Name: defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Национального института неврологических заболеваний и инсульта (R01 NS048353, R01 NS109655), Национального института рака (R01 CA122804), Министерства обороны (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 и W81XWH-15-1-0193) и Фонда детских опухолей (2014-04-001 и 2015-05-007).

Прежде чем выполнять какие-либо процедуры с мышами, все процедуры должны быть рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию. Протокол, описанный в этой рукописи, был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использов?...

<ol>
	<li>Ricciuti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates+for+lung+cancer+in+the+era+of+personalized+oncology.">Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology.</a> Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).</li><li>Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+axis+in+glioblastoma+multiforme.">PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).</li><li>Roskoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+FDA-approved+small+molecule+protein+kinase+inhibitors.">Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors.</a> Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).</li><li>Heffner, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+conditional+mouse+mutagenesis+with+a+comprehensive+cre+characterization+resource.">Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource.</a> Nature Communications. 3, 1218 (2012).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB4+promotes+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis+via+Ras-independent+mechanisms.">ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms.</a> Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).</li><li>Kazmi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+overexpressing+neuregulin-1+model+neurofibroma-malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+progression+and+implicate+specific+chromosomal+copy+number+variations+in+tumorigenesis.">Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).</li><li>Brosius, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+overexpression+and+Trp53+haploinsufficiency+cooperatively+promote+de+novo+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis.">Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis.</a> Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).</li><li>Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.+A+clinicopathologic+study+of+120+cases.">Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases.</a> Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).</li><li>Gassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+neural+and+cardiac+development+in+mice+lacking+the+ErbB4+neuregulin+receptor.">Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor.</a> Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).</li><li>Tidcombe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+and+mammary+gland+defects+in+ErbB4+knockout+mice+genetically+rescued+from+embryonic+lethality.">Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality.</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).</li><li>Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+characteristics+of+a+nervous+system-specific+erbB4+knock-out+mouse.">Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse.</a> Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).</li><li>Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+neuropathies+and+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+in+transgenic+mice+overexpressing+glial+growth+factor+beta3+in+myelinating+Schwann+cells.">Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells.</a> Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).</li><li>Jackson-Fisher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Neu/ErbB2-induced+mammary+tumors+is+unaffected+by+loss+of+ErbB4.">Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4.</a> Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).</li><li>Byer, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen+inhibits+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+growth+in+an+estrogen+receptor-independent+manner.">Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner.</a> Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+utility+of+SOX10+to+distinguish+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+from+synovial+sarcoma,+including+intraneural+synovial+sarcoma.">Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma.</a> Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genomic+characterization+of+a+sporadic+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+line.">Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cstf2t+regulates+expression+of+histones+and+histone-like+proteins+in+male+germ+cells.">Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells.</a> Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).</li><li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63,+MHC+class+1,+and+CD47+identify+subsets+of+extracellular+vesicles+containing+distinct+populations+of+noncoding+RNAs.">CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+promote+regenerative+growth+in+sensory+neurons.">Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normalization+and+differential+expression+analyses+using+RNA-Seq+data+from+726+individual+Drosophila+melanogaster.">Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 17, 28 (2016).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Huang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DAVID+Gene+Functional+Classification+Tool:+a+novel+biological+module-centric+algorithm+to+functionally+analyze+large+gene+lists.">The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists.</a> Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+map:+a+network-based+method+for+gene-set+enrichment+visualization+and+interpretation.">Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation.</a> PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).</li><li>Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+gene-set+enrichment+analysis+of+RNA-Seq+data+with+small+replicates.">Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates.</a> PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).</li><li>Koch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+analysis+of+RNA+sequencing+data.">A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).</li><li>Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+xenografting+of+human+luciferase-tagged+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells+for+in+vivo+testing+of+candidate+therapeutic+agents.">Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).</li><li>Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G*Power+3:+a+flexible+statistical+power+analysis+program+for+the+social,+behavioral,+and+biomedical+sciences.">G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences.</a> Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+the+embryonic+nerve+roots+for+NF1-associated+plexiform+neurofibroma.">Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma.</a> Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).</li><li>Mo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+neurofibroma+model+from+induced+pluripotent+stem+cells+delineates+tumor+pathogenesis+and+developmental+origins.">Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).</li><li>Chau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+therapeutic+efficacy+of+a+novel+pharmacologic+inducer+of+apoptosis+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.">Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).</li><li>Dodd, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF1(+/-)+Hematopoietic+cells+accelerate+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+development+without+altering+chemotherapy+response.">NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response.</a> Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).</li><li>Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+beta+and+neuregulin-1+alpha+differentially+affect+the+migration+and+invasion+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells.">Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells.</a> Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).</li></ol>

