Name: defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü (R01 NS048353, R01 NS109655), Ulusal Kanser Enstitüsü (R01 CA122804), Savunma Bakanlığı (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 ve W81XWH-15-1-0193) ve Çocuk Tümörü Vakfı (2014-04-001 ve 2015-05-007) tarafından desteklenmiştir.

Farelerle herhangi bir prosedür gerçekleştirmeden önce, tüm prosedürler Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirilmeli ve onaylanmalıdır. Bu makalede açıklanan protokol, Güney Carolina Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu protokol, MUSC'nin kurumsal hayvan bakım yönergelerini izleyerek uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından gerçekleştirilmiştir.
1. Erbb4 f...

<ol>
	<li>Ricciuti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates+for+lung+cancer+in+the+era+of+personalized+oncology.">Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology.</a> Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).</li><li>Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+axis+in+glioblastoma+multiforme.">PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).</li><li>Roskoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+FDA-approved+small+molecule+protein+kinase+inhibitors.">Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors.</a> Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).</li><li>Heffner, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+conditional+mouse+mutagenesis+with+a+comprehensive+cre+characterization+resource.">Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource.</a> Nature Communications. 3, 1218 (2012).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB4+promotes+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis+via+Ras-independent+mechanisms.">ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms.</a> Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).</li><li>Kazmi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+overexpressing+neuregulin-1+model+neurofibroma-malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+progression+and+implicate+specific+chromosomal+copy+number+variations+in+tumorigenesis.">Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).</li><li>Brosius, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+overexpression+and+Trp53+haploinsufficiency+cooperatively+promote+de+novo+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis.">Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis.</a> Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).</li><li>Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.+A+clinicopathologic+study+of+120+cases.">Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases.</a> Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).</li><li>Gassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+neural+and+cardiac+development+in+mice+lacking+the+ErbB4+neuregulin+receptor.">Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor.</a> Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).</li><li>Tidcombe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+and+mammary+gland+defects+in+ErbB4+knockout+mice+genetically+rescued+from+embryonic+lethality.">Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality.</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).</li><li>Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+characteristics+of+a+nervous+system-specific+erbB4+knock-out+mouse.">Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse.</a> Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).</li><li>Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+neuropathies+and+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+in+transgenic+mice+overexpressing+glial+growth+factor+beta3+in+myelinating+Schwann+cells.">Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells.</a> Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).</li><li>Jackson-Fisher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Neu/ErbB2-induced+mammary+tumors+is+unaffected+by+loss+of+ErbB4.">Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4.</a> Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).</li><li>Byer, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen+inhibits+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+growth+in+an+estrogen+receptor-independent+manner.">Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner.</a> Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+utility+of+SOX10+to+distinguish+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+from+synovial+sarcoma,+including+intraneural+synovial+sarcoma.">Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma.</a> Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).</li><li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genomic+characterization+of+a+sporadic+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+line.">Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cstf2t+regulates+expression+of+histones+and+histone-like+proteins+in+male+germ+cells.">Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells.</a> Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).</li><li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63,+MHC+class+1,+and+CD47+identify+subsets+of+extracellular+vesicles+containing+distinct+populations+of+noncoding+RNAs.">CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+promote+regenerative+growth+in+sensory+neurons.">Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normalization+and+differential+expression+analyses+using+RNA-Seq+data+from+726+individual+Drosophila+melanogaster.">Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 17, 28 (2016).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Huang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DAVID+Gene+Functional+Classification+Tool:+a+novel+biological+module-centric+algorithm+to+functionally+analyze+large+gene+lists.">The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists.</a> Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+map:+a+network-based+method+for+gene-set+enrichment+visualization+and+interpretation.">Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation.</a> PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).</li><li>Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+gene-set+enrichment+analysis+of+RNA-Seq+data+with+small+replicates.">Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates.</a> PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).</li><li>Koch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+analysis+of+RNA+sequencing+data.">A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).</li><li>Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+xenografting+of+human+luciferase-tagged+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells+for+in+vivo+testing+of+candidate+therapeutic+agents.">Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).</li><li>Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G*Power+3:+a+flexible+statistical+power+analysis+program+for+the+social,+behavioral,+and+biomedical+sciences.">G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences.</a> Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+the+embryonic+nerve+roots+for+NF1-associated+plexiform+neurofibroma.">Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma.</a> Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).</li><li>Mo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+neurofibroma+model+from+induced+pluripotent+stem+cells+delineates+tumor+pathogenesis+and+developmental+origins.">Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).</li><li>Chau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+therapeutic+efficacy+of+a+novel+pharmacologic+inducer+of+apoptosis+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.">Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).</li><li>Dodd, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF1(+/-)+Hematopoietic+cells+accelerate+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+development+without+altering+chemotherapy+response.">NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response.</a> Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).</li><li>Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin-1+beta+and+neuregulin-1+alpha+differentially+affect+the+migration+and+invasion+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells.">Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells.</a> Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).</li></ol>

