Name: defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353, R01 NS109655), National Cancer Institute (R01 CA122804), Försvarsdepartementet (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 och W81XWH-15-1-0193) och The Children's Tumor Foundation (2014-04-001 och 2015-05-007).

Innan du utför några procedurer med möss måste alla procedurer granskas och godkännas av institutional animal care and use committee. Protokollet som beskrivs i detta manuskript godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Medical University of South Carolina. Detta protokoll utfördes av korrekt utbildad personal enligt MUSC: s riktlinjer för institutionell djurvård.
1. Generation av möss som utvecklar MPNSTs homozygota för Erbb4 flox-alleler</e...

<ol>
	<li>Ricciuti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates+for+lung+cancer+in+the+era+of+personalized+oncology.">Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology.</a> Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).</li><li>Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+axis+in+glioblastoma+multiforme.">PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).</li><li>Roskoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+FDA-approved+small+molecule+protein+kinase+inhibitors.">Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors.</a> Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).</li><li>Heffner, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+conditional+mouse+mutagenesis+with+a+comprehensive+cre+characterization+resource.">Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource.</a> Nature Communications. 3, 1218 (2012).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB4+promotes+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis+via+Ras-independent+mechanisms.">ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms.</a> Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).</li><li>Kazmi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+overexpressing+neuregulin-1+model+neurofibroma-malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+progression+and+implicate+specific+chromosomal+copy+number+variations+in+tumorigenesis.">Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).</li><li>Brosius, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+overexpression+and+Trp53+haploinsufficiency+cooperatively+promote+de+novo+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis.">Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis.</a> Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).</li><li>Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.+A+clinicopathologic+study+of+120+cases.">Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases.</a> Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).</li><li>Gassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+neural+and+cardiac+development+in+mice+lacking+the+ErbB4+neuregulin+receptor.">Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor.</a> Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).</li><li>Tidcombe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+and+mammary+gland+defects+in+ErbB4+knockout+mice+genetically+rescued+from+embryonic+lethality.">Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality.</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).</li><li>Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+characteristics+of+a+nervous+system-specific+erbB4+knock-out+mouse.">Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse.</a> Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).</li><li>Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+neuropathies+and+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+in+transgenic+mice+overexpressing+glial+growth+factor+beta3+in+myelinating+Schwann+cells.">Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells.</a> Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).</li><li>Jackson-Fisher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Neu/ErbB2-induced+mammary+tumors+is+unaffected+by+loss+of+ErbB4.">Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4.</a> Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).</li><li>Byer, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen+inhibits+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+growth+in+an+estrogen+receptor-independent+manner.">Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner.</a> Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+utility+of+SOX10+to+distinguish+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+from+synovial+sarcoma,+including+intraneural+synovial+sarcoma.">Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma.</a> Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genomic+characterization+of+a+sporadic+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+line.">Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cstf2t+regulates+expression+of+histones+and+histone-like+proteins+in+male+germ+cells.">Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells.</a> Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).</li><li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63,+MHC+class+1,+and+CD47+identify+subsets+of+extracellular+vesicles+containing+distinct+populations+of+noncoding+RNAs.">CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+promote+regenerative+growth+in+sensory+neurons.">Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normalization+and+differential+expression+analyses+using+RNA-Seq+data+from+726+individual+Drosophila+melanogaster.">Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 17, 28 (2016).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Huang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DAVID+Gene+Functional+Classification+Tool:+a+novel+biological+module-centric+algorithm+to+functionally+analyze+large+gene+lists.">The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists.</a> Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+map:+a+network-based+method+for+gene-set+enrichment+visualization+and+interpretation.">Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation.</a> PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).</li><li>Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+gene-set+enrichment+analysis+of+RNA-Seq+data+with+small+replicates.">Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates.</a> PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).</li><li>Koch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+analysis+of+RNA+sequencing+data.">A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).</li><li>Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+xenografting+of+human+luciferase-tagged+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells+for+in+vivo+testing+of+candidate+therapeutic+agents.">Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).</li><li>Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G*Power+3:+a+flexible+statistical+power+analysis+program+for+the+social,+behavioral,+and+biomedical+sciences.">G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences.</a> Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+the+embryonic+nerve+roots+for+NF1-associated+plexiform+neurofibroma.">Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma.</a> Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).</li><li>Mo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+neurofibroma+model+from+induced+pluripotent+stem+cells+delineates+tumor+pathogenesis+and+developmental+origins.">Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).</li><li>Chau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+therapeutic+efficacy+of+a+novel+pharmacologic+inducer+of+apoptosis+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.">Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).</li><li>Dodd, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF1(+/-)+Hematopoietic+cells+accelerate+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+development+without+altering+chemotherapy+response.">NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response.</a> Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).</li><li>Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+beta+and+neuregulin-1+alpha+differentially+affect+the+migration+and+invasion+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells.">Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells.</a> Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).</li></ol>