Подробные методы, представленные здесь, были разработаны с использованием gem модели MPNST. Однако, если интересующая опухолевая ткань может быть рассеяна в отдельных клетках, эти методологии легко адаптируются для различных типов опухолей, возникающих в GEMs. Важно убедиться, что флокирова...

До последних двух десятилетий лечение рака человека в значительной степени зависело от лучевой терапии и химиотерапевтических агентов, которые широко нацеливались на быстро размножающиеся клеточные популяции, повреждая ДНК или ингибируя синтез ДНК. Хотя эти подходы ингибировали рост раковых клеток, они также имели вредные побочные эффекты на нормальные быстро размножающиеся типы клеток, такие как эпителиальные клетки кишечника и клетки волосяных фолликулов. Совсем недавно терапия рака начала использовать химиотерапевтические агенты, которые точно нацелены на белки в сигнальных путях, которые критически важны для роста новообразования отдельного пациента. Этот подход, обычно называемый «прецизионной медициной», привел к разработке постоянно расширяющегося репертуара моноклональных антител и малых молекулярных ингибиторов. Эти агенты эффективно ингибируют пролиферацию и выживание опухолевых клеток, избегая вредных побочных эффектов на нормальные типы клеток, наблюдаемых с помощью обычных химиотерапевтических агентов и лучевой терапии. Моноклональные антитела, используемые для лечения рака человека, чаще всего нацелены на молекулы клеточной поверхности, такие как рецепторы фактора роста1 (например, большое семейство тирозинкиназ мембранных рецепторов) и модуляторы иммунного ответа2 (например, запрограммированный белок гибели клеток 1, запрограммированный лиганд смерти 1). Малые молекулярные ингибиторы могут ингибировать либо белки клеточной поверхности, либо сигнальные белки, которые расположены внутриклеточнымобразом 3. Однако, чтобы эффективно использовать эти новые терапевтические агенты, необходимо установить, что конкретный рак зависит от молекулы, на которую нацелен кандидат терапевтический агент.
Хотя эти новые терапевтические агенты имеют более целенаправленные эффекты, многие из них по-прежнему ингибируют действие более чем одного белка. Кроме того, несколько агентов с различной эффективностью и специфичностью часто доступны для нацеливания на конкретный белок. Следовательно, во время доклинических исследований целесообразно использовать дополнительные подходы, такие как генетическая абляция, для проверки белка-кандидата в качестве терапевтической мишени. Одним из особенно полезных подходов к проверке белка в качестве терапевтической мишени является удаление гена, кодирующего белок-кандидат, в генетически модифицированной животной модели, которая развивает конкретный тип рака. Этот подход может быть относительно простым, если мыши с нулевой мутацией (либо естественная мутация, либо генетически модифицированная нулевая мутация [«нокаут»], либо нулевая мутация, введенная генной ловушкой), доступны, и мыши жизнеспособны во взрослой жизни. К сожалению, мыши с нулевой мутацией, которые соответствуют этим критериям, часто недоступны, как правило, потому, что нулевая мутация приводит к смерти эмбрионально или в первые дни постнатальной жизни. В этом случае мыши, склонные к развитию опухолевого типа интереса, могут быть вместо этого скрещены с мышами, у которых ключевые сегменты интересующего гена окружены участками loxP («floxed»), что позволяет удалять ген путем введения трансгена, экспрессирующего Cre recombinase в опухолевые клетки (условный нокаут). Такой подход дает ряд преимуществ. Во-первых, если доступен драйвер Cre, который экспрессируется в опухоли, но не в типе клеток, который привел к смерти в обычных нокаутах, этот подход может потенциально подтвердить потенциальную терапевтическую мишень. Во-вторых, удаление гена, кодирующего белок-кандидат в опухолевых клетках, но не в других внутриопухолевых элементах, таких как опухолеассоциированные фибробласты или иммунные клетки, позволяет исследователю различать клеточные автономные и неклеточные автономные эффекты терапевтической мишени. Наконец, индуцируемый тамоксифен драйвером Cre (CreERT2) позволяет исследователю удалить ген, представляющий интерес на разных стадиях развития опухоли, и определить окно, в котором потенциальный терапевтический агент, скорее всего, будет эффективным.
К сожалению, существуют и технические проблемы, которые могут ограничить использование условных нокаутов при опухолях, возникающих в моделях GEM. Например, драйвер Cre, который экспрессируется в опухолевых клетках и избегает делеции генов в нормальных клетках, необходимых для жизни, может быть недоступен. Другая проблема, которую можно недооценивать, заключается в том, что драйверы Cre и CreERT2 часто по-разному удаляют флоксированные аллели у мышей, что приводит к мозаицизму для нулевой мутации при раке GEM. Когда это происходит, опухолевые клетки, в которых ген-мишень не был абляционным, будут продолжать быстро размножаться, перерастая опухолевые клетки с помощью абляционных аллелей. Мозаицизм в линиях драйвера Cre может возникать из-за не вездесущей экспрессии Cre в целевой линии и неудачной рекомбинации в отдельных клетках, независимых от экспрессии Cre4. Это известное явление драйверов Cre, которое зависит от клеточного типа и должно быть рассмотрено при экспериментальном проектировании и интерпретации данных. Мозаицизм может замаскировать эффект нокаута и привести исследователя к ошибочному выводу, что ген, представляющий интерес, не является существенным для пролиферации опухолевых клеток и / или выживания и, следовательно, не является действительной терапевтической мишенью.
Некоторые из этих проблем были обнаружены в предыдущем исследовании, в котором пытались определить, является ли рецептор тирозинкиназы erbB4 потенциальной терапевтической мишенью в клетках MPNST5. В этих исследованиях использовались мыши, которые экспрессируют трансген, кодирующий изоформу глиального фактора роста неурегулина-1 (NRG1)-β3 (GGFβ3) под контролем нулевого промотора миелинового белка Шванна (мыши P 0-GGFβ3). У мышей P 0-GGFβ3 развиваются множественные плексиформные нейрофибромы, которые прогрессируют, чтобы стать MPNST посредством процесса, который повторяет процессы патогенеза нейрофибромы и прогрессирование плексиформной нейрофибромы-MPNST, наблюдаемое у пациентов с синдромом аутосомно-доминантной восприимчивости к опухоли нейрофиброматоза типа 1 (NF1)6. При скрещивании с мышами с нулевой мутацией Trp53 получается P 0-GGFβ3; Trp53+/- у мышей развиваются MPNST de novo, как это наблюдается у цис-Nf1+/-; Trp53+/- мыши.
