Name: co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل من خلال منح من برنامج سات كونيكوس، ومؤسسة جامعة ستراسبورغ، و«J'ai demandé la lune»، و«Une roulade pour Charline»، و«LifePink»، و«فرانك، وريون دي سوليه» و«Semeurs d'Etoile». نشكر الأطفال والأسر المتضررة من مجموعات HG على مساهماتهم في هذا البحث ودعمهم.

بالنسبة لهذا البروتوكول، فإن رقم الاعتماد المتعلق باستخدام المواد البشرية هو DC-2020-4203.
1. تصنيع الجهاز microfluidic، وإعداد والعلاج
<ol><li>تصنيع قوالب SU-8 باستخدام تقنيات التصوير الضوئي التقليدية18. ملاحظة: لهذا الغرض، تم تصميم قناعين للليثوغرافيا الضوئية لبناء طبقتي?...

<ol>
	<li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+molecular+meta-analysis+of+1,000+pediatric+high-grade+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alex's+lemonade+stand+foundation+infant+and+childhood+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011.">Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).</li><li>Blandin, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+environment+and+paired+hierarchical+3D+and+2D+models+of+pediatric+H3.3-mutated+gliomas+recreate+the+patient+tumor+complexity.">Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity.</a> Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+communication+in+brain+cancer.">Synaptic communication in brain cancer.</a> Cancer Research. 80 (14), 2979-2982 (2020).</li><li>Mount, C. W., Yal&#231;&#305;n, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+maps+brain-wide+afferent+oligodendrocyte+precursor+cell+connectivity.">Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity.</a> eLife. 18 (8), 49291 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+astrocyte-synapse+interactions+in+CNS+disorders.">Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders.</a> Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).</li><li>Neftel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+model+of+cellular+states,+plasticity,+and+genetics+for+glioblastoma.">An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma.</a> Cell. 178 (4), 835-849 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+remodeling+of+neural+circuits+in+the+human+brain+decreases+survival.">Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signaling+between+glioblastoma+stem+cells+and+differentiated+tumor+cells+promotes+malignant+progression.">Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+activity-regulated+neuroligin-3+dependency+in+high-grade+glioma.">Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma.</a> Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+glioma+growth+through+Neuroligin-3+secretion.">Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion.</a> Cell. 161 (4), 803-816 (2015).</li><li>Buckingham, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+by+primary+brain+tumors+induces+epileptic+activity.">Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).</li><li>Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glioma+cells+induce+hyperexcitability+in+cortical+networks.">Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks.</a> Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchannel+patterning+strategies+for+in+vitro+structural+connectivity+modulation+of+neural+networks.">Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpiCoDyn:+A+toolbox+for+the+analysis+of+neuronal+network+dynamics+and+connectivity+from+multi-site+spike+signal+recordings.">SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).</li><li>Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+neurite+guidance+to+study+structure-function+relationships+in+topologically-complex+population-based+neural+networks.">Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks.</a> Scientific Reports. 6, 28384 (2016).</li><li>Nguyen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+transcriptional+and+metabolic+responses+of+pediatric+high+grade+gliomas+to+mTOR-HIF-1&#945;+axis+inhibition.">Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1&#945; axis inhibition.</a> Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Cerea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+intracellular+delivery+and+intracellular+recordings+combined+in+MEA+biosensors.">Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors.</a> Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).</li><li>Bruno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multielectrode+arrays+for+spatially+localized+drug+delivery+and+electrical+recordings+of+primary+neuronal+cultures.">Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+chamber+technology+as+building+blocks+for+a+standardized+brain+on+chip+framework.">Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).</li><li>Andreiuk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+polymer+nanoparticles+for+cell+barcoding+in+vitro+and+in+vivo.">Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo.</a> Small. 13 (38), (2017).</li></ol>

يصف هذا العمل نموذجا وظيفيا دقيقا في المختبر لتقييم التفاعل بين الخلايا العصبية القشرية المشتقة من hiPS البشرية والخلايا السرطانية في الدماغ في الأجهزة الدقيقة. واحدة من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول كان التمايز hiPS في الخلايا العصبية الجلوتاماترجية، والتي أكدت من خلال انخفاض تلط...