De detaljerade metoderna som presenteras här utvecklades med hjälp av en GEM-modell av MPNST: er. Men om tumörvävnaden av intresse kan spridas i enskilda celler, är dessa metoder lätt anpassningsbara för olika tumörtyper som uppstår i GEM. Det är viktigt att säkerställa att den floxerade allelen inte resulterar i i) minskad överlevnad som kan göra det svårt att få tillräckligt med möss för att screena för tumörer, eller ii) ökad tumörlatens som kan göra det svårt att få tillräckligt med tumörb...

Före de senaste två decennierna förlitade sig behandlingen av mänskliga cancerformer starkt på strålbehandling och kemoterapeutiska medel som i stort sett riktade sig mot snabbt spridande cellulära populationer genom att skada DNA eller hämma DNA-syntesen. Även om dessa tillvägagångssätt hämmade cancercellstillväxt, hade de också skadliga biverkningar på normala snabbt spridande celltyper såsom tarmepitelceller och hårsäcksceller. På senare tid har cancerbehandling börjat använda kemoterapeutiska medel som exakt riktar sig mot proteiner inom signalvägar som är kritiskt viktiga för tillväxten av en enskild patients neoplasma. Detta tillvägagångssätt, vanligtvis kallat "Precision Medicine", har lett till utvecklingen av en ständigt växande repertoar av monoklonala antikroppar och små molekylära hämmare. Dessa medel hämmar effektivt tumörcellsproliferation och överlevnad samtidigt som de skadliga biverkningarna på normala celltyper som ses med konventionella kemoterapeutiska medel och strålbehandling undviks. Monoklonala antikroppar som används för behandling av humana cancerformer riktar sig oftast mot cellytemolekyler såsom tillväxtfaktorreceptorer1 (t.ex. den stora familjen av membranspännande receptortyrosinkinaser) och immunsvarsmodulatorer2 (t.ex. programmerat celldödsprotein 1, programmerad dödsligand 1). Småmolekylära hämmare kan hämma antingen cellyteproteiner eller signalproteiner som ligger intracellulärt3. För att effektivt kunna använda dessa nya terapeutiska medel måste det dock fastställas att en viss cancer är beroende av den molekyl som riktas mot ett terapeutiskt kandidatmedel.
Även om dessa nya terapeutiska medel har mer fokuserade effekter, hämmar många av dem fortfarande verkan av mer än ett protein. Dessutom är flera medel med varierande effektivitet och specificitet ofta tillgängliga för att rikta in sig på ett specifikt protein. Under prekliniska undersökningar är det därför klokt att använda ytterligare metoder såsom genetisk ablation för att validera ett kandidatprotein som ett terapeutiskt mål. Ett särskilt användbart tillvägagångssätt för att validera ett protein som ett terapeutiskt mål är att ablatera genen som kodar för kandidatproteinet i en genetiskt konstruerad djurmodell som utvecklar den specifika cancertypen av intresse. Detta tillvägagångssätt kan vara relativt enkelt om möss med en nollmutation (antingen en naturlig mutation, en genetiskt konstruerad nollmutation [en "knockout"] eller en nollmutation introducerad av en genfälla) är tillgängliga och mössen är livskraftiga i vuxen ålder. Tyvärr är möss med en nollmutation som uppfyller dessa kriterier ofta inte tillgängliga, vanligtvis eftersom nollmutationen resulterar i död embryonalt eller under de första dagarna av postnatalt liv. Under denna omständighet kan möss som är benägna att utveckla tumörtypen av intresse istället korsas till möss där viktiga segment av genen av intresse flankeras av loxP-platser ("floxed"), vilket gör att genen kan brännas genom att införa en transgen som uttrycker Cre-rekombinas i tumörcellerna (en villkorlig knockout). Detta tillvägagångssätt ger flera fördelar. För det första, om en Cre-drivrutin är tillgänglig som uttrycks i tumören men inte i celltypen som ledde till döden i konventionella knockouts, kan detta tillvägagångssätt potentiellt validera det terapeutiska målet för kandidaten. För det andra, ablating av genen som kodar för kandidatproteinet i tumörceller men inte i andra intratumorala element såsom tumörassocierade fibroblaster eller immunceller gör det möjligt för utredaren att skilja mellan cellautonoma och icke-cellautonoma effekter av det terapeutiska målet. Slutligen tillåter en tamoxifeninducerbar Cre-drivrutin (CreERT2) utredaren att radera genen av intresse i olika stadier i tumörutveckling och definiera det fönster där kandidaten terapeutiskt medel sannolikt kommer att vara effektivt.
