Name: defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares (R01 NS048353, R01 NS109655), el Instituto Nacional del Cáncer (R01 CA122804), el Departamento de Defensa (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 y W81XWH-15-1-0193), y The Children's Tumor Foundation (2014-04-001 y 2015-05-007).

Antes de realizar cualquier procedimiento con ratones, todos los procedimientos deben ser revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. El protocolo descrito en este manuscrito fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur. Este protocolo fue realizado por personal debidamente capacitado siguiendo las pautas institucionales de cuidado de animales de MUSC.
1. Generación de ratones que desarr...

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Los métodos detallados presentados aquí se desarrollaron utilizando un modelo GEM de MPNST. Sin embargo, si el tejido tumoral de interés se puede dispersar en células individuales, estas metodologías son fácilmente adaptables para varios tipos de tumores que surgen en los GEM. Es importante asegurarse de que el alelo floxed no resulte en i) disminución de la supervivencia que puede dificultar la obtención de suficientes ratones para detectar tumores, o ii) aumento de la latencia tumoral que puede dificultar la ob...

Antes de las últimas dos décadas, el tratamiento de los cánceres humanos se basaba en gran medida en la radioterapia y los agentes quimioterapéuticos que se dirigían ampliamente a las poblaciones celulares que proliferaban rápidamente al dañar el ADN o inhibir la síntesis de ADN. Aunque estos enfoques inhibieron el crecimiento de células cancerosas, también tuvieron efectos secundarios perjudiciales en los tipos de células normales que proliferan rápidamente, como las células epiteliales intestinales y las células del folículo piloso. Más recientemente, la terapia contra el cáncer ha comenzado a utilizar agentes quimioterapéuticos que se dirigen con precisión a las proteínas dentro de las vías de señalización que son de importancia crítica para el crecimiento de la neoplasia de un paciente individual. Este enfoque, comúnmente conocido como "Medicina de Precisión", ha llevado al desarrollo de un repertorio cada vez mayor de anticuerpos monoclonales y pequeños inhibidores moleculares. Estos agentes inhiben eficazmente la proliferación y supervivencia de las células tumorales, al tiempo que evitan los efectos secundarios nocivos en los tipos de células normales observados con los agentes quimioterapéuticos convencionales y la radioterapia. Los anticuerpos monoclonales utilizados para el tratamiento de los cánceres humanos se dirigen con mayor frecuencia a las moléculas de la superficie celular, como los receptores del factor de crecimiento1 (por ejemplo, la gran familia de tirosina quinasas del receptor que abarca la membrana) y los moduladores de la respuesta inmune2 (por ejemplo, proteína de muerte celular programada 1, ligando de muerte programada 1). Los inhibidores moleculares pequeños pueden inhibir las proteínas de la superficie celular o las proteínas de señalización que se encuentran intracelularmente3. Sin embargo, para emplear eficazmente estos nuevos agentes terapéuticos, se debe establecer que un cáncer en particular depende de la molécula a la que se dirige un agente terapéutico candidato.
Aunque estos nuevos agentes terapéuticos tienen efectos más focalizados, muchos de ellos aún inhiben la acción de más de una proteína. Además, a menudo se dispone de múltiples agentes con eficacia y especificidad variables para atacar una proteína específica. En consecuencia, durante las investigaciones preclínicas, es aconsejable utilizar enfoques adicionales como la ablación genética para validar una proteína candidata como diana terapéutica. Un enfoque especialmente útil para validar una proteína como objetivo terapéutico es extirpar el gen que codifica la proteína candidata en un modelo animal genéticamente modificado que desarrolla el tipo específico de cáncer de interés. Este enfoque puede ser relativamente sencillo si los ratones con una mutación nula (ya sea una mutación natural, una mutación nula genéticamente modificada [un "knockout"] o una mutación nula introducida por una trampa genética) están disponibles, y los ratones son viables en la edad adulta. Desafortunadamente, los ratones con una mutación nula que cumplen con estos criterios a menudo no están disponibles, generalmente porque la mutación nula resulta en la muerte embrionariamente o en los primeros días de vida postnatal. En esta circunstancia, los ratones propensos a desarrollar el tipo de interés tumoral pueden cruzarse a ratones en los que los segmentos clave del gen de interés están flanqueados por sitios loxP ("floxed"), lo que permite que el gen se ablase mediante la introducción de un transgén que expresa Cre recombinasa en las células tumorales (un knockout condicional). Este enfoque proporciona varias ventajas. En primer lugar, si se dispone de un controlador de Cre que se expresa en el tumor pero no en el tipo de