Name: co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Satt Conectus program, Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» og «Semeurs d'Etoile» associations. Vi takker de børn og familier, der er berørt af HGG'erne, for deres bidrag til denne forskning og deres støtte.

For denne protokol er akkrediteringsnummeret relateret til brugen af humant materiale DC-2020-4203.
1. Fremstilling, forberedelse og behandling af mikrofluidiske anordninger
<ol><li>Fabrikere SU-8 forme ved hjælp af konventionelle fotolitografi teknikker18. BEMÆRK: Til dette formål er to fotolitografimasker designet til at konstruere to lag fotoresistensstrukturer på silicium wafersubstrat og et tyndt SU-8 2005 fotoresistlag (3,2 μm højt og 6 ± 1 μm bredt),...

<ol>
	<li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+molecular+meta-analysis+of+1,000+pediatric+high-grade+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alex's+lemonade+stand+foundation+infant+and+childhood+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011.">Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).</li><li>Blandin, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+environment+and+paired+hierarchical+3D+and+2D+models+of+pediatric+H3.3-mutated+gliomas+recreate+the+patient+tumor+complexity.">Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity.</a> Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+communication+in+brain+cancer.">Synaptic communication in brain cancer.</a> Cancer Research. 80 (14), 2979-2982 (2020).</li><li>Mount, C. W., Yal&#231;&#305;n, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+maps+brain-wide+afferent+oligodendrocyte+precursor+cell+connectivity.">Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity.</a> eLife. 18 (8), 49291 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+astrocyte-synapse+interactions+in+CNS+disorders.">Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders.</a> Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).</li><li>Neftel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+model+of+cellular+states,+plasticity,+and+genetics+for+glioblastoma.">An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma.</a> Cell. 178 (4), 835-849 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+remodeling+of+neural+circuits+in+the+human+brain+decreases+survival.">Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signaling+between+glioblastoma+stem+cells+and+differentiated+tumor+cells+promotes+malignant+progression.">Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+activity-regulated+neuroligin-3+dependency+in+high-grade+glioma.">Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma.</a> Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+glioma+growth+through+Neuroligin-3+secretion.">Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion.</a> Cell. 161 (4), 803-816 (2015).</li><li>Buckingham, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+by+primary+brain+tumors+induces+epileptic+activity.">Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).</li><li>Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glioma+cells+induce+hyperexcitability+in+cortical+networks.">Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks.</a> Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchannel+patterning+strategies+for+in+vitro+structural+connectivity+modulation+of+neural+networks.">Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpiCoDyn:+A+toolbox+for+the+analysis+of+neuronal+network+dynamics+and+connectivity+from+multi-site+spike+signal+recordings.">SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).</li><li>Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+neurite+guidance+to+study+structure-function+relationships+in+topologically-complex+population-based+neural+networks.">Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks.</a> Scientific Reports. 6, 28384 (2016).</li><li>Nguyen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+transcriptional+and+metabolic+responses+of+pediatric+high+grade+gliomas+to+mTOR-HIF-1&#945;+axis+inhibition.">Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1&#945; axis inhibition.</a> Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Cerea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+intracellular+delivery+and+intracellular+recordings+combined+in+MEA+biosensors.">Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors.</a> Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).</li><li>Bruno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multielectrode+arrays+for+spatially+localized+drug+delivery+and+electrical+recordings+of+primary+neuronal+cultures.">Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+chamber+technology+as+building+blocks+for+a+standardized+brain+on+chip+framework.">Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).</li><li>Andreiuk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+polymer+nanoparticles+for+cell+barcoding+in+vitro+and+in+vivo.">Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo.</a> Small. 13 (38), (2017).</li></ol>

Dette arbejde beskriver en nøjagtig funktionel in vitro-model til at evaluere samspillet mellem menneskelige hiPS-afledte kortikale glutamatergiske neuroner og hjernetumorceller i mikrofluidiske enheder. Et af de afgørende skridt i denne protokol var hiPS differentiering i glutamatergiske neuroner, som blev bekræftet af faldet i Nestin og Sox2 immunofluorescent farvning og samtidig udseende af mGluR2 og vGLUT1 farvning. Ikke desto mindre forblev kun få neurale forfædre, da kun halvdelen af de glutamatergisk...