Эти MPNST повторяют прогрессирование от II степени Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) к поражениям IV степени ВОЗ, наблюдаемым у людей7. У мышей P 0-GGFβ3 MPNST возникают в пределах ранее существовавших плексиформных нейрофибром в тройничном нерве (58%) и спинномозговых спинных нервных корешках (68%)7; MPNST, возникающие в P 0-GGFβ3; Trp53+/- мыши имеют очень похожее распределение. У людей MPNST чаще всего возникают в седалищном нерве, за которым следуют плечевое сплетение, спинномозговые нервные корешки, блуждающие, бедренные, срединные, крестцовые сплетения, подколенный обтуратор и задний большеберцовый и локтевой нервы8. Это распределение опухолей в этих моделях GEM несколько отличается от того, что наблюдается у людей. Однако MPNST, которые возникают в P 0-GGFβ3 и P0-GGFβ3; Trp53+/- мыши гистологически идентичны человеческим MPNST, несут многие из тех же мутаций, которые наблюдаются у людей MPNST, и повторяют процесс прогрессирования нейрофибромы-MPNST, наблюдаемый у пациентов с NF1. Генерация P 0-GGFβ3 или P0-GGFβ3; Trp53+/- мыши, которые были Erbb4-/- были невозможны, так как мыши с двумя нулевыми аллелями Erbb4 умирают в утробе матери на эмбриональном дне 10,5, вторичном по отношению к порокам сердца9. Поскольку спасение экспрессии Erbb4 в сердце путем введения кардиоспецифического трансгена Erbb4 (тяжелая цепь α-миозина (MHC)-Erbb4) приводит к жизнеспособным мышам Erbb4-/-mice10, генерации мышей со сложным P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Была предпринята попытка генотипа Erbb4-/-.
Тем не менее, спаривания не производили мышей в ожидаемых менделевских соотношениях, что указывает на то, что желаемый генотип был вредным. Поэтому генерация P 0-GGFβ3; Trp53+/- мыши с флокированными аллелями Erbb4 11 и драйвером CreERT2 были предприняты, чтобы разрешить удаление Erbb4 в MPNST, возникающих у этих мышей. У этих животных все еще присутствовали многочисленные опухолевые клетки с интактными аллелями Erbb4 (мозаицизм). Наблюдаемый мозаицизм может быть результатом неэффективной доставки тамоксифена, что привело к различиям в эффективности рекомбинации в ткани. Возможность спонтанных компенсаторных механизмов может еще больше способствовать мозаицизму в тамоксифен-опосредованной рекомбинации, минуя требование экспрессии Erbb4. Вполне возможно, что потеря Trp53 делает опухолевые клетки восприимчивыми к дополнительным спонтанным «разрешающим» мутациям, которые могут запутать интерпретацию данных. Поскольку казалось вероятным, что Erbb4-интактные MPNST-клетки будут маскировать последствия абляции Erbb4 в других опухолевых клетках, от этого подхода отказались.
Эти препятствия привели к разработке методологии абляции Erbb4 в очень раннем прохождении клеток MPNST с использованием аденовируса, экспрессирующего cre-рекомбиназу и eGFP. Эти клетки могут быть отделены от неинфицированных клеток с помощью FACS, что заметно снижает мозаицизм для абляционного гена Erbb4 . Ниже описаны методы, используемые для достижения этого, вместе с методами, используемыми для оценки эффектов абляции генов in vitro и in vivo. Следующий протокол является примером того, как производить опухоленосных мышей, которые дают опухоли, несущие флокированные аллели эмбриональных летальных генов, представляющих интерес для иссечения ex vivo до оценки роста опухоли аллотрансплантата in vivo . Это включает в себя описание подходов, используемых для анализа эффекта, который абляция Erbb4 оказывает на пролиферацию опухолевых клеток, выживаемость и экспрессию генов in vitro и пролиферацию, выживаемость и ангиогенез в ортотопических аллотрансплантатах.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad5CMV-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad5CMVCre-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-1174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alexa 568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>GaR A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>http://www.bioconductor.org</td>
			<td>alternative statistical analysis tool used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td>mixture of chelators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)</td>
			<td>DAVID</td>
			<td>https://david.ncifcrf.gov</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>EP0701 and K1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab35374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HFR1: 05-1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeSpace Tools and Data Sources</td>
			<td>GenomeSpace</td>
			<td>https://genomespace.org/support/tools/</td>
			<td>general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice</td>
			<td>Envigo (Previously Harlan Labs)</td>
			<td>69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Hi Seq 2500</td>
			<td>DNA sequencer used for step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis</td>
			<td>DNAStar LaserGene software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software statistical and normalization analysis used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor basement membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRG1-beta</td>
			<td>In house</td>
			<td>Generated by SLC, also commercially available from R &#38; D Systems(396-HB-050/CF).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain Hoeschst 33342</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panther Gene Ontology Classification System</td>
			<td>Panther</td>
			<td>http://pantherdb.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partek (BWA aligner and analyzer)</td>
			<td>Partek, Ver 7</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment and statistical/normalization used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1: 5&#8242;-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT 
			GTCTG- 3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2: 5&#8242;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC 
			AGAAGC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Primer 3: 5&#8242;-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA 
			ACCCAG-3&#8242;
			</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 3: 350&#8201;bp wild-type ErbB4 product.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>51-351-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ARY003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9712</td>
			<td>bioluminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ToppGene Suite</td>
			<td>ToppGene</td>
			<td>https://toppgene.cchmc.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide Signal Amplification Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL721001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells

Разработка новых лекарств, которые точно нацелены на ключевые белки при раке человека, коренным образом изменяет терапию рака. Однако, прежде чем эти препараты могут быть использованы, их целевые белки должны быть подтверждены в качестве терапевтических мишеней при конкретных типах рака. Эта проверка часто выполняется путем выбивания гена, кодирующего потенциальную терапевтическую мишень в генно-инженерной мышиной модели рака (GEM), и определения того, какое влияние это оказывает на рост опухоли. К сожалению, технические проблемы, такие как эмбриональная летальность в обычных нокаутах и мозаицизм в условных нокаутах, часто ограничивают этот подход. Чтобы преодолеть эти ограничения, был разработан подход к абляции флоксированного эмбрионального летального гена, представляющего интерес в краткосрочных культурах злокачественных опухолей оболочки периферических нервов (MPNST), генерируемых в модели GEM.
В этой статье описывается, как установить модель мыши с соответствующим генотипом, получить краткосрочные опухолевые культуры от этих животных, а затем аблактировать флокированный эмбриональный летальный ген с использованием аденовирусного вектора, который экспрессирует рекомбиназу Cre и усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP). Затем подробно описывается очистка клеток, трансдуцированных аденовирусом, с использованием флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) и количественная оценка эффектов, которые абляция генов оказывает на клеточную пролиферацию, жизнеспособность, транскриптом и рост ортотопического аллотрансплантата. Эти методологии обеспечивают эффективный и обобщающий подход к выявлению и подтверждению терапевтических мишеней in vitro и in vivo. Эти подходы также обеспечивают возобновляемый источник низкопроходимых опухолевых клеток с уменьшенными артефактами роста in vitro . Это позволяет изучать биологическую роль гена-мишени в различных биологических процессах, таких как миграция, инвазия, метастазирование и межклеточная связь, опосредованная секретомом.