célula que condujo a la muerte en los knockouts convencionales, este enfoque puede validar potencialmente el objetivo terapéutico candidato. En segundo lugar, la ablación del gen que codifica la proteína candidata en las células tumorales, pero no en otros elementos intratumorales, como los fibroblastos asociados al tumor o las células inmunes, permite al investigador distinguir entre los efectos autónomos de las células y los efectos no autónomos de las células de la diana terapéutica. Finalmente, un controlador de Cre inducible por tamoxifeno (CreERT2) permite al investigador eliminar el gen de interés en diferentes etapas en el desarrollo del tumor y definir la ventana en la que el agente terapéutico candidato tiene más probabilidades de ser efectivo.
Desafortunadamente, también hay problemas técnicos que pueden limitar el uso de knockouts condicionales en tumores que surgen en modelos GEM. Por ejemplo, un controlador de Cre que se expresa en las células tumorales y evita la eliminación de genes en las células normales esenciales para la vida puede no estar disponible. Otro problema, que puede estar subestimado, es que los conductores cre y CreERT2 a menudo ablacionan de manera variable los alelos floxados en ratones, lo que resulta en mosaicismo para la mutación nula en un cáncer GEM. Cuando esto ocurre, las células tumorales en las que el gen objetivo no ha sido ablacionado continuarán proliferando rápidamente, sobrecreciendo las células tumorales con alelos ablacionados. El mosaicismo en las líneas conductoras de Cre puede ocurrir debido a la expresión no ubicua de Cre en el linaje objetivo y por recombinación fallida en células individuales independientes de la expresión de Cre4. Este es un fenómeno conocido de los controladores Cre que depende del tipo de célula y debe considerarse durante el diseño experimental y la interpretación de datos. El mosaicismo puede enmascarar el efecto del knockout y llevar a un investigador a concluir erróneamente que el gen de interés no es esencial para la proliferación y / o supervivencia de las células tumorales y, por lo tanto, no es un objetivo terapéutico válido.
Varios de estos problemas se encontraron en un estudio previo que intentó determinar si el receptor tirosina quinasa erbB4 era un objetivo terapéutico potencial en las células MPNST5. En estos estudios, se utilizaron ratones que expresan un transgén que codifica la isoforma neuregulina-1 (NRG1) factor de crecimiento glial-β3 (GGFβ3) bajo el control del promotor cero de la proteína mielina específica de la célula de Schwann (ratones P 0-GGFβ3). Los ratones P 0-GGFβ3 desarrollan múltiples neurofibromas plexiformes que progresan hasta convertirse en MPNST a través de un proceso que recapitula los procesos de patogénesis del neurofibroma y la progresión del neurofibroma-MPNST plexiforme observados en pacientes con el síndrome de susceptibilidad tumoral autosómica dominante neurofibromatosis tipo 1 (NF1)6. Cuando se cruza a ratones con una mutación nula Trp53, el resultado P 0-GGFβ3; Los ratones Trp53+/- desarrollan MPNST de novo como se ve en cis-Nf1+/-; Trp53+/- ratones.
Estos MPNST recapitulan la progresión de las lesiones de grado II de la Organización Mundial de la Salud (OMS) a las lesiones de grado IV de la OMS observadas en humanos7. En ratones P 0-GGFβ3, los MPNST surgen dentro de neurofibromas plexiformes preexistentes en el nervio trigémino (58%) y las raíces nerviosas dorsales espinales (68%)7; los MPNST que surgen en P 0-GGFβ3; Los ratones Trp53+/- tienen una distribución muy similar. En los seres humanos, los MPNST surgen con mayor frecuencia en el nervio ciático seguido por el plexo braquial, las raíces nerviosas espinales, el vago, el femoral, la mediana, el plexo sacro, el obturador poplíteo y los nervios tibial y cubital posterior8. Esta distribución tumoral en estos modelos GEM es algo diferente de lo que se ve en humanos. Sin embargo, los MPNST que surgen en P 0-GGFβ3 y P0-GGFβ3; Los ratones Trp53+/- son histológicamente idénticos a los MPNST humanos, portan muchas de las mismas mutaciones observadas en los MPNST humanos y recapitulan el proceso de progresión del neurofibroma-MPNST observado en pacientes con NF1. La generación de P 0-GGFβ3 o P0-GGFβ3; Los ratones Trp53+/- que eran Erbb4-/- no fueron factibles ya que los ratones con dos alelos nulos Erbb4 mueren en el útero en el día embrionario 10.5 secundario a defectos cardíacos9. Porque el rescate de la expresión de Erbb4 en el corazón mediante la introducción de un transgén Erbb4 específico del corazón (cadena pesada de α-miosina (MHC)-Erbb4) da como resultado ratones Erbb4-/- viables10, la generación de ratones con un complicado P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Se intentó el genotipo Erbb4-/-.