Burada sunulan ayrıntılı yöntemler, MPNST'lerin GEM modeli kullanılarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, ilgilenilen tümör dokusu bireysel hücrelere dağılabilirse, bu metodolojiler GEM'lerde ortaya çıkan çeşitli tümör tipleri için kolayca uyarlanabilir. Floksed alelin i) tümörleri taramak için yeterli fareler elde etmeyi zorlaştırabilecek sağkalımın azalmasına veya ii) yeterli tümör taşıyan farelerin elde edilmesini zorlaştırabilecek tümör gecikmesinin artmasına neden olmadığınd...

Son yirmi yıldan önce, insan kanserlerinin tedavisi, DNA'ya zarar vererek veya DNA sentezini inhibe ederek hızla çoğalan hücresel popülasyonları geniş ölçüde hedef alan radyoterapi ve kemoterapötik ajanlara dayanıyordu. Bu yaklaşımlar kanser hücresi büyümesini inhibe etmesine rağmen, bağırsak epitel hücreleri ve saç folikülü hücreleri gibi normal hızla çoğalan hücre tipleri üzerinde zararlı yan etkileri de vardı. Daha yakın zamanlarda, kanser tedavisi, bireysel bir hastanın neoplazmının büyümesi için kritik öneme sahip sinyal yolaklarındaki proteinleri tam olarak hedef alan kemoterapötik ajanları kullanmaya başlamıştır. Genellikle "Hassas Tıp" olarak adlandırılan bu yaklaşım, monoklonal antikorların ve küçük moleküler inhibitörlerin sürekli genişleyen bir repertuarının geliştirilmesine yol açmıştır. Bu ajanlar, tümör hücrelerinin proliferasyonunu ve sağkalımını etkili bir şekilde inhibe ederken, konvansiyonel kemoterapötik ajanlar ve radyoterapi ile görülen normal hücre tipleri üzerindeki zararlı yan etkilerden kaçınır. İnsan kanserlerinin tedavisinde kullanılan monoklonal antikorlar en yaygın olarak büyüme faktörü reseptörleri 1 (örneğin, membranı kapsayan reseptör tirozin kinazların geniş ailesi) ve immün yanıt modülatörleri2 (örneğin, programlanmış hücre ölüm proteini 1, programlanmış ölümligandı 1) gibi hücre yüzey moleküllerini hedef alır. Küçük moleküler inhibitörler, hücre yüzey proteinlerini veya hücre içinde bulunan sinyal proteinlerini inhibe edebilir3. Bununla birlikte, bu yeni terapötik ajanları etkili bir şekilde kullanmak için, belirli bir kanserin, aday bir terapötik ajan tarafından hedeflenen moleküle bağımlı olduğu tespit edilmelidir.
Bu yeni terapötik ajanların daha odaklanmış etkileri olmasına rağmen, birçoğu hala birden fazla proteinin etkisini inhibe etmektedir. Ek olarak, belirli bir proteini hedeflemek için değişen etkinlik ve özgüllüğe sahip çoklu ajanlar sıklıkla mevcuttur. Sonuç olarak, klinik öncesi araştırmalar sırasında, bir aday proteini terapötik bir hedef olarak doğrulamak için genetik ablasyon gibi ek yaklaşımlar kullanmak akıllıca olacaktır. Bir proteini terapötik bir hedef olarak doğrulamak için özellikle yararlı bir yaklaşım, aday proteini kodlayan geni, spesifik kanser türünü geliştiren genetiği değiştirilmiş bir hayvan modelinde ablatmaktır. Bu yaklaşım, boş mutasyona sahip fareler (doğal bir mutasyon, genetiği değiştirilmiş bir boş mutasyon [bir "nakavt"] veya bir gen tuzağı tarafından tanıtılan boş bir mutasyon) mevcutsa ve fareler yetişkinliğe kadar yaşayabilirse, nispeten basit olabilir. Ne yazık ki, bu kriterleri karşılayan null mutasyona sahip fareler genellikle mevcut değildir, çünkü tipik olarak null mutasyon embriyonik olarak veya doğum sonrası yaşamın ilk günlerinde ölümle sonuçlanır. Bu durumda, tümör tipini geliştirmeye eğilimli fareler, bunun yerine, ilgilenilen genin