Tyvärr finns det också tekniska problem som kan begränsa användningen av villkorliga knockouts i tumörer som uppstår i GEM-modeller. Till exempel kanske en Cre-drivrutin som uttrycks i tumörceller och undviker genradering i normala celler som är väsentliga för livet inte är tillgänglig. En annan fråga, som kan underskattas, är att Cre- och CreERT2-drivrutiner ofta varierar floxerade alleler hos möss, vilket resulterar i mosaik för nollmutationen i en GEM-cancer. När detta inträffar kommer tumörceller där den riktade genen inte har bränts att fortsätta att sprida sig snabbt och överväxa tumörcellerna med bräkta alleler. Mosaicism i Cre-drivlinjer kan uppstå på grund av icke-allestädes närvarande Cre-uttryck i den riktade härstamningen och genom misslyckad rekombination i enskilda celler oberoende av Cre-uttryck4. Detta är ett känt fenomen av Cre-drivrutiner som är beroende av celltyp och bör beaktas vid experimentell design och datatolkning. Mosaicism kan maskera effekten av knockouten och leda till att en utredare felaktigt drar slutsatsen att genen av intresse inte är nödvändig för tumörcellsproliferation och / eller överlevnad och därmed inte är ett giltigt terapeutiskt mål.
Flera av dessa problem uppstod i en tidigare studie som försökte avgöra om receptortyrosinkinasen erbB4 var ett potentiellt terapeutiskt mål i MPNST-celler5. I dessa studier användes möss som uttrycker en transgen som kodar för neuregulin-1 (NRG1) isoform glialtillväxtfaktor-β3 (GGFβ3) under kontroll av Schwann-cellspecifika myelinprotein nollpromotor (P 0-GGFβ3-möss). P 0-GGFβ3-möss utvecklar flera plexiforma neurofibrom som utvecklas till att bli MPNST via en process som rekapitulerar processerna för neurofibrompatogenes och plexiform neurofibrom-MPNST-progression som ses hos patienter med det autosomala dominerande tumörkänslighetssyndromet neurofibromatos typ 1 (NF1)6. När den korsas till möss med en Trp53-nollmutation, den resulterande P 0-GGFβ3; Trp53+/- möss utvecklar MPNST de novo som ses i cis-Nf1+/-; Trp53+/- möss.
Dessa MPNSTs rekapitulerar utvecklingen från Världshälsoorganisationens (WHO) grad II till WHO grad IV-lesioner som ses hos människor7. Hos P 0-GGFβ3-möss uppstår MPNST inom redan existerande plexiforma neurofibrom i trigeminusnerven (58%) och spinal dorsala nervrötter (68%)7; MPNST som uppstår i P 0-GGFβ3; Trp53+/- möss har en mycket liknande fördelning. Hos människor uppstår MPNSTs oftast i ischiasnerven följt av brachial plexus, spinal nervrötter, vagus, femoral, median, sakral plexus, popliteal obturator och bakre tibial- och ulnarnerver8. Denna tumörfördelning i dessa GEM-modeller skiljer sig något från vad som ses hos människor. Emellertid de MPNSTs som uppstår i P 0-GGFβ3 och P0-GGFβ3; Trp53 +/- möss är histologiskt identiska med humana MPNST, bär många av samma mutationer som ses hos humana MPNST och rekapitulerar processen för neurofibrom-MPNST-progression som ses hos NF1-patienter. Genereringen av P 0-GGFβ3 eller P0-GGFβ3; Trp53+/- möss som var Erbb4-/- var inte genomförbara eftersom möss med två Erbb4 null-alleler dör i livmodern vid embryonal dag 10,5 sekundärt till hjärtfel9. Eftersom att rädda Erbb4-uttryck i hjärtat genom att införa en hjärtspecifik Erbb4-transgen (α-myosin tung kedja (MHC) -Erbb4) resulterar i livskraftiga Erbb4-/- möss10, generationen möss med en komplicerad P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- genotyp försöktes.
Parningarna producerade emellertid inte möss i de förväntade mendeliska förhållandena, vilket indikerar att den önskade genotypen var skadlig. Därför genereringen av P 0-GGFβ3; Trp53+/- möss med floxerade Erbb4-alleler 11 och en CreERT2-drivrutin försökte tillåta radering av Erbb4 i MPNST:erna som uppstod hos dessa möss. Hos dessa djur var många tumörceller med intakta Erbb4-alleler fortfarande närvarande (mosaicism). Den observerade mosaiken kan bero på ineffektiv tamoxifenleverans, vilket resulterade i skillnader i rekombinationseffektivitet i vävnaden. Möjligheten till spontana kompensationsmekanismer kan ytterligare bidra till mosaicism vid tamoxifenmedierad rekombination genom att kringgå kravet på Erbb4-uttryck. Det är möjligt att förlusten av Trp53 gör tumörceller mottagliga för ytterligare spontana "tillåtna" mutationer som kan förvirra tolkningen av data. Eftersom det verkade troligt att De Erbb4-intakta MPNST-cellerna skulle maskera konsekvenserna av att bränna Erbb4 i andra tumörceller, övergavs detta tillvägagångssätt.