الأطفال جليوما عالية الجودة (pHGG) معرض التنوع الجيني الموسعة و phenotypic اعتمادا على عمر المريض, موقع الورم التشريحية وتمديد, والسائقين الجزيئية1. وهي أورام الدماغ العدوانية التي يتم التحكم فيها بشكل سيئ مع خيارات العلاج المتاحة حاليا، وهي السبب الرئيسي للوفاة المتعلقة بسرطان الدماغ في الأطفال والمراهقين2. لذلك ، أكثر من 80 ٪ من المرضى يندبون في غضون عامين بعد تشخيصهم ، ومتوسط بقائهم على قيد الحياة هو 9-15 شهرا ، اعتمادا على مواقع الدماغ والطفرات السائق. غياب العلاج العلاجي هو الدافع الرئيسي للبحوث المختبرية ويسلط الضوء على الحاجة الفورية لنهج علاجية مبتكرة جديدة. لهذا الغرض، تم تطوير خطوط الخلايا المشتقة من المريض (PDCL) على أمل توفير التنوع pHGG3 في خطوط ثنائية الأبعاد (2D) و / أو ثلاثي الأبعاد (3D) الأعصاب. ومع ذلك، فإن تلك الثقافات المشتقة من المريض في الخلايا المختبرية لا تحاكي جميع الحالات المتغيرة في الدماغ. لا تأخذ هذه النماذج في الاعتبار البيئات التشريحية العصبية المجهرية والمجهرية الموصوفة عادة في pHGG.
عادة، يتطور pHGG في الأطفال الأصغر سنا بشكل رئيسي في مناطق بونتين والثالامي، في حين يركز HGG للمراهقين والشباب في المناطق القشرية، وخاصة في الفصوص الجبهية الصدغية1. هذه الخصائص الموقع عبر أعمار الأطفال ويبدو أن تنطوي على بيئات مختلفة تؤدي إلى تكوين الدبقية وشبكة علاج بين الخلايا السرطانية ونشاط الخلايا العصبية محددة4,5,6. على الرغم من أن الآليات لا تزال غير محددة، يتطور pHGG بشكل رئيسي من الخلايا السليفة العصبية على طول مسار التمايز من الأنساب الفلكية والأوليغوديندروغليال. في حين أن دور هذه الأنساب الدبقية كان لفترة طويلة يقتصر على الدعم الهيكلي البسيط للخلايا العصبية ، فمن الواضح الآن أنها تتكامل تماما في الدوائر العصبية وتظهر تفاعلات معقدة ثنائية الاتجاه بين الخلايا العصبية الدبقية القادرة على إعادة تنظيم المناطق الهيكلية للدماغ وإعادة تشكيل الدوائر العصبية4،7،8 . وعلاوة على ذلك، تشير قطع متزايدة من الأدلة إلى أن الجهاز العصبي المركزي (CNS) يلعب دورا حاسما في بدء سرطان الدماغ وتطوره. ركزت الأعمال الأخيرة على نشاط الخلايا العصبية ، والذي يبدو أنه يدفع نمو وداء العث من الأورام الخبيثة الدبقية من خلال عوامل النمو المفرزة والاتصالات الكهروكيميائية المباشرة6،9. على نحو متبادل، يبدو أن الخلايا الدبقية عالية الجودة تؤثر على وظيفة الخلايا العصبية مع زيادة نشاط الخلايا العصبية الغلوتاماترجية وتعديل تشغيل الدوائر التي يتم دمجها فيها هيكليا وكهربائيا9. لذا، أظهرت الدراسات التي تستخدم نماذج مشتقة من المريض وأدوات علم الأعصاب الجديدة التي تتحكم في عمل الخلايا العصبية تأثيرا خاصا بالدائرة لنشاط الخلايا العصبية على موقع الورم الدبقي والنمو والتقدم. معظم هذه التوقعات العصبية المشاركة في الأورام الدبقية هي الجلوتاماترجية والتواصل من خلال إفرازات الغلوتامات. المؤشرات الحيوية الجلوتاماترجية المحددة مثل mGluR2 أو vGlut1/2 توصف عادة6.
ومن المثير للاهتمام، على الرغم من عدم التجانس الجزيئي، الأطفال والكبار جليوماس عالية الجودة تظهر استجابة التكاثر نموذجية لنشاط الخلايا العصبية الغلوتاماترجية وغيرها من العوامل المفرزة مثل neuroligin-3 أو BDNF (عامل العصبية المشتقة من الدماغ)4،6،10،11،12،13 . في المناطق القشرية, الأطفال والكبار HGGs يمكن أن تحفز فرط الخلايا العصبية من خلال زيادة إفراز الغلوتامات وتمنع الخلايا الداخلية GABA مما يؤدي إلى الأورام الدبقية المرتبطة نشاط شبكة الصرع14,15. وعلاوة على ذلك، يمكن إعادة تشكيل الدوائر العصبية من قبل الأورام الدبقية دفع مهام عصبية محددة، على سبيل المثال، اللغة، ويمكن الاستيلاء على نشاط الخلايا العصبية المنظمة إضافية9.
وبناء على هذا الأساس المنطقي، يجب توضيح وتعزيز فهم الاتصالات ثنائية الاتجاه بين خلايا الورم الدبقي والخلايا العصبية بشكل كامل ودمجها مع المراحل المبكرة من نهج pHGG في المختبر. مثل هذه النمذجة المبتكرة أمر بالغ الأهمية في فهم وقياس تأثير النشاط الكهربائي العصبي أثناء اختبار المخدرات وتوقع استجابة pHGG في دوائر الدماغ. التطورات الأخيرة في أدوات علم الأعصاب، مثل الأجهزة microfluidic وأعمال البحوث pHGG، هي السرير لتطوير نهج النمذجة الجديدة وتكون قادرة الآن على دمج البيئة الدقيقة في الدماغ في نماذج pHGG المختبر3،16،17،18،19. إلى جانب التسجيلات الكهربية باستخدام صفائف متعددة الإلكترونات (MEA) ، توفر الأجهزة الدقيقة 20،21،22 إمكانية محاكاة الظروف الفسيولوجية أثناء تسجيل النشاط الكهربائي للشبكة العصبية بأكملها واستخراج معلمات اتصال الشبكة في ظل عدة ظروف. يسمح هذا الجهاز23,24 أولا بالترسب الدقيق للخلايا في غرفة مباشرة على MEA. تمكن هذه التكنولوجيا من التحكم في كثافة وبذر الخلايا والتجانس على MEA والتحكم الدقيق في تبادل الوسائط ، وهي خطوة حاسمة لتمايز السلف العصبي البشري مباشرة إلى أجهزة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون البذور غرفة الترسيب الحالية مع خلايا متعددة في نقاط زمنية مختلفة.
