-Nf1+/-; Trp53+/- ratos.
Esses MPNSTs recapitulam a progressão das lesões grau II da Organização Mundial da Saúde (OMS) para a OMS, observadas em humanos7. Emcamundongos P 0-GGFβ3, os MPNSTs surgem dentro de neurofibromas plexiformes pré-existentes no nervo trigêmeo (58%) e raízes do nervo dorsal espinhal (68%)7; os MPNSTs surgidos em P 0-GGFβ3; Os ratos Trp53+/- têm uma distribuição altamente semelhante. Em humanos, os MPNSTs mais comumente surgem no nervo ciático seguido pelo plexo braquial, raízes nervosas espinhais, vagus, femoral, mediana, plexo sacral, obturador popliteal e nervos tibiais e ulnar posteriores8. Esta distribuição de tumores nesses modelos GEM é um pouco diferente do que é visto em humanos. No entanto, os MPNSTs que surgem em P 0-GGFβ3 e P0-GGFβ3; Os camundongos trp53+/- são histologicamente idênticos aos MPNSTs humanos, carregam muitas das mesmas mutações vistas nos MPNSTs humanos e recapitulam o processo de progressão neurofibroma-MPNST observado em pacientes NF1. A geração de P 0-GGFβ3 ou P0-GGFβ3; Trp53+/- camundongos que eram Erbb4-/- não eram viáveis, pois camundongos com dois alelos nulos Erbb4 morrem no útero no dia embrionário 10,5 secundários a defeitos cardíacos9. Porque resgatar a expressão Erbb4 no coração introduzindo um transgene Erbb4 específico para o coração (cadeia pesada de α-miosina (MHC)-Erbb4) resulta em erbb4-/- camundongos10 viáveis, a geração de ratos com um complicado P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- genótipo foi tentado.
No entanto, os acasalamentos não produziram camundongos nas razões mendelianas esperadas, indicando que o genótipo desejado era deletério. Portanto, a geração de P 0-GGFβ3; Trp53+/- ratos com alelos Erbb4 floxed11 e um driver CreERT2 foi tentado para permitir a exclusão de Erbb4 nos MPNSTs surgidos nestes ratos. Nesses animais, numerosas células tumorais com alelos Erbb4 intactos ainda estavam presentes (mosaico). O mosaico observado pode resultar da entrega ineficiente de tamoxifen, que resultou em diferenças na eficiência de recombinação dentro do tecido. A possibilidade de mecanismos compensatórios espontâneos poderia contribuir ainda mais para o mosaico na recombinação mediada pelo tamoxifen, ignorando a exigência de expressão de Erbb4. É viável que a perda de Trp53 torne as células tumorais suscetíveis a mutações espontâneas adicionais "permissivas" que possam confundir a interpretação dos dados. Como parecia provável que as células MPNST intactas Erbb4 mascarassem as consequências de ablar Erbb4 em outras células tumorais, essa abordagem foi abandonada.
Esses obstáculos levaram ao desenvolvimento de uma metodologia para ablação de células MPNST de passagem muito precoce usando um adenovírus expressando Cre recombinase e eGFP. Essas células podem ser separadas de células não infectadas usando FACS, o que reduz significativamente o mosaico para o gene Erbb4 ablado. Abaixo, são descritos os métodos utilizados para isso, juntamente com os métodos utilizados para avaliar os efeitos da ablação genética in vitro e in vivo. O protocolo a seguir é um exemplo de como produzir camundongos portadores de tumores que produzem tumores portadores de alelos floxados de genes letais embrionários de interesse para ex vivo excisão antes da avaliação de crescimento do tumor in vivo a allograft. Isso inclui uma descrição das abordagens usadas para analisar o efeito que a ablação de Erbb4 exerce sobre a proliferação de células tumorais, sobrevivência e expressão genética in vitro e proliferação, sobrevivência e angiogênese em alóxeris ortotópicos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad5CMV-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad5CMVCre-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-1174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alexa 568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>GaR A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>http://www.bioconductor.org</td>
			<td>alternative statistical analysis tool used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td>mixture of chelators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)</td>
			<td>DAVID</td>
			<td>https://david.ncifcrf.gov</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>EP0701 and K1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab35374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HFR1: 05-1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeSpace Tools and Data Sources</td>
			<td>GenomeSpace</td>
			<td>https://genomespace.org/support/tools/</td>
			<td>general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice</td>
			<td>Envigo (Previously Harlan Labs)</td>
			<td>69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Hi Seq 2500</td>
			<td>DNA sequencer used for step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis</td>
			<td>DNAStar LaserGene software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software statistical and normalization analysis used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor basement membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRG1-beta</td>
			<td>In house</td>
			<td>Generated by SLC, also commercially available from R &#38; D Systems(396-HB-050/CF).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain Hoeschst 33342</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panther Gene Ontology Classification System</td>
			<td>Panther</td>
			<td>http://pantherdb.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partek (BWA aligner and analyzer)</td>
			<td>Partek, Ver 7</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment and statistical/normalization used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1: 5&#8242;-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT 
			GTCTG- 3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2: 5&#8242;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC 
			AGAAGC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Primer 3: 5&#8242;-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA 
			ACCCAG-3&#8242;
			</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 3: 350&#8201;bp wild-type ErbB4 product.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>51-351-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ARY003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9712</td>
			<td>bioluminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ToppGene Suite</td>
			<td>ToppGene</td>
			<td>https://toppgene.cchmc.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide Signal Amplification Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL721001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells

O desenvolvimento de novas drogas que visam precisamente proteínas-chave em cânceres humanos está alterando fundamentalmente a terapêutica do câncer. No entanto, antes que essas drogas possam ser usadas, suas proteínas-alvo devem ser validadas como alvos terapêuticos em tipos específicos de câncer. Essa validação é frequentemente realizada derrubando o gene que codifica o alvo terapêutico candidato em um modelo de câncer de camundongo geneticamente modificado (GEM) e determinando que efeito isso tem no crescimento do tumor. Infelizmente, questões técnicas como a letalidade embrionária em nocautes convencionais e o mosaico em nocautes condicionalmente muitas vezes limitam essa abordagem. Para superar essas limitações, desenvolveu-se uma abordagem para ablação de um gene letal embrionário floxed de interesse em culturas de curto prazo de tumores malignos de bainha periférica (MPNSTs) gerados em um modelo GEM.
Este artigo descreve como estabelecer um modelo de camundongo com o genótipo apropriado, derivar culturas tumorais de curto prazo desses animais e, em seguida, ablate o gene letal embrionário floxed usando um vetor adenoviral que expressa Cre recombinase e proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP). Purificação de células transduzidas com adenovírus usando classificação celular ativada por fluorescência (FACS) e a quantificação dos efeitos que a ablação genética exerce sobre a proliferação celular, viabilidade, o crescimento de andoenxertos transcritos e ortotópicos é então detalhado. Essas metodologias fornecem uma abordagem eficaz e generalizável para identificar e validar alvos terapêuticos in vitro e in vivo. Essas abordagens também fornecem uma fonte renovável de células derivadas de tumores de baixa passagem com artefatos de crescimento in vitro reduzidos. Isso permite que o papel biológico do gene-alvo seja estudado em diversos processos biológicos, como migração, invasão, metástase e comunicação intercelular mediada pelo secretome.

A Figura 4 ilustra um resultado típico obtido ao transdutor P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Células MPNST erbb4fl/fl com o adenovírus Ad5CMV-eGFP ou adenovírus Ad5CMV-Cre/eGFP (Figura 4A). As culturas são vistas com microscopia de fluorescência para identificar células expressas pelo eGFP e por microscopia de contraste de fase para determinar o número total de células presentes no mesmo campo em 10x (superior) e ...

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Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Aqui, apresentamos um protocolo para a realização de nocautes genéticos que são embrionários letais in vivo em tumores derivados de camundongos geneticamente modificados e, em seguida, avaliando o efeito que o nocaute tem sobre o crescimento do tumor, proliferação, sobrevivência, migração, invasão e a transcrição in vitro e in vivo.