Dessa hinder ledde till utvecklingen av en metod för att bränna Erbb4 i mycket tidiga passage MPNST-celler med hjälp av ett adenovirus som uttrycker Cre-rekombinas och eGFP. Dessa celler kan separeras från icke-infekterade celler med hjälp av FACS, vilket markant minskar mosaicismen för den brända Erbb4-genen . Nedan beskrivs de metoder som används för att uppnå detta, tillsammans med de metoder som används för att bedöma effekterna av genablation in vitro och in vivo. Följande protokoll är ett exempel på hur man producerar tumörbärande möss som ger tumörer som bär floxerade alleler av embryonala dödliga gener av intresse för ex vivo excision före in vivo allograft tumörtillväxtbedömning. Detta inkluderar en beskrivning av de metoder som används för att analysera effekten som Erbb4-ablation utövar på tumörcellsproliferation, överlevnad och genuttryck in vitro och proliferation, överlevnad och angiogenes i ortotopiska allografter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad5CMV-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad5CMVCre-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-1174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alexa 568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>GaR A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>http://www.bioconductor.org</td>
			<td>alternative statistical analysis tool used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td>mixture of chelators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)</td>
			<td>DAVID</td>
			<td>https://david.ncifcrf.gov</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>EP0701 and K1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab35374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HFR1: 05-1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeSpace Tools and Data Sources</td>
			<td>GenomeSpace</td>
			<td>https://genomespace.org/support/tools/</td>
			<td>general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice</td>
			<td>Envigo (Previously Harlan Labs)</td>
			<td>69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Hi Seq 2500</td>
			<td>DNA sequencer used for step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis</td>
			<td>DNAStar LaserGene software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software statistical and normalization analysis used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor basement membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRG1-beta</td>
			<td>In house</td>
			<td>Generated by SLC, also commercially available from R &#38; D Systems(396-HB-050/CF).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain Hoeschst 33342</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panther Gene Ontology Classification System</td>
			<td>Panther</td>
			<td>http://pantherdb.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partek (BWA aligner and analyzer)</td>
			<td>Partek, Ver 7</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment and statistical/normalization used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1: 5&#8242;-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT 
			GTCTG- 3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2: 5&#8242;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC 
			AGAAGC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Primer 3: 5&#8242;-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA 
			ACCCAG-3&#8242;
			</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 3: 350&#8201;bp wild-type ErbB4 product.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>51-351-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ARY003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9712</td>
			<td>bioluminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ToppGene Suite</td>
			<td>ToppGene</td>
			<td>https://toppgene.cchmc.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide Signal Amplification Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL721001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells

Utvecklingen av nya läkemedel som exakt riktar sig mot nyckelproteiner i mänskliga cancerformer förändrar cancerbehandlingar i grunden. Men innan dessa läkemedel kan användas måste deras målproteiner valideras som terapeutiska mål i specifika cancertyper. Denna validering utförs ofta genom att slå ut genen som kodar för det terapeutiska målet i en genetiskt modifierad musmodell (GEM) av cancer och bestämma vilken effekt detta har på tumörtillväxt. Tyvärr begränsar tekniska problem som embryonal dödlighet i konventionella knockouts och mosaicism i villkorliga knockouts ofta detta tillvägagångssätt. För att övervinna dessa begränsningar utvecklades ett tillvägagångssätt för att bränna en floxerad embryonal dödlig gen av intresse för kortvariga kulturer av maligna perifera nervhöljestumörer (MPNST) som genereras i en GEM-modell.
Denna uppsats beskriver hur man etablerar en musmodell med lämplig genotyp, härleder kortvariga tumörkulturer från dessa djur och sedan ablaterar den floxerade embryonala dödliga genen med hjälp av en adenoviral vektor som uttrycker Cre-rekombinas och förbättrat grönt fluorescerande protein (eGFP). Rening av celler transducerade med adenovirus med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och kvantifieringen av de effekter som genablation utövar på cellulär proliferation, livskraft, transkriptom och ortotopisk allografttillväxt beskrivs sedan. Dessa metoder ger ett effektivt och generaliserbart tillvägagångssätt för att identifiera och validera terapeutiska mål in vitro och in vivo. Dessa tillvägagångssätt ger också en förnybar källa till tumörderiverade celler med låg passage med reducerade in vitro-tillväxtartefakter. Detta gör att den riktade genens biologiska roll kan studeras i olika biologiska processer såsom migration, invasion, metastasering och intercellulär kommunikation medierad av sekretomet.