لذلك، تهدف هذه الدراسة إلى تطوير نموذج وظيفي في المختبر يشارك في زراعة الخلايا العصبية القشرية المشتقة من الجلوتاماترجية البشرية (hiPS) والخلايا المشتقة من pHGG في أجهزة microfluidic وتسجيل نشاطها الكهربائي لتقييم التفاعلات الكهربائية بين مجموعتي الخلايا. أولا، تم الحصول على الخلايا العصبية الغلوتاماترجية القشرية المشتقة من hiPS وتتميز في الأجهزة الدقيقة فلوريدية في مراحل مختلفة من الثقافة [اليوم 4 (D4)، كخلايا hiPS، واليوم 21 (D21) واليوم 23 (D23)، والخلايا العصبية نضجت الجلوتاماترجية]. للخطوة الثانية من الثقافة المشتركة، تم استخدام نموذجين pHGG: خط UW479 الأطفال التجارية وخلايا pHGG بدأت من ورم المريض (BT35)3، تحمل طفرة سائق K27M H3.3. وأخيرا، قمنا بإجراء تسجيلات كهربية للخلايا الجلوتاماترجية في D21 قبل بذر خلايا pHGG وD23 بعد 48 ساعة من الثقافة المشتركة في نفس الجهاز microfluidic. تميزت التفاعلات بين الخلايا العصبية الغلوتاماترجية وخلايا pHGG بزيادة كبيرة في النشاط الكهربي المسجل.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td >MCS</td>
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >53750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >51999</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accutase</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6964</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ala -Gln (GlutaMAX)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G8541</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axel Observer 7 Microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >431007-9904-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon&#174;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >353109</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >HERASafe type KS12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Colibri 7 LED</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >4230529710-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >
			<div>Cortical Glutamatergic Neurons</div>
			</td>
			<td >BrainXell</td>
			<td >BX-0300</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31331-028</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12 Medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8437</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS 1X</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >L0615-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasYFlaskTM&#160;cell culture flasks 75cm3</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >500105</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Geltrex</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A1413201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Memmert</td>
			<td >IC0150med</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MCS InterFace Boarder</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEA2100</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P10</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729020</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P100</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P1000</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729070</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P200</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729060</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >33290</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiChannel Experimenter</td>
			<td >MCS</td>
			<td >-</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N2 Supplement-A</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >7152</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal Medium</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21103049</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurocult SM1 neuronal supplement</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >5711</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 0.1 - 10 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >030570ACL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 1 - 200 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >032260CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 50 - 1250 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >134760CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >X0557-100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >4000202/4038202</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 10 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357551</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 5 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357543</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plaque chauffante (CultureTemp)</td>
			<td >Belart</td>
			<td >370151000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6407</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primovert microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >415510-1100-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scepter (Handheld Automated Cell Counter)</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >PHCC00000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TGF-&#946;1</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >100-21C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352070</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions

تمثل الأورام الدبقية عالية الجودة لدى الأطفال (pHGG) سرطان الدماغ في مرحلة الطفولة والمراهقة التي تحمل تشخيصا كئيبا سريعا. نظرا لوجود حاجة للتغلب على مقاومة العلاجات الحالية وإيجاد طريقة جديدة للعلاج ، فإن نمذجة المرض في أقرب وقت ممكن في وضع المختبر لاختبار أدوية جديدة وإجراءات علاجية أمر صعب للغاية. دراسة العمليات البيولوجية المرضية الأساسية، بما في ذلك فرط حساسية الخلايا العصبية الغلوتاماترجية، سيكون تقدما حقيقيا في فهم التفاعلات بين الدماغ البيئي وخلايا pHGG. لذلك، لإعادة التفاعلات الخلية الخلايا العصبية / pHGG، وهذا العمل يظهر تطوير نموذج وظيفي في المختبر المشاركة في زراعة الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPS) المستمدة من الخلايا العصبية القشرية الجلوتاماترجية خلايا pHGG في أجهزة microfluidic مجزأة وعملية لتسجيل التعديلات الكهربية. كانت الخطوة الأولى هي التمييز وتوصيف الخلايا العصبية الجلوتاماترجية البشرية. ثانيا، تم استزراع الخلايا في أجهزة ميكروفلويديك مع خطوط الخلايا المشتقة من pHGG. ثم تم تضمين البيئة الدقيقة في الدماغ ونشاط الخلايا العصبية في هذا النموذج لتحليل التأثير الكهربائي لخلايا pHGG على هذه الخلايا العصبية البيئية الدقيقة. وتقترن التسجيلات الكهربية باستخدام صفائف متعددة الأقطاب (MEA) لهذه الأجهزة microfluidic لمحاكاة الظروف الفسيولوجية وتسجيل النشاط الكهربائي للشبكة العصبية بأكملها. تم التأكيد على زيادة كبيرة في استثارة الخلايا العصبية في وجود الخلايا السرطانية.