Фиг.4 иллюстрирует типичный результат, полученный при преобразователе P 0-GGFβ3; Трп53-/+; Клетки Erbb4fl/fl MPNST с аденовирусом Ad5CMV-eGFP или аденовирусом Ad5CMV-Cre/eGFP (рисунок 4A). Культуры рассматриваются с помощью флуоресцентной микроскопии д?...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Здесь мы представляем протокол для выполнения нокаутов генов, которые являются эмбриональными летальными in vivo в генетически модифицированных опухолях, полученных из мышиной модели, а затем оцениваем влияние, которое нокаут оказывает на рост опухоли, пролиферацию, выживание, миграцию, инвазию и транскриптом in vitro и in vivo.

Определение функций генов в опухолевом генезе путем абляции Ex vivo флоксированных аллелей в злокачественных опухолевых клетках оболочки периферических нервов

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Этот протокол обеспечивает альтернативный метод in vivo для изучения роли роста опухоли эмбрионального смертельного нокаута гена. Преимущество этого метода заключается в том, что нокауты генов, которые обычно являются эмбриональными летальными, могут быть выполнены в опухолях, полученных из генетически модифицированной мышиной модели, для изучения их эффектов потери функции in vivo. Этот метод может быть применен к заболеваниям, которые требуют изучения in vivo роли эмбриональных основных генов, недостижимых из традиционных моделей мышиного нокаута генов.Создание модели на животных требует времени, и требуется эмпирическое тестирование для определения оптимального MOI для аденовирусной инфекции, чтобы обеспечить достижение соответствующей рекомбинации. Для начала определите мышь с нужным генотипом. Когда опухоленосная мышь достигнет своей гуманной конечной точки, усыпьте мышь и используйте стерильный нож скальпеля для удаления опухоли.Рассечение опухоли на три секции в разрезах в стиле хлебной буханки с помощью скальпельного ножа для генерации сегментов ткани для фиксации формалина парафином, встраивания раннего формирования культуры и мгновенного замораживания для аналитического анализа. Окрашивание пятимикрометрового формалин-фиксированного, парафинового внедренного участка ткани гематоксилином и эозином. Как только патологоанатом подтвердит опухоль, выполните иммуногистохимическое окрашивание для подтверждения диагноза опухоли.Поместите только что собранную злокачественную опухолевую ткань оболочки периферического нерва в 10 миллилитрах ледяного стерильного PBS на льду, а затем перенесите ее в стерильную рабочую зону для создания культур раннего прохождения. Измельчите опухолевую ткань на два-четыре миллиметровых кусочка и тритурируйте от восьми до 10 раз в обработанной 10 квадратных сантиметрах чашке для культивирования тканей, содержащей 10 миллилитров питательной среды. Культивируют эти ткани в высокоуглековую питательную среду DMEM-10, дополненную 10 наномолярными неурегулинами-1 бета и двумя микромолярными форсколином.Засейте ранопроходимые опухолевые клетки с плотностью от 1,5 раз 10 до шестой клетки на одну обработанную тканевую культуру размером 10 квадратных сантиметров чашку, содержащую питательную среду DMEM-10. Через 12-16 часов промыть адгезивные культуры двумя-четырьмя миллилитрами DPBS и заразить клетки аденовирусом примерно по 400 бляшек на клетку в 10 миллилитрах DMEM без сыворотки. После 48 часов инфекции кратко проверьте клетки на наличие сигнала EGFP на флуоресцентном микроскопе, чтобы обеспечить эффективное заражение примерно 50-100% положительными клетками, а затем FACS сортирует EGFP-положительные инфицированные клетки.После сортировки FACS дайте клеткам восстановиться в инкубаторе культуры тканей в течение не менее 24-48 часов, а затем подготовьте клетки к анализу на основе клеток in vitro или трансплантации in vivo. Подтвердите делецию Erbb4, выполнив ПЦР с использованием геномной ДНК, выделенной из части отсортированных EGFP-положительных клеток. Выполните анализы пролиферации в течение следующих семи дней на отсортированных опухолевых клетках, покрытых 96-луночной пластиной, используя автоматизированный цитометр на основе изображений.