kilit segmentlerinin loxP bölgeleri ("floksed") tarafından kuşatıldığı farelere geçebilir; bu, genin tümör hücrelerine Cre rekombinazını ifade eden bir transgen (koşullu nakavt) sokularak ablatlanmasına izin verir. Bu yaklaşım çeşitli avantajlar sağlar. İlk olarak, tümörde eksprese edilen, ancak geleneksel nakavtlarda ölüme yol açan hücre tipinde ifade edilmeyen bir Cre sürücüsü mevcutsa, bu yaklaşım potansiyel olarak aday terapötik hedefi doğrulayabilir. İkincisi, aday proteini tümör hücrelerinde kodlayan geni ablukaya almak, ancak tümörle ilişkili fibroblastlar veya bağışıklık hücreleri gibi diğer tümör içi elementlerde değil, araştırmacının terapötik hedefin hücre özerk ve hücre dışı özerk etkilerini ayırt etmesini sağlar. Son olarak, tamoksifen ile indüklenebilen bir Cre sürücüsü (CreERT2), araştırmacının tümör gelişiminde farklı aşamalarda ilgilendiği geni silmesine ve aday terapötik ajanın etkili olma ihtimalinin en yüksek olduğu pencereyi tanımlamasına izin verir.
Ne yazık ki, GEM modellerinde ortaya çıkan tümörlerde koşullu nakavt kullanımını sınırlayabilecek teknik sorunlar da vardır. Örneğin, tümör hücrelerinde eksprese edilen ve yaşam için gerekli olan normal hücrelerde gen delesyonunu önleyen bir Cre sürücüsü mevcut olmayabilir. Küçümsenebilecek bir başka konu, Cre ve CreERT2 sürücülerinin farelerde flokslu alelleri sıklıkla değişken bir şekilde ablate etmesi ve GEM kanserindeki boş mutasyon için mozaikçiliğe neden olmasıdır. Bu meydana geldiğinde, hedeflenen genin ablatlanmadığı tümör hücreleri hızla çoğalmaya devam edecek ve tümör hücrelerini ablatlanmış alellerle aşırı büyütecektir. Cre sürücü hatlarındaki mozaiklik, hedeflenen soyda her yerde bulunmayan Cre ekspresyonu ve Cre ekspresyonu4'ten bağımsız bireysel hücrelerde başarısız rekombinasyon nedeniyle ortaya çıkabilir. Bu, hücre tipine bağımlı olan ve deneysel tasarım ve veri yorumlama sırasında göz önünde bulundurulması gereken Cre sürücülerinin bilinen bir olgusudur. Mozaisizm, nakavtın etkisini maskeleyebilir ve bir araştırmacının, ilgilenilen genin tümör hücresi proliferasyonu ve / veya hayatta kalması için gerekli olmadığı ve dolayısıyla geçerli bir terapötik hedef olmadığı sonucuna varmasına neden olabilir.
Bu sorunların birçoğu, reseptör tirozin kinaz erbB4'ün MPNST hücrelerinde potansiyel bir terapötik hedef olup olmadığını belirlemeye çalışan önceki bir çalışmada karşılaşılmıştır5. Bu çalışmalarda, Schwann hücresine özgü miyelin proteini sıfır promotörünün (P 0-GGFβ3 fareleri) kontrolü altında nötregülin-1 (NRG1) izoform glial büyüme faktörü-β3'ü (GGFβ3) kodlayan bir transgeni ifade eden fareler kullanılmıştır. P 0-GGFβ3 fareleri, otozomal dominant tümör duyarlılık sendromu nörofibromatozis tip 1 (NF1)6 olan hastalarda görülen nörofibrom patogenezi ve pleksiform nörofibrom-MPNST progresyonu süreçlerini özetleyen bir süreçle MPNST olmaya ilerleyen multipleksiform nörofibromlar geliştirir. Trp53 null mutasyonlu farelere geçildiğinde, ortaya çıkan P 0-GGFβ3; Trp53+/- fareler, cis-Nf1+/-'de görüldüğü gibi MPNST'ler de novo geliştirir; Trp53+/- fareler.