قبل دراسة التفاعلات الكهربائية بين الخلايا العصبية الغلوتاماترجية وخلايا الورم الدبقي، تم وصف الخلايا العصبية القشرية المشتقة من hiPS للتحقق من جدوى زراعة هذه الخلايا في الأجهزة الدقيقة (الشكل 1A). تم تقييم توصيفها باستخدام نستين، Sox2، mGlurR2 (مستقبلات الغلوتامات...

Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

تكشف الأعمال الحديثة عن تأثير الخلايا العصبية على خلايا الورم الدبقي للأطفال عالية الجودة (pHGG) وتفاعلاتها المتبادلة. يظهر العمل الحالي تطور نموذج في المختبر يشارك في زراعة خلايا pHGG والخلايا العصبية الغلوتاماترجية وسجل تفاعلاتها الكهربية لمحاكاة تلك التفاعلات.

الثقافة المشتركة للخلايا العصبية الغلوتاماترجية وخلايا الورم الدبقي عالية الجودة للأطفال في الأجهزة الدقيقة لتقييم التفاعلات الكهربائية

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

التفاعلات بين خلايا الورم الدبقي الخبيثة والخلايا العصبية المحيطة بها تكتسب اهتماما. هنا، نظهر تطور نموذج في المختبر شارك في زراعة الخلايا العصبية القشرية المشتقة من الجلوتاماترجية والخلايا السرطانية. تسمح الأجهزة الدقيقة المستخدمة في الثقافات المشتركة إلى جانب صفائف متعددة الأقطاب بدراسة أنواع الخلايا المختلفة وإجراء تسجيلات النشاط الكهربائي في نقاط زمنية مختلفة من الثقافات.هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص للدراسات الوظيفية والميكانية ولتحليل آثار العوامل الدوائية التي تمنع هجرة خلايا الورم الدبقي عالية الجودة لدى الأطفال والتفاعل مع الخلايا العصبية. للبدء في زراعة الخلايا العصبية القشرية المشتقة من IPS البشرية التجارية ، قم بإفراغ الخزانات المدخلة والمنفذ للجهاز microfluidic عن طريق طموح ماصة ، مما يسمح فقط بملء قنوات الجهاز بالوسط. قم بزرع خلايا IPS البشرية عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 6.5 مليون خلية IPS بشرية لكل تعليق ملليلتر في الوسط والسماح للجهاز بأن يكون تحت غطاء محرك السيارة لمدة 15 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق.بعد 15 دقيقة، قم بملء كل من الخزانات المدخلة والمنفذ ب 50 ميكرولتر من اليوم الرابع المتوسط للثقافة، ثم قم بنقل الجهاز إلى الحاضنة للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 23 يوما. استبدل الوسط كل ثلاثة إلى أربعة أيام كما هو موضح في النص. لحساب الخلايا وتقييم الجدوى باستخدام مجهر تباين المرحلة القياسية، التقاط صور مجهرية في اليوم الرابع واليوم الحادي والعشرين واليوم الثالث والعشرين.الثقافة على حد سواء UW479 و BT35 خطوط الخلية في DMEM و F-12 GlutaMAX تكمل مع 10٪ مصل البقر الجنين في قارورة ثقافة الخلية. الحفاظ على ثقافة الخلية تحت بيئة خاضعة للرقابة عند 37 درجة مئوية في ظروف نورموكسيك طوال التجربة. مراقبة كل خط الخلية للوصول إلى التقاء 80٪.في اليوم 21 بعد ثقافة الخلايا العصبية الجلوتاماترجية، ابدأ الثقافة المشتركة عن طريق محاولة تنظير خلايا UW479 و BT35. البذور الخلايا UW479 و BT35 جرب على رأس الخلايا العصبية الغلوتاماترجية الملتصقة ناضجة في كل جهاز microfluidic مخصصة. الحفاظ على الثقافات المشتركة لمدة يومين في ظل بيئة تسيطر عليها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الخلايا العصبية الجلوتاماترجية D11 والمتوسطة فصاعدا.عد خلايا الورم الدبقي عالية الجودة للأطفال باستخدام الصور المجهرية التي تم تحليلها باستخدام برنامج تحليل الصور لتقييم قدرتها على البقاء وحساب النسبة المئوية للخلايا. ضع MFD في جهاز التسجيل واستخدم برنامجا متاحا تجاريا لإجراء التسجيل الكهربي للخلايا العصبية الجلوتاماترجية في اليوم الحادي والعشرين. قبل بذر خلايا الورم الدبقي عالية الجودة للأطفال ، قم بإجراء تسجيل كهربي ثان للخلايا العصبية الغلوتاماترجية المتمايزة المستزرعة كتحكم مواز للثقافة المشتركة.إجراء تسجيل كهربي آخر في اليوم الثالث والعشرين بعد يومين من الثقافة المشتركة. تم وصف الخلايا العصبية القشرية المشتقة من IPS وتقييمها باستخدام نستين ، SOX2 ، مستقبلات الغلوتامات الميتابوتروبيك II ، وVGLUT1 المناعية. نستين هو بروتين خيوط وسيطة وتم التعبير عنه في خلايا CNS غير المتمايزة.كما تم التعبير عن SOX2 في الخلايا غير المتمايزة من الظهارة العصبية في CNS. انخفضت نسبة خلايا نستين وSOX2 الإيجابية من اليوم الرابع إلى اليوم الحادي والعشرين ، مما يؤكد الحالة المتمايزة للخلايا العصبية الجلوتاماترجية. كشفت الصور المجهرية عن توزيع تدريجي للخلايا العصبية الغلوتاماترجية عبر الأجهزة الدقيقة.عندما تمت إضافة BT35 و UW479 إلى الثقافة ، لوحظ أن الخلايا العائمة كانت موجودة بعد بذر الخلايا الدبقية في اليوم الحادي والعشرين ، والتي اختفت تدريجيا حتى اليوم الثالث والعشرين وأصبحت ملتزمة في الجهاز. وكانت النسب المئوية للخلايا القابلة للحياة ل BT35 وUW479 قابلة للمقارنة، وأشارت ضمنا إلى أنه يمكن استخدام خطوط الخلايا المشتقة من المريض بشكل مناسب. أظهر اكتشاف المسامير ومؤامرة النقط في اليوم الثالث والعشرين من الثقافة زيادة النشاط الكهربائي بعد إضافة خلايا الورم الدبقي عالية الجودة للأطفال.لمراقبة تزامن نشاط الشبكة العصبية ، تم تسجيل معدل إطلاق النار الفوري في BT35 أو الخلايا العصبية الغلوتاماترجية. كان الفرق في النشاط الكهربائي بين الخلايا العصبية الغلوتاماترجية المستزرعة بشكل فردي والمثقفة بشكل مشترك كبيرا في اليوم الثالث والعشرين. ويمكن أن يشمل التطور المنهجي الإضافي التقييم الوظيفي للشبكة مع تحليل الاندفاع والارتباطات الزمنية الخاصة عبر الشبكة.الآن، لدى الباحثين أداة واعدة لاستكشاف التفاعلات والاستهداف الدوائي لخطوط ورم الورم الدبقي عالية الجودة للأطفال والخلايا العصبية عالية PSC. يمكن استخدام عدة خطوط ورم والعديد من أنواع الخلايا العصبية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