Окрашивайте клетки крючками и йодидными красителями пропидия и захватывайте изображения клеток с помощью автоматического считывателя пластин, чтобы подсчитать количество живых и мертвых клеток в каждой скважине. Выделяют общую РНК из отсортированных опухолевых клеток с использованием стандартного кислотного гуанидинийфенола и метода на основе хлороформа. Откройте программное обеспечение для выполнения выравнивания последовательности РНК в соответствии с программными шагами с использованием настроек по умолчанию.Выберите метод анализа, поиск РНК, а затем выберите эталонный геном мыши. Загрузите файл BED, если он предоставлен ядром виртуализации. Загрузите файлы виртуализации FASTQ и присвойте им уникальные имена реплик.Группа реплицирует файлы FASTQ и назначает их набору репликаций. Для статистического и нормализующего анализа для идентификации дифференциальных сигналов экспрессии генов с надежной статистической мощностью откройте программное обеспечение для анализа и выберите файлы GFP FASTQ в качестве набора контрольных данных. Затем выберите DESeq2 в качестве статистического метода и метода нормализации и запустите сборку и анализ.Используйте наборы данных генной онтологии, интегрированные в инструменты анализа функционального обогащения открытого доступа, для выполнения анализа функционального обогащения на идентифицированном статистически значимом Erbb4-опосредованном ERBB4 DEG для определения биологической и pathway значимости потери гена Erbb4. Введите опухолевые клетки в седалищный нерв анестезированной мыши для оценки потенциала роста аллотрансплантата in vivo в постинфицированных клетках. Как только опухоль достигнет необходимого размера, рассекните опухоль от усыпленной мыши на два-три участка, как было продемонстрировано ранее.Зафиксируйте один участок ткани в 4% параформальдегида на ночь, а затем встройте неподвижный участок в парафин. После создания участков толщиной в пять микрометров из ткани FFPE установите участок на слайдах и подтвердите наличие опухолевых клеток в трансплантированной ткани с помощью H & E и иммуноокрашивания, как было продемонстрировано ранее. Чтобы подтвердить различия в экспрессии in vivo Erbb4 между двумя экспериментальными условиями, окрасьте закрепленную формалином парафиновую ткань специфическими антителами Erbb4.Проанализирована трансдукция злокачественных клеток опухолевой ткани оболочки периферического нерва аденовирусом. Клетки, экспрессирующие EGFP, были обнаружены с помощью флуоресцентной микроскопии, а общее количество клеток определяли с помощью фазово-контрастной микроскопии. После cre-опосредованной абляции гена, в зависимости от эффективности трансфекции, генотипирование ПЦР показало полный нокаут гена и гетерогенную популяцию индуцированных и неиндуцированных клеток по сравнению с контрольной трансдукцией.Характерная гистопатология, обнаруженная в ортотопических аллотрансплантатах злокачественных опухолевых тканей оболочки периферических нервов по сравнению с опухолями, полученными из оригинальных генетически модифицированных моделей животных, продемонстрировала разницу в морфологии клеток. Абляция Erbb4 уменьшала клеточную плотность и клеточную пролиферацию в адено5-ЦМВ-кре-абляционных клетках, контролирующих адено5-ЦМВ-GFP-трансдуцированные клетки. Экспрессия Erbb4 в опухолевых клетках, трансдуцированных adeno5-CMV-Cre, или вирусом EGFP, была снижена в результате адено5-CMV-Cre трансдуцированных аллотрансплантатов по сравнению с контрольными аденотрансплантатами, обработанными адено5-ЦМВ-ЭГФП.Плотность сосудов оценивали с помощью обнаружения иммунореактивности для CD31, и репрезентативные результаты показали заметное снижение плотности сосудов в аллотрансплантатах адено5-ЦМВ-Cre-трансдуцированных клеток по сравнению с контрольными адено5-ЦМВ-EGFP-трансдуцированными клетками. После абляции генов клетки могут быть использованы для многих различных типов клеточных анализов, таких как пролиферация, миграция, 3D-рост или изменения микроокружения, а также для ортотопических инъекций in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Имаджинальное Disc Опухоль Модель: Визуализация и Количественная экспрессии генов и опухолевой инвазии с использованием генетических Мозаики