Definindo funções genéticas em Tumorigênese por Ex vivo Ablaation of Floxed Alleles in Maligna Periférico Nerve Hemato Tumor Cells

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Este protocolo fornece um método in vivo alternativo para estudar o papel de crescimento tumoral de um gene letal embrionário nocaute. A vantagem deste método é que os nocautes genéticos que normalmente são letais embrionários podem ser realizados em tumores derivados de um modelo de camundongo geneticamente modificado para estudar sua perda de efeitos de função in vivo. Essa técnica pode ser aplicada a doenças que requerem o estudo do papel in vivo de genes essenciais embrionários inatingíveis dos modelos tradicionais de camundongos genes knockout.A geração do modelo animal leva tempo e testes empíricos são necessários para determinar o MOI ideal para infecção adenoviral para garantir que a recombinação apropriada seja alcançada. Para começar, identifique o mouse com o genótipo desejado. Quando um rato portador de tumor atinge seu ponto final humano, eutanize o rato e use uma faca de bisturi estéril para remover o tumor.Disseque o tumor em três seções em cortes no estilo pão de pão usando uma faca de bisturi para gerar os segmentos de tecido para a parafina de fixação formalina incorporando a geração de cultura de passagem precoce e o congelamento de flash para análises analíticas. Colora uma seção de tecido com hematoxilina e eosina de cinco micímetros de espessura com hematoxilina e eosina. Uma vez que um patologista confirme o tumor, realize a coloração imunohistoquímica para confirmar o diagnóstico do tumor.Coloque o tecido tumoral de bainha de nervo periférico recém-coletado em 10 mililitros de PBS estéreis gelados no gelo, e depois transfira-o para uma área de trabalho estéril para estabelecer culturas de passagem precoce. Pique o tecido tumoral em pedaços de dois a quatro milímetros e triturar de oito a dez vezes em um prato de cultura de tecido tratado de 10 centímetros quadrados contendo 10 mililitros de meio de crescimento. Cultura esses tecidos em alta glicose DMEM-10 meio de crescimento complementado com 10 nanomolar neuregulin-1 beta e dois micromolar forskolin.Semear as células tumorais de passagem precoce a uma densidade de 1,5 vezes 10 para a sexta células por um prato de cultura tecidual tratado de 10 milímetros contendo meio de crescimento DMEM-10. Após 12 a 16 horas, lave as culturas aderentes com dois a quatro mililitros de DPBS, e infecte as células com adenovírus em aproximadamente 400 unidades formadoras de placas por célula em 10 mililitros de DMEM sem soro. Após 48 horas da infecção, verifique brevemente as células para sinal EGFP em um microscópio de fluorescência para garantir uma infecção eficiente com aproximadamente 50 a 100% de células positivas, e então FACS classificar as células infectadas EGFP positivos.Após a triagem facs, deixe as células se recuperarem em uma incubadora de cultura tecidual por pelo menos 24 a 48 horas, e depois preparar as células para análises in vitro baseadas em células ou enxerto in vivo. Confirme a exclusão de Erbb4 realizando PCR usando DNA genômico isolado de uma porção das células EGFP-positive classificadas. Realize os ensaios de proliferação ao longo dos próximos sete dias em células tumorais classificadas banhadas em uma placa de 96 poços usando um citômetro automatizado baseado em imagem.Colora as células com ganchos e corantes de iodeto de propídio e capture as imagens das células usando um leitor de placas automatizado para contar o número de células vivas e mortas em cada poço. Isole o RNA total das células tumorais classificadas usando o método padrão defenol de guanidinium ácido e clorofórmio. Abra o software para executar o alinhamento de sequência de RNA seguindo as etapas específicas do programa usando as configurações padrão.Selecione o método de análise, procure RNA e selecione o genoma de referência do mouse. Carregue o arquivo BED se fornecido um pelo núcleo de sequenciamento. Carregue os arquivos de sequenciamento FASTQ e atribua nomes de replicação exclusivos aos arquivos.Grupo replique os arquivos FASTQ e designe os arquivos para um conjunto de réplica. Para a análise estatística e normalização identificar os sinais diferenciais de expressão genética com poder estatístico robusto, abra o software de análise e selecione os arquivos GFP FASTQ como o conjunto de dados de controle. Em seguida, selecione