زرع أورام الدماغ الزرد للأطفال في المضيفين ذوي الكفاءة المناعية لدراسة طويلة الأمد لسلوك الخلايا السرطانية واستجابة الأدوية

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

بروتوكول شامل للعينة ونخاع العظام عملية قياس الأمراض المتبقية قابلة للقياس والخلايا الجذعية ليوكيميك في سرطان الدم النقوي الحاد

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة اللب والثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية لدراسة التفاعلات الخاصة بها

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

تقييم المؤشرات الحيوية في الدبقي التي Immunohistochemistry على الثقافات نيوروسفيري جزءا لا يتجزأ من البارافين الدبقي 3D

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

قياس إعادة عرض العظام وإعادة إنشاء بيئة الورم والعظام الدقيقة باستخدام ثقافة كالفاريا المشتركة والقياس الHISTOMORPHometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

الثقافة المشتركة للخلايا الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية المنقوشة لدراسة الهجرة والتفاعلات الخلوية

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

سير عمل الفحص السريع لتحديد العلاج المركب المحتمل ل GBM باستخدام الخلايا الجذعية الدبقي المشتقة من المريض

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

مقايسات الكيمياء المناعية للخلايا الحية 3D للورم الدبقي في خط الوسط المنتشر لدى الأطفال

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

توليد وزراعة المواد العضوية عالية الجودة المشتقة من سرطان المبيض المصلي

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

تحسين معلمات الأداء لمقايسة طول التيلومير TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...