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Визуализация-резидентов CD8 Т-лимфоцитов в опухоли легких человека кусочки с помощью конфокальной микроскопии

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

В естественных условиях ЭПР Оценка рН, pO2, окислительно-восстановительного состояния и концентрации фосфатов и глутатиона в микроокружения опухоли

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

В естественных условиях мышиных седалищного нерва модель рассасывании вторжения

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Парамиксовирусы для ориентированных на опухоль иммуномодуляция: дизайн и оценке Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Режиме реального времени обнаружения в апоптоз клеток in Vitro опухоли индуцированные CD8 клетки+ T для изучения подавляющей иммунные функции проникновения опухоли миелоидных клеток

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

В городе Виво Скрининг иммуногенности внеклеточных везикул опухолевого происхождения методом проточной цитометрии селезеночных Т-клеток

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Органоидная модель аденовирусно-cre опосредованных делеций генов в уротелиальных клетках мышей

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Культура и визуализация органотипических срезов опухоли псевдомиксомы брюшины ex vivo из резецированных образцов опухолей человека

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Genome-Scale Screening to Identify and Compare Therapeutic Targets in Tumors

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Finding New Therapeutic Targets for Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Through Genome-Scale shRNA Screens (Video) | JoVE

Генетическое профилирование и скрининг отсева на уровне генома для выявления терапевтических мишеней в мышиных моделях злокачественной опухоли оболочки периферических нервов

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...