o DESeq2 como o método estatístico e de normalização e inicie a montagem e análise.Use os conjuntos de dados de ontologia genética integrados às ferramentas de análise de enriquecimento funcional de acesso aberto para realizar a análise de enriquecimento funcional no DEG mediado estatisticamente significativo erbb4 para determinar o significado biológico e de caminho da perda genética de Erbb4. Injete as células tumorais no nervo ciático do camundongo anestesiado para avaliar o potencial de crescimento de aoenxerto in vivo em células pós-infectadas. Uma vez que o tumor atinja o tamanho necessário, disseca o tumor de um rato eutanizado em duas ou três seções, como demonstrado anteriormente.Fixar uma seção de tecido em 4% Paraformaldeído durante a noite, e, em seguida, incorporar a seção fixa na parafina. Depois de fazer seções de cinco micrômetros de espessura do tecido FFPE, monte a seção sobre as lâminas e confirme a presença de células tumorais no tecido enxertado usando H&E e imunostaining como demonstrado anteriormente. Para confirmar in vivo Erbb4 diferenças de expressão entre as duas condições experimentais, colorique o tecido fixo de formalina, embutido em parafina com anticorpos específicos de Erbb4.Foi analisada a transdução das células do tecido tumoral periférico maligno com adenovírus. As células expressas do EGFP foram detectadas por meio de microscopia de fluorescência, e o número total de células foi determinado por meio de microscopia de contraste de fase. Após a ablação genética mediada por Cre, dependendo da eficiência da transfecção, a genotipagem pcr mostrou um nocaute genético completo e uma população heterogênea de células induzidas e não induzidas em comparação com a transdução de controle.A histopatologia característica encontrada nos aloenxertos ortotópicos de tecidos tumorais malignos da bainha do nervo periférico em comparação com os tumores derivados dos modelos animais geneticamente modificados originais demonstrou uma diferença na morfologia celular. A ablação de Erbb4 diminuiu a densidade celular e a proliferação celular em células adeno5-CMV-Cre-ablated controlam células transduzidas adeno5-CMV-GFP. A expressão de Erbb4 nas células tumorais transduzidas com o vírus adeno5-CMV-Cre, ou vírus EGFP, foi diminuída no resultado em adeno5-CMV-Cre transduziram aloenxertos em comparação com os tumores adeno5-CMV-EGFP tratados alox.A densidade vascular foi avaliada por meio da detecção de imunoreatividade para CD31, e os resultados representativos mostraram uma densidade vascular significativamente reduzida em aloenxertos de células transduzidas adeno5-CMV-Cre em comparação com as células transduzidas adeno5-CMV-EGFP. Após a ablação genética, as células podem ser usadas para muitos tipos diferentes de ensaios baseados em células, como proliferação, migração, crescimento 3D ou alterações de microambiente, bem como para injeções ortotópicas in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Pesquisa do câncer

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Na Vivo Avaliação de EPR de pH, pO2, Status Redox e as concentrações de fosfato e glutationa no microambiente do Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

Um modelo murino de nervo ciático na Vivo de invasão Perineural

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses para imunomodulação Tumor-alvo: Design e avaliação Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Triagem de imunogenicidade de vesículas extracelulares derivadas do tumor por citometria de fluxo de células T esplênicas

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Modelo organoide de deleções genéticas mediadas por Adenovírus-Cre em células uroteliais de camundongos

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Cultura e Imagem de Cortes Extraviais de Tumor Organotípico de Pseudomixoma Peritonei Ex Vivo de Espécimes Tumorais Humanos Ressecados

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Genome-Scale Screening to Identify and Compare Therapeutic Targets in Tumors

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Finding New Therapeutic Targets for Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Through Genome-Scale shRNA Screens (Video) | JoVE

Perfil Genético e Triagem de Abandono em Escala Genômica para Identificar Alvos Terapêuticos em Modelos Murinos de Tumor Maligno de Bainha de Nervo Periférico

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...