Figur 4 illustrerar ett typiskt resultat som erhålls vid generering av P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl / fl MPNST-celler med antingen Ad5CMV-eGFP adenovirus eller Ad5CMV-Cre / eGFP adenovirus (Figur 4A). Kulturer ses med fluorescensmikroskopi för att identifiera eGFP-uttryckande celler och genom faskontrastmikroskopi för att bestämma det totala antalet celler som finns i samma fält vid 10x (överst) och 40x (...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Här presenterar vi ett protokoll för att utföra gen knockouts som är embryonala dödliga in vivo i genetiskt modifierade musmodell-härledda tumörer och sedan bedöma effekten som knockouten har på tumörtillväxt, proliferation, överlevnad, migration, invasion och transkriptomet in vitro och in vivo.

Definiera genfunktioner i tumorigenes genom ex vivo-ablation av floxerade alleler i maligna perifera nervhöljestumörceller

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Detta protokoll ger en alternativ in vivo-metod för att studera tumörtillväxtrollen hos en embryonal dödlig gen knockout. Fördelen med denna metod är att gen knockouts som normalt är embryonala dödliga kan utföras i tumörer härledda från en genetiskt konstruerad musmodell för att studera deras förlust av funktionseffekter in vivo. Denna teknik kan tillämpas på sjukdomar som kräver att man studerar in vivo-rollen hos embryonala essentiella gener som inte kan nås från traditionella gen knockout-musmodeller.Att generera djurmodellen tar tid och empirisk testning krävs för att bestämma den optimala MOI för adenoviral infektion för att säkerställa att lämplig rekombination uppnås. Till att börja med identifierar du musen med önskad genotyp. När en tumörbärande mus når sin humana slutpunkt, avliva musen och använd en steril skalpellkniv för att ta bort tumören.Dissekera tumören i tre sektioner i brödlimpa-stil med hjälp av en skalpellkniv för att generera vävnadssegmenten för formalinfixering paraffin som bäddar in tidig passagekulturgenerering och blixtfrysning för analytiska analyser. Färga en fem mikrometer tjock formalinfixerad, paraffininbäddad vävnadssektion med hematoxylin och eosin. När en patolog bekräftar tumören, utför den immunohistokemiska färgningen för att bekräfta tumördiagnosen.Placera den nyligen uppsamlade maligna tumörvävnaden i perifer nervhölje i 10 ml iskall steril PBS på is och överför den sedan till ett sterilt arbetsområde för att etablera tidiga passagekulturer. Hacka tumörvävnaden i två till fyra millimeter bitar och triturera åtta till 10 gånger i en 10 kvadratcentimeter behandlad vävnadsodlingsskål innehållande 10 ml tillväxtmedium. Odla dessa vävnader i hög glukos DMEM-10 tillväxtmedium kompletterat med 10 nanomolar neuregulin-1 beta och två mikromolar forskolin.Frö de tidigt passerade tumörcellerna med en densitet av 1,5 gånger 10 till de sjätte cellerna per en 10 kvadratcentimeter behandlad vävnadsodlingsskål innehållande DMEM-10 tillväxtmedium. Efter 12 till 16 timmar, tvätta de vidhäftande kulturerna med två till fyra milliliter DPBS och infektera cellerna med adenovirus vid cirka 400 plackbildande enheter per cell i 10 ml serumfri DMEM. Efter 48 timmar efter infektionen, kontrollera kort cellerna för EGFP-signal på ett fluorescensmikroskop för att säkerställa effektiv infektion med cirka 50 till 100% positiva celler, och sedan sorterar FACS de EGFP-positiva infekterade cellerna.Efter FACS-sortering, låt cellerna återhämta sig i en vävnadsodlingsinkubator i minst 24 till 48 timmar och förbered sedan cellerna för in vitro-cellbaserade analyser eller in vivo-ympning. Bekräfta Erbb4-radering genom att utföra PCR med hjälp av genomiskt DNA isolerat från en del av de sorterade EGFP-positiva cellerna. Utför spridningsanalyserna under de kommande sju dagarna på sorterade tumörceller pläterade i en 96-brunnsplatta med hjälp av en bildbaserad automatiserad cytometer.Färga cellerna med krokar och propidiumjodidfärger och fånga bilderna av cellerna med hjälp av en automatiserad plattläsare för att räkna antalet levande och döda celler i varje brunn. Isolera totalt RNA från sorterade tumörceller med hjälp av standardsyra guanidiniumfenol och kloroformbaserad metod. Öppna programvaran för att utföra RNA-sekvensjusteringen enligt de programspecifika stegen med standardinställningarna.Välj analysmetod, RNA-sökning och välj sedan musens referensgenom. Ladda upp BED-filen om den tillhandahålls av sekvenseringskärnan. Ladda upp FASTQ-sekvenseringsfilerna och tilldela unika repliknamn till filerna.Gruppera FASTQ-filerna och ange filerna till en replikuppsättning. För den statistiska analysen och normaliseringsanalysen för att identifiera