Sin embargo, los apareamientos no produjeron ratones en las proporciones mendelianas esperadas, lo que indica que el genotipo deseado era perjudicial. Por lo tanto, la generación de P 0-GGFβ3; Se intentaron ratones Trp53+/- con alelos 11 Erbb4 floxed y un controlador CreERT2 para permitir la eliminación de Erbb4 en los MPNST que surgen en estos ratones. En estos animales, numerosas células tumorales con alelos Erbb4 intactos todavía estaban presentes (mosaicismo). El mosaicismo observado podría ser el resultado de una administración ineficiente de tamoxifeno, lo que resultó en diferencias en la eficiencia de recombinación dentro del tejido. La posibilidad de mecanismos compensatorios espontáneos podría contribuir aún más al mosaicismo en la recombinación mediada por tamoxifeno al eludir el requisito de expresión de Erbb4. Es factible que la pérdida de Trp53 haga que las células tumorales sean susceptibles a mutaciones "permisivas" espontáneas adicionales que podrían confundir la interpretación de los datos. Como parecía probable que las células MPNST intactas de Erbb4 enmascararan las consecuencias de la ablación de Erbb4 en otras células tumorales, este enfoque fue abandonado.
Estos obstáculos condujeron al desarrollo de una metodología para la ablación de Erbb4 en células MPNST de paso muy temprano utilizando un adenovirus que expresa Cre recombinasa y eGFP. Estas células se pueden separar de las células no infectadas utilizando FACS, lo que reduce notablemente el mosaicismo para el gen Erbb4 ablacionado. A continuación, se describen los métodos utilizados para lograrlo, junto con los métodos utilizados para evaluar los efectos de la ablación génica in vitro e in vivo. El siguiente protocolo es un ejemplo de cómo producir ratones portadores de tumores que producen tumores portadores de alelos floxados de genes letales embrionarios de interés para la escisión ex vivo antes de la evaluación del crecimiento tumoral de aloinjerto in vivo . Esto incluye una descripción de los enfoques utilizados para analizar el efecto que la ablación de Erbb4 ejerce sobre la proliferación de células tumorales, la supervivencia y la expresión génica in vitro y la proliferación, supervivencia y angiogénesis en aloinjertos ortotópicos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad5CMV-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad5CMVCre-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-1174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alexa 568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>GaR A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>http://www.bioconductor.org</td>
			<td>alternative statistical analysis tool used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td>mixture of chelators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)</td>
			<td>DAVID</td>
			<td>https://david.ncifcrf.gov</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>EP0701 and K1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab35374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HFR1: 05-1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeSpace Tools and Data Sources</td>
			<td>GenomeSpace</td>
			<td>https://genomespace.org/support/tools/</td>
			<td>general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice</td>
			<td>Envigo (Previously Harlan Labs)</td>
			<td>69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Hi Seq 2500</td>
			<td>DNA sequencer used for step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis</td>
			<td>DNAStar LaserGene software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software statistical and normalization analysis used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor basement membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRG1-beta</td>
			<td>In house</td>
			<td>Generated by SLC, also commercially available from R &#38; D Systems(396-HB-050/CF).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain Hoeschst 33342</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panther Gene Ontology Classification System</td>
			<td>Panther</td>
			<td>http://pantherdb.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partek (BWA aligner and analyzer)</td>
			<td>Partek, Ver 7</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment and statistical/normalization used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1: 5&#8242;-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT 
			GTCTG- 3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2: 5&#8242;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC 
			AGAAGC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Primer 3: 5&#8242;-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA 
			ACCCAG-3&#8242;
			</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 3: 350&#8201;bp wild-type ErbB4 product.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>51-351-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ARY003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9712</td>
			<td>bioluminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ToppGene Suite</td>
			<td>ToppGene</td>
			<td>https://toppgene.cchmc.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide Signal Amplification Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL721001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells

El desarrollo de nuevos fármacos que se dirigen con precisión a proteínas clave en los cánceres humanos está alterando fundamentalmente la terapéutica del cáncer. Sin embargo, antes de que estos medicamentos puedan ser utilizados, sus proteínas diana deben ser validadas como dianas terapéuticas en tipos específicos de cáncer. Esta validación a menudo se realiza eliminando el gen que codifica el objetivo terapéutico candidato en un modelo de cáncer de ratón genéticamente modificado (GEM) y determinando qué efecto tiene esto en el crecimiento del tumor. Desafortunadamente, los problemas técnicos como la letalidad embrionaria en los knockouts convencionales y el mosaicismo en los knockouts condicionales a menudo limitan este enfoque. Para superar estas limitaciones, se desarrolló un enfoque para ablacionar un gen letal embrionario floxed de interés en cultivos a corto plazo de tumores malignos de la vaina nerviosa periférica (MPNST) generados en un modelo GEM.
Este artículo describe cómo establecer un modelo de ratón con el genotipo apropiado, derivar cultivos tumorales a corto plazo de estos animales y luego extirpar el gen letal embrionario floxed utilizando un vector adenoviral que expresa Cre recombinasa y proteína fluorescente verde mejorada (eGFP). A continuación, se detalla la purificación de las células transducidas con adenovirus mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y la cuantificación de los efectos que la ablación génica ejerce sobre la proliferación celular, la viabilidad, el transcriptoma y el crecimiento del aloinjerto ortotópico. Estas metodologías proporcionan un enfoque eficaz y generalizable para identificar y validar dianas terapéuticas in vitro e in vivo. Estos enfoques también proporcionan una fuente renovable de células derivadas de tumores de bajo paso con artefactos de crecimiento in vitro reducidos. Esto permite estudiar el papel biológico del gen objetivo en diversos procesos biológicos como la migración, la invasión, la metástasis y la comunicación intercelular mediada por el secretoma.