Bu MPNST'ler, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) derece II'den insanlarda görülen DSÖ derece IV lezyonlarına ilerlemeyi özetlemektedir7. P 0-GGFβ3 farelerde, MPNST'ler trigeminal sinirde (% 58) ve spinal dorsal sinir köklerinde (% 68) önceden var olan pleksiform nörofibromlarda ortaya çıkar7; P 0-GGFβ3'te ortaya çıkan MPNST'ler; Trp53+/- fareler oldukça benzer bir dağılıma sahiptir. İnsanlarda, MPNST'ler en sık siyatik sinirde ortaya çıkar, bunu brakiyal pleksus, spinal sinir kökleri, vagus, femoral, medyan, sakral pleksus, popliteal obturator ve posterior tibial ve ulnar sinirlerizler 8. Bu GEM modellerindeki bu tümör dağılımı, insanlarda görülenlerden biraz farklıdır. Bununla birlikte, P 0-GGFβ3 ve P0-GGFβ3'te ortaya çıkan MPNST'ler; Trp53+/- fareler histolojik olarak insan MPNST'leri ile aynıdır, insan MPNST'lerinde görülen aynı mutasyonların çoğunu taşır ve NF1 hastalarında görülen nörofibrom-MPNST progresyon sürecini özetler. P 0-GGFβ3 veya P0-GGFβ3 üretimi; Trp53+/- Erbb4-/- olan fareler, iki Erbb4 null aleli olan fareler, kardiyak defektlere sekonder 10.5 embriyonik günde uteroda öldüğü için mümkün değildi9. Çünkü kalp-spesifik bir Erbb4 transgeni (α-miyozin ağır zinciri (MHC)-Erbb4) ekleyerek kalpteki Erbb4 ekspresyonunu kurtarmak, uygulanabilir Erbb4-/- fareler 10, karmaşık bir P 0-GGFβ3 ile farelerin oluşumu ile sonuçlanır; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- genotipi denendi.
Bununla birlikte, çiftleşmeler beklenen Mendel oranlarında fare üretmedi, bu da istenen genotipin zararlı olduğunu gösterdi. Bu nedenle, P 0-GGFβ3 üretimi; Trp53+/- Flokslanmış Erbb4 alelleri11 ve CreERT2 sürücüsü olan fareler, bu farelerde ortaya çıkan MPNST'lerde Erbb4'ün silinmesine izin vermeye çalışıldı. Bu hayvanlarda, bozulmamış Erbb4 alellerine sahip çok sayıda tümör hücresi hala mevcuttu (mozaiklik). Gözlenen mozaisizm, verimsiz tamoksifen dağıtımından kaynaklanabilir ve bu da doku içinde rekombinasyon etkinliğinde farklılıklara neden olabilir. Spontan kompansatör mekanizmaların olasılığı, Erbb4 ekspresyonu gereksinimini atlayarak tamoksifen aracılı rekombinasyonda mozaisizme daha fazla katkıda bulunabilir. Trp53 kaybının, tümör hücrelerini, verilerin yorumlanmasını karıştırabilecek ek spontan "izin verilen" mutasyonlara duyarlı hale getirmesi mümkündür. Erbb4-bozulmamış MPNST hücrelerinin diğer tümör hücrelerinde Erbb4'ün ablatlanmasının sonuçlarını maskelemesi muhtemel göründüğü için, bu yaklaşım terk edildi.
Bu engeller, Cre rekombinaz ve eGFP'yi eksprese eden bir adenovirüs kullanarak çok erken geçiş MPNST hücrelerinde Erbb4'ü ablatlamak için bir metodolojinin geliştirilmesine yol açtı. Bu hücreler, ablatlanmış Erbb4 geni için mozaisizmi belirgin şekilde azaltan FACS kullanılarak enfekte olmayan hücrelerden ayrılabilir. Aşağıda, bunu başarmak için kullanılan yöntemler, gen ablasyonunun in vitro ve in vivo etkilerini değerlendirmek için kullanılan yöntemlerle birlikte açıklanmaktadır. Aşağıdaki protokol, in vivo allogreft tümör büyüme değerlendirmesinden önce ex vivo eksizyon için ilgi çekici embriyonik ölümcül genlerin floklu alellerini taşıyan tümörleri veren tümör taşıyan farelerin nasıl üretileceğine bir örnektir. Bu, Erbb4 ablasyonunun tümör hücresi proliferasyonu, sağkalım ve gen ekspresyonu in vitro ve ortotopik allogreftlerde proliferasyon, sağkalım ve anjiyogenez üzerindeki etkisini analiz etmek için kullanılan yaklaşımların bir tanımını içerir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad5CMV-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad5CMVCre-eGFP</td>
			<td>Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa</td>