de differentiella genuttryckssignalerna med robust statistisk kraft, öppna analysprogramvaran och välj GFP FASTQ-filerna som kontrolldatauppsättning. Välj sedan DESeq2 som statistik- och normaliseringsmetod och starta montering och analys.Använd genontologidatauppsättningarna integrerade i open access-analysverktygen för funktionell anrikning för att utföra funktionell anrikningsanalys på den identifierade statistiskt signifikanta Erbb4-medierade DEG för att bestämma den biologiska och vägbetydelsen av Erbb4-genförlust. Injicera tumörcellerna i ischiasnerven hos den sövda musen för att bedöma in vivo allografttillväxtpotentialen i postinfekterade celler. När tumören når önskad storlek, dissekera tumören från en avlivad mus i två-tre sektioner som visats tidigare.Fixa en vävnadssektion i 4% Paraformaldehyd över natten och bädda sedan in den fasta sektionen i paraffinet. Efter att ha gjort fem mikrometer tjocka sektioner från FFPE-vävnaden, montera sektionen på bilderna och bekräfta närvaron av tumörceller i den ympade vävnaden med användning av H&E och immunfärgning som visats tidigare. För att bekräfta in vivo Erbb4-uttrycksskillnader mellan de två experimentella förhållandena, färga den formalinfixerade, paraffininbäddade vävnaden med Erbb4-specifika antikroppar.Transduktionen av de maligna tumörvävnadscellerna i perifer nervhölje med adenovirus analyserades. EGFP-uttryckande celler detekterades med hjälp av fluorescensmikroskopi, och det totala antalet celler bestämdes med hjälp av faskontrastmikroskopi. Efter den Cre-medierade genablationen, beroende på transfektionseffektiviteten, visade PCR-genotypningen en fullständig gen knockout och en heterogen population av inducerade och oinducerade celler jämfört med kontrolltransduktionen.Den karakteristiska histopatologin som finns i de ortotopiska allografterna av maligna tumörvävnader i perifer nervhölje jämfört med tumörerna härledda från de ursprungliga genetiskt modifierade djurmodellerna visade en skillnad i cellmorfologin. Erbb4-ablationen minskade celltätheten och cellulär proliferation i adeno5-CMV-Cre-ablated-celler kontrollerar adeno5-CMV-GFP-transducerade celler. Uttrycket av Erbb4 i tumörcellerna transducerade med adeno5-CMV-Cre, eller EGFP-virus, minskade i resultatet i adeno5-CMV-Cre-transducerade allografter jämfört med kontroll adeno5-CMV-EGFP-behandlade allografttumörer.Kärltätheten bedömdes via immunoreaktivitetsdetektion för CD31, och de representativa resultaten visade markant minskad vaskulär densitet hos allografter av adeno5-CMV-Cre-transducerade celler jämfört med kontroll adeno5-CMV-EGFP-transducerade celler. Efter genablation kan cellerna användas för många olika typer av cellbaserade analyser såsom proliferation, migration, 3D-tillväxt eller mikromiljöförändringar, samt för ortotopiska injektioner in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal skiva Tumör Modell: Visualisering och kvantifiering av genuttryck och tumör invasiv använda genetiska mosaiker

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Avbildning av bosatta CD8 T-lymfocyter i Human Lung tumör skivor med konfokalmikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR bedömning av pH, pO2, Redox Status, och koncentrationer av fosfat och glutation i den tumör mikromiljö

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

En In Vivo murina ischiasnerven modell av Perineural Invasion

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirus för tumör-riktade immunmodulering: Design och utvärdering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid upptäcka i Vitro tumör Cell apoptos induceras av CD8+ T celler att studera suppressiv immunförsvaret av tumör-infiltrera myeloida celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicitet Screening av tumör-härledda extracellulära vesicles av flöde cytometri av splenic T-celler

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoidmodell av adenovirus-kreiterade genraderingar i musurotelceller

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Odling och avbildning av ex vivo organotypiska pseudomyxoma peritonei tumörskivor från resekterade humana tumörprover

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Genome-Scale Screening to Identify and Compare Therapeutic Targets in Tumors

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Finding New Therapeutic Targets for Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Through Genome-Scale shRNA Screens (Video) | JoVE

Genetisk profilering och screening av bortfall i genomskala för att identifiera terapeutiska mål i musmodeller av malign perifer nervskidetumör

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...