La Figura 4 ilustra un resultado típico obtenido al transducir P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Células MPNST Erbb4fl/fl con el adenovirus Ad5CMV-eGFP o el adenovirus Ad5CMV-Cre/eGFP (Figura 4A). Los cultivos se observan con microscopía de fluorescencia para identificar células que expresan eGFP y mediante microscopía de contraste de fase para determinar el número total de células presentes en el mismo campo a 10x (...

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Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Aquí, presentamos un protocolo para realizar knockouts de genes que son embrionarios letales in vivo en tumores derivados de modelos de ratón genéticamente modificados y luego evaluamos el efecto que el knockout tiene sobre el crecimiento tumoral, la proliferación, la supervivencia, la migración, la invasión y el transcriptoma in vitro e in vivo.

Definición de las funciones genéticas en la tumorigénesis mediante la ablación ex vivo de alelos floxados en células tumorales malignas de la vaina del nervio periférico

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Este protocolo proporciona un método alternativo in vivo para estudiar el papel de crecimiento tumoral de un knockout de genes letal embrionario. La ventaja de este método es que los knockouts de genes que normalmente son letales embrionarios se pueden realizar en tumores derivados de un modelo de ratón genéticamente modificado para estudiar sus efectos de pérdida de función in vivo. Esta técnica se puede aplicar a enfermedades que requieren estudiar el papel in vivo de genes esenciales embrionarios inalcanzables de los modelos tradicionales de ratones knockout de genes.La generación del modelo animal lleva tiempo y se requieren pruebas empíricas para determinar el MOI óptimo para la infección adenoviral para garantizar que se logre la recombinación adecuada. Para empezar, identifique el ratón con el genotipo deseado. Cuando un ratón portador de tumor alcanza su punto final humanitario, eutanasia al ratón y use un cuchillo de bisturí estéril para extirpar el tumor.Diseccionar el tumor en tres secciones en cortes estilo pan de pan usando un cuchillo de bisturí para generar los segmentos de tejido para la fijación de formalina parafina incrustando la generación temprana de cultivos de paso y la congelación instantánea para análisis analíticos. Tinción de una sección de tejido fijada en parafina fija en formalina de cinco micrómetros de espesor con hematoxilina y eosina. Una vez que un patólogo confirma el tumor, realice la tinción inmunohistoquímica para confirmar el diagnóstico del tumor.Coloque el tejido tumoral maligno de la vaina nerviosa periférica recién recolectado en 10 mililitros de PBS estéril helado sobre hielo, y luego transfiéralo a un área de trabajo estéril para establecer cultivos de paso temprano. Picar el tejido tumoral en pedazos de dos a cuatro milímetros y triturar de ocho a 10 veces en una placa de cultivo de tejido tratada de 10 centímetros cuadrados que contenga 10 mililitros de medio de crecimiento. Cultive estos tejidos en medio de crecimiento DMEM-10 de alta glucosa suplementado con 10 nanomolares de neuregulina-1 beta y dos forskolina micromolar.Sembrar las células tumorales de paso temprano a una densidad de 1.5 veces 10 a las sextas células por un plato de cultivo de tejido tratado de 10 centímetros cuadrados que contenga medio de crecimiento DMEM-10. Después de 12 a 16 horas, lave los cultivos adherentes con dos a cuatro mililitros de DPBS e infecte las células con adenovirus a aproximadamente 400 unidades formadoras de placa por célula en 10 mililitros de DMEM sin suero. Después de 48 horas de la infección, verifique brevemente las células en busca de señal de EGFP en un microscopio de fluorescencia para garantizar una infección eficiente con aproximadamente 50 a 100% de células positivas, y luego FACS clasifica las células infectadas con EGFP positivo.Después de la clasificación facs, deje que las células se recuperen en una incubadora de cultivo de tejidos durante al menos 24 a 48 horas, y luego prepare las células para análisis in vitro basados en células o injertos in vivo. Confirme la eliminación de Erbb4 realizando PCR utilizando ADN genómico aislado de una parte de las células EGFP positivas clasificadas. Realice los ensayos de proliferación durante los próximos siete días en células tumorales clasificadas chapadas en una placa de 96 pocillos utilizando un citómetro automatizado basado en imágenes.Tiñe las células con ganchos y tintes de yoduro de propidio y capture las imágenes de las células utilizando un lector de placas automatizado para contar el número de células vivas y muertas en cada pozo. Aislar el ARN total de las células tumorales clasificadas utilizando el fenol ácido estándar y el método basado en cloroformo. Abra el software para realizar la alineación de la secuencia de ARN siguiendo los pasos específicos del programa utilizando la configuración predeterminada.Seleccione el método de análisis, la búsqueda de ARN y, a continuación, seleccione el genoma de referencia del ratón. Cargue el archivo BED si el núcleo de secuenciación le proporciona uno. Cargue los archivos de secuenciación FASTQ y asigne nombres de réplica únicos a los archivos.Agrupe los archivos FASTQ y designe los archivos en un conjunto de réplicas. Para el análisis estadístico y de normalización para identificar las señales diferenciales de expresión génica con potencia estadística robusta, abra el software de análisis y seleccione los archivos GFP FASTQ como el conjunto de datos de control. A continuación, seleccione DESeq2 como método estadístico y de normalización e inicie el ensamblaje y el análisis.Utilice los conjuntos de datos de ontología génica integrados en las herramientas de análisis de enriquecimiento funcional de acceso abierto para realizar el análisis de enriquecimiento funcional en el DEG mediado por Erbb4 estadísticamente significativo identificado para determinar la importancia biológica y de la vía de la pérdida del gen Erbb4. Inyecte las células tumorales en el nervio ciático del ratón anestesiado para evaluar el potencial de crecimiento del aloinjerto in vivo en las células post-infectadas. Una vez que el tumor alcanza el tamaño requerido, diseccionar el tumor de un ratón sacrificado en dos o tres secciones, como se demostró anteriormente.Fije una sección de tejido en 4% de paraformaldehído durante la noche y luego incruste la sección fija en la parafina. Después de hacer secciones de cinco micrómetros de grosor del tejido FFPE, monte la sección en los portaobjetos y confirme la presencia de células tumorales en el tejido injertado utilizando H & E e inmunotinción como se demostró anteriormente. Para confirmar las diferencias de expresión de Erbb4 in vivo entre las dos condiciones experimentales, tiñe el tejido fijado en formalina e incrustado en parafina con anticuerpos específicos de Erbb4.Se analizó la transducción de las células tumorales malignas de la vaina del nervio periférico con adenovirus. Las células que expresan EGFP se detectaron mediante microscopía de fluorescencia, y el número total de células se determinó mediante microscopía de contraste de fase. Después de la ablación del gen mediado por Cre, dependiendo de la eficiencia de la transfección, el genotipado por PCR mostró un knockout genético completo y una población heterogénea de células inducidas y no inducidas en comparación con la transducción de control.La histopatología característica encontrada en los aloinjertos ortotópicos de los tejidos tumorales malignos de la vaina del nervio periférico en comparación con los tumores derivados de los modelos animales originales genéticamente modificados demostró una diferencia en la morfología celular. La ablación de Erbb4 disminuyó la densidad celular y la proliferación celular en las células adeno5-CMV-Cre-ablated controlan las células transducidas adeno5-CMV-GFP. La expresión de Erbb4 en las células tumorales transducidas con adeno5-CMV-Cre, o virus EGFP, disminuyó en el resultado en los aloinjertos transducidos adeno5-CMV-Cre en comparación con los tumores de aloinjerto tratados con adeno5-CMV-EGFP de control.La densidad vascular se evaluó mediante la detección de inmunorreactividad para CD31, y los resultados representativos mostraron una densidad vascular marcadamente reducida en los aloinjertos de células transducidas por adeno5-CMV-Cre en comparación con las células transducidas por adeno5-CMV-EGFP de control. Después de la ablación de genes, las células se pueden utilizar para muchos tipos diferentes de ensayos basados en células, como proliferación, migración, crecimiento 3D o alteraciones del microambiente, así como para inyecciones ortotópicas in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