			<td>VVC-U of Iowa-1174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alexa 568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>GaR A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics</td>
			<td>Bioconductor</td>
			<td>http://www.bioconductor.org</td>
			<td>alternative statistical analysis tool used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td>mixture of chelators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB staining kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)</td>
			<td>DAVID</td>
			<td>https://david.ncifcrf.gov</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)</td>
			<td>Thermo/Fisher</td>
			<td>EP0701 and K1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab35374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erbB4 antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HFR1: 05-1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeSpace Tools and Data Sources</td>
			<td>GenomeSpace</td>
			<td>https://genomespace.org/support/tools/</td>
			<td>general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice</td>
			<td>Envigo (Previously Harlan Labs)</td>
			<td>69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Hi Seq 2500</td>
			<td>DNA sequencer used for step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis</td>
			<td>DNAStar LaserGene software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software statistical and normalization analysis used for step 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor basement membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRG1-beta</td>
			<td>In house</td>
			<td>Generated by SLC, also commercially available from R &#38; D Systems(396-HB-050/CF).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain Hoeschst 33342</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panther Gene Ontology Classification System</td>
			<td>Panther</td>
			<td>http://pantherdb.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partek (BWA aligner and analyzer)</td>
			<td>Partek, Ver 7</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software alignment and statistical/normalization used for step 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1: 5&#8242;-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT 
			GTCTG- 3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2: 5&#8242;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC 
			AGAAGC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 2: 250&#8201;bp ErbB4 null product and a 350&#8201;bp Floxed ErbB4 product;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Primer 3: 5&#8242;-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA 
			ACCCAG-3&#8242;
			</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Primer 1 + 3: 350&#8201;bp wild-type ErbB4 product.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>51-351-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ARY003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9712</td>
			<td>bioluminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ToppGene Suite</td>
			<td>ToppGene</td>
			<td>https://toppgene.cchmc.org</td>
			<td>functional enrichment analysis software used for step 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide Signal Amplification Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL721001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells

İnsan kanserlerinde anahtar proteinleri tam olarak hedef alan yeni ilaçların geliştirilmesi, kanser terapötiklerini temelden değiştirmektedir. Bununla birlikte, bu ilaçların kullanılabilmesi için önce, hedef proteinlerinin spesifik kanser türlerinde terapötik hedefler olarak doğrulanması gerekir. Bu doğrulama genellikle, genetiği değiştirilmiş bir fare (GEM) kanser modelinde aday terapötik hedefi kodlayan geni nakavt ederek ve bunun tümör büyümesi üzerindeki etkisinin ne olduğunu belirleyerek gerçekleştirilir. Ne yazık ki, geleneksel nakavtlarda embriyonik öldürücülük ve koşullu nakavtlarda mozaiklik gibi teknik konular genellikle bu yaklaşımı sınırlar. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, bir GEM modelinde üretilen malign periferik sinir kılıfı tümörlerinin (MPNST'ler) kısa süreli kültürlerinde ilgi çekici bir floks embriyonik ölümcül genin ablatasyonuna yönelik bir yaklaşım geliştirilmiştir.
Bu yazıda, uygun genotipe sahip bir fare modelinin nasıl oluşturulacağı, bu hayvanlardan kısa süreli tümör kültürlerinin nasıl türetileceği ve daha sonra Cre rekombinaz ve gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) eksprese eden adenoviral bir vektör kullanarak floklu embriyonik ölümcül genin nasıl ablate edileceği açıklanmaktadır. Daha sonra floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanılarak adenovirüs ile dönüştürülen hücrelerin saflaştırılması ve gen ablasyonunun hücresel proliferasyon, canlılık, transkriptom ve ortotopik allogreft büyümesi üzerindeki etkilerinin ölçülmesi detaylandırılır. Bu metodolojiler, terapötik hedefleri in vitro ve in vivo olarak tanımlamak ve doğrulamak için etkili ve genellenebilir bir yaklaşım sağlar. Bu yaklaşımlar aynı zamanda in vitro büyüme artefaktları azalmış düşük pasajlı tümör türevi hücrelerin yenilenebilir bir kaynağını sağlar. Bu, hedeflenen genin biyolojik rolünün, sekretomun aracılık ettiği göç, istila, metastaz ve hücreler arası iletişim gibi çeşitli biyolojik süreçlerde incelenmesini sağlar.

Şekil 4, P 0-GGFβ3'ü dönüştürürken elde edilen tipik bir sonucu göstermektedir; Trp53-/+; Ad5CMV-eGFP adenovirüsü veya Ad5CMV-Cre/eGFP adenovirüsü ile Erbb4fl/fl MPNST hücreleri (Şekil 4A). Kültürler, eGFP eksprese eden hücreleri tanımlamak için floresan mikroskobu ile ve aynı alanda bulunan toplam hücre sayısını 10x (üstte) ve 40x'te (altta) belirlemek için faz-kontrast mikroskobu ile...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells at JoVE.com

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Burada, genetiği değiştirilmiş fare modeli kaynaklı tümörlerde in vivo embriyonik öldürücü olan gen nakavtlarını gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz ve daha sonra nakavtın tümör büyümesi, proliferasyon, sağkalım, göç, invazyon ve transkriptom in vitro ve in vivo üzerindeki etkisini değerlendiriyoruz.

Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümör Hücrelerinde Floks Alellerinin Ex vivo Ablasyonu ile Tümörigenezde Gen Fonksiyonlarının Tanımlanması

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Bu protokol, embriyonik ölümcül gen nakavtının tümör büyüme rolünü incelemek için alternatif bir in vivo yöntem sunar. Bu yöntemin avantajı, normalde embriyonik ölümcül olan gen nakavtlarının, in vivo fonksiyon kaybı etkilerini incelemek için genetiği değiştirilmiş bir fare modelinden türetilen tümörlerde gerçekleştirilebilmesidir. Bu teknik, geleneksel gen nakavt fare modellerinden elde edilemeyen embriyonik esansiyel genlerin in vivo rolünün incelenmesini gerektiren hastalıklara uygulanabilir.Hayvan modelinin oluşturulması zaman alır ve uygun rekombinasyonun sağlandığından emin olmak için adenoviral enfeksiyon için en uygun MOI'yi belirlemek için ampirik testler gereklidir. Başlangıç olarak, fareyi istenen genotiple tanımlayın. Tümör taşıyan bir fare insancıl son noktasına ulaştığında, fareyi ötenazi yapın ve tümörü çıkarmak için steril bir neşter bıçağı kullanın.Formalin fiksasyon parafinin erken pasaj kültürü üretimini gömmesi ve analitik analizler için flaş dondurma için doku segmentlerini oluşturmak üzere bir neşter bıçağı kullanarak ekmek somunu tarzı kesimlerde tümörü üç bölüme ayırın. Hematoksilin ve eozin ile beş mikrometre kalınlığında formalin sabit, parafin gömülü doku bölümünü sabitleyin. Bir patolog tümörü doğruladıktan sonra, tümör tanısını doğrulamak için immünohistokimyasal boyama işlemini gerçekleştirin.Yeni toplanan malign periferik sinir kılıfı tümör dokusunu buz üzerinde 10 mililitre buz gibi soğuk steril PBS'ye yerleştirin ve daha sonra erken geçiş kültürleri oluşturmak için steril bir çalışma alanına aktarın. Tümör dokusunu iki ila dört milimetrelik parçalara ayırın ve 10 mililitre büyüme ortamı içeren 10 santimetrekarelik işlenmiş bir doku kültürü kabında sekiz ila 10 kez tritüre edin. Bu dokuları yüksek glukozlu DMEM-10 büyüme ortamında 10 nanomolar neuregulin-1 beta ve iki mikromolar forskolin ile desteklenmiş olarak kültüre alın.DMEM-10 büyüme ortamı içeren 10 santimetrekarelik işlenmiş doku kültürü kabı başına 1.5 kat 10 ila 10 yoğunlukta erken paslanmış tümör hücrelerini altıncı hücrelere tohumlayın. 12 ila 16 saat sonra, yapışkan kültürleri iki ila dört mililitre DPBS ile yıkayın ve hücreleri 10 mililitre serumsuz DMEM'de hücre başına yaklaşık 400 plak oluşturan birimde adenovirüs ile enfekte edin. Enfeksiyondan 48 saat sonra, yaklaşık% 50 ila% 100 pozitif hücrelerle etkili enfeksiyon sağlamak için floresan mikroskobunda EGFP sinyali için hücreleri kısaca kontrol edin ve ardından FACS, EGFP pozitif enfekte olmuş hücreleri sıralar.FACS sıralamadan sonra, hücrelerin bir doku kültürü inkübatöründe en az 24 ila 48 saat iyileşmesine izin verin ve daha sonra hücreleri in vitro hücre bazlı analizler veya in vivo aşılama için hazırlayın. Sıralanmış EGFP-pozitif hücrelerin bir kısmından izole edilen genomik DNA kullanarak PCR gerçekleştirerek Erbb4 delesyonunu onaylayın. Proliferasyon testlerini, görüntü tabanlı otomatik bir sitometre kullanarak 96 kuyucuklu bir plakaya kaplanmış sıralanmış tümör hücreleri üzerinde önümüzdeki yedi gün boyunca gerçekleştirin.Hücreleri kancalar ve propidiyum iyodür boyaları ile lekeleyin ve her bir kuyucuktaki canlı ve ölü hücrelerin sayısını saymak için otomatik bir plaka okuyucu kullanarak hücrelerin görüntülerini yakalayın. Standart asit guanidinyum fenol ve kloroform bazlı yöntem kullanarak total RNA'yı sıralanmış tümör hücrelerinden izole edin. Varsayılan ayarları kullanarak programa