los<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Proyección de imagen de los linfocitos de T CD8 residente en Tumor de pulmón humano rebanadas utilizando Microscopía Confocal

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

En Vivo EPR evaluación de pH, pO2, estado Redox y concentraciones de fosfato y glutatión en el microambiente tumoral

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

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Un modelo de nervio ciático murinos In Vivo de invasión Perineural

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses para inmunomodulación Tumor objetivo: diseño y evaluación Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Tiempo real detección de Vitro Tumor de la célula apoptosis inducida por CD8+ T las células para el estudio de las funciones inmunológicas de supresores de Tumor infiltrante de células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Detección de inmunogenicidad de vesículas extracelulares derivadas de tumores mediante citometría de flujo de células T esplénicas

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Modelo organoide de deleciones genéticas mediadas por adenovirus-Cre en células uroteliales de ratón

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Cultivo e imágenes de cortes tumorales organotípicos ex vivo de pseudomixoma peritonei a partir de muestras tumorales humanas resecadas

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Genome-Scale Screening to Identify and Compare Therapeutic Targets in Tumors

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Finding New Therapeutic Targets for Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Through Genome-Scale shRNA Screens (Video) | JoVE

Perfiles genéticos y cribado de abandono a escala genómica para identificar dianas terapéuticas en modelos murinos de tumor maligno de la vaina de los nervios periféricos

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...