özgü adımları izleyerek RNA dizisi hizalamasını gerçekleştirmek için yazılımı açın.RNA araması analiz yöntemini seçin ve ardından fare referans genomunu seçin. Sıralama çekirdeği tarafından sağlanmışsa BED dosyasını yükleyin. FASTQ sıralama dosyalarını yükleyin ve dosyalara benzersiz çoğaltma adları atayın.Grup FASTQ dosyalarını çoğaltır ve dosyaları bir çoğaltma kümesine atayın. İstatistiksel ve normalizasyon analizinin güçlü istatistiksel güce sahip diferansiyel gen ekspresyon sinyallerini tanımlaması için, analiz yazılımını açın ve GFP FASTQ dosyalarını kontrol veri seti olarak seçin. Ardından, istatistiksel ve normalleştirme yöntemi olarak DESeq2'yi seçin ve derleme ve analizi başlatın.Erbb4 gen kaybının biyolojik ve yol önemini belirlemek için tanımlanmış istatistiksel olarak anlamlı Erbb4 aracılı DEG üzerinde fonksiyonel zenginleştirme analizini gerçekleştirmek için açık erişimli fonksiyonel zenginleştirme analizi araçlarına entegre gen ontolojisi veri setlerini kullanın. Enfekte olmuş hücrelerde in vivo allogreft büyüme potansiyelini değerlendirmek için tümör hücrelerini anestezi uygulanan farenin siyatik sinirine enjekte edin. Tümör gerekli boyuta ulaştığında, tümörü daha önce gösterildiği gibi ötenazi yapılmış bir fareden iki-üç bölümde diseke edin.Bir doku bölümünü gece boyunca% 4 Paraformaldehit'e sabitleyin ve ardından sabit bölümü parafine yerleştirin. FFPE dokusundan beş mikrometre kalınlığında kesitler yaptıktan sonra, bölümü slaytlara monte edin ve daha önce gösterildiği gibi H&E ve immün boyama kullanarak aşılanmış dokudaki tümör hücrelerinin varlığını doğrulayın. İki deneysel durum arasındaki in vivo Erbb4 ekspresyon farklılıklarını doğrulamak için, formalin sabit, parafin gömülü dokuyu Erbb4'e özgü antikorlarla boyayın.Malign periferik sinir kılıfı tümör doku hücrelerinin adenovirüs ile transdüksiyonu analiz edildi. EGFP eksprese eden hücreler floresan mikroskopi kullanılarak tespit edildi ve faz-kontrast mikroskobu kullanılarak toplam hücre sayısı belirlendi. Cre-mediated gen ablasyonundan sonra, transfeksiyon etkinliğine bağlı olarak, PCR genotiplemesi, kontrol transdüksiyonuna kıyasla tam bir gen nakavtı ve indüklenmiş ve indüklenmemiş hücrelerin heterojen bir popülasyonunu gösterdi.Malign periferik sinir kılıfı tümör dokularının ortotopik allogreftlerinde bulunan karakteristik histopatoloji, orijinal genetiği değiştirilmiş hayvan modellerinden türetilen tümörlere kıyasla hücre morfolojisinde farklılık göstermiştir. Erbb4 ablasyonu, adeno5-CMV-Cre-ablated hücrelerde hücresel yoğunluğu ve hücresel proliferasyonu azalttı ve adeno5-CMV-GFP ile transdüke olmuş hücreleri kontrol etti. Adeno5-CMV-Cre veya EGFP virüsü ile transdüe edilen tümör hücrelerinde Erbb4 ekspresyonu, adeno5-CMV-Cre transdüe allogreftlerde kontrol adeno5-CMV-EGFP ile tedavi edilen allogreft tümörlere kıyasla azalmıştır.Vasküler yoğunluk, CD31 için immünoreaktivite tespiti ile değerlendirildi ve temsili sonuçlar, adeno5-CMV-Cre-transdüe edilmiş hücrelerin allogreftlerinde, kontrol adeno5-CMV-EGFP ile transdüke hücrelere kıyasla belirgin şekilde azalmış vasküler yoğunluk gösterdi. Gen ablasyonundan sonra, hücreler proliferasyon, göç, 3D büyüme veya mikroçevre değişiklikleri gibi birçok farklı hücre bazlı tahlil türü için ve ayrıca in vivo ortotopik enjeksiyonlar için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

Vivo fare siyatik sinir modeli Perineural işgali

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirusler Immunomodulation tümör hedefli için: tasarım ve değerlendirme Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

İn Vivo Dalak T Hücrelerinin Akım Sitometrisi ile Tümör Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İmmünojenite Taraması

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Rezeke Edilen İnsan Tümör Örneklerinden Ex Vivo Organotipik Psödomiksoma Peritonei Tümör Dilimlerinin Kültürü ve Görüntülenmesi

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Genome-Scale Screening to Identify and Compare Therapeutic Targets in Tumors

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Finding New Therapeutic Targets for Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Through Genome-Scale shRNA Screens (Video) | JoVE

Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümörünün Fare Modellerinde Terapötik Hedefleri Belirlemek için Genetik Profilleme ve Genom Ölçeğinde Bırakma Taraması

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...