Pædiatriske høj kvalitet gliomer (pHGG) udviser en udvidet genolypic og fænotypisk mangfoldighed afhængigt af patientens alder, tumor anatomiske placering og udvidelse, og molekylære drivere1. De er aggressive hjernetumorer, der er dårligt kontrolleret med de aktuelt tilgængelige behandlingsmuligheder og er den hyppigste dødsårsag relateret til hjernekræft hos børn og unge2. Så mere end 80% af patienterne er tilbagefald inden for 2 år efter deres diagnose, og deres median overlevelse er 9-15 måneder, afhængigt af hjernens placeringer og driver mutationer. Fraværet af helbredende behandling er den primære trang til laboratorieforskning og fremhæver det umiddelbare behov for nye innovative terapeutiske tilgange. Til dette formål blev patientafledte cellelinjer (PDCL) udviklet i håb om at give pHGG-mangfoldigheden3 i todimensionelle (2D) linjer og / eller tredimensionelle (3D) neurosfærer. Ikke desto mindre efterligner de patientafledte in vitro-cellekulturer ikke alle hjernevariable situationer. Disse modeller betragter ikke de makroskopiske og mikroskopiske neuro-anatomiske miljøer, der typisk er beskrevet i pHGG.
Normalt udvikler pHGG hos yngre børn hovedsageligt i pontin- og thalamiske regioner, mens unge og unge voksnes HGG koncentrerer sig i de kortikale områder, især i frontotemporale lobes1. Disse placeringsspecifikiteter på tværs af pædiatriske aldre synes at involvere forskellige miljøer, der fører til gliomagenese og et snørklede netværk mellem tumorceller og specifik neuronal aktivitet4,5,6. Selv om mekanismer stadig ikke er identificeret, pHGG primært udvikler sig fra neurale prækursorer celler langs differentiering bane af astrogliale og oligodendroglial slægter. Mens disse glial afstamninger længe har været begrænset til simpel strukturel støtte til neuroner, er det nu klart fastslået, at de integreres helt i neurale kredsløb og udviser komplekse tovejs glial-neuronale interaktioner i stand til at reorganisere strukturelle regioner i hjernen og ombygge neuronale kredsløb4,7,8 . Desuden, stigende stumper af beviser tyder på, at centralnervesystemet (CNS) spiller en afgørende rolle i hjernen kræft indledning og progression. Nylige værker fokuseret på neuronal aktivitet, som synes at drive vækst og mitose af glial maligniteter gennem udskilles vækstfaktorer og direkte elektrokemiske synaptiske kommunikation6,9. Gensidigt, høj kvalitet gliom celler synes at påvirke neuronal funktion med en stigende glutamatergic neuronal aktivitet og modulere driften af de kredsløb, hvor de er strukturelt og elektrisk integreret9. Så, undersøgelser ved hjælp af patient-afledte modeller og nye neurovidenskab værktøjer kontrollerende neuron handling demonstreret en kredsløbsspecifik effekt af neuronal aktivitet på gliom placering, vækst, og progression. De fleste af disse neuronale fremskrivninger involveret i gliomer er glutamatergic og kommunikere gennem glutamat sekreter. Specifikke glutamatergiske biomarkører såsom mGluR2 eller vGlut1/2 er almindeligt beskrevet6.
Interessant, på trods af deres molekylære heterogenitet, pædiatriske og voksne høj kvalitet gliomer viser en typisk proliferativ reaktion på glutamatergic neuronal aktivitet og andre udskilles faktorer såsom neuroligin-3 eller BDNF (hjerne-afledt neurotrofisk faktor)4,6,10,11,12,13 . I kortikale regioner, pædiatriske og voksne HGG'er kan fremkalde neuronal hyperexcitability gennem en øget glutamat sekretion og hæmme GABA interneurons fører til gliomer forbundet med epileptisk netværk aktivitet14,15. Derudover kan neurale kredsløb ombygges af gliomer, der skubber specifikke neurologiske opgaver, for eksempel sprog, og kan rekvirere yderligere organiseret neuronal aktivitet9.
Baseret på dette rationale skal forståelsen af tovejskommunikation mellem gliomceller og neuroner være fuldt belyst og integreret med de tidlige stadier af in vitro pHGG-tilgange. En sådan innovativ modellering er afgørende for at forstå og måle den neuronale elektriske aktivitetspåvirkning under lægemiddeltest og foregribe pHGG-respons i hjernekredsløb. Den seneste udvikling inden for neurovidenskabsværktøjer, såsom mikrofluidiske enheder og pHGG-forskningsarbejder, er sengen til at udvikle nye modelleringsmetoder og nu være i stand til at integrere hjernens mikromiljø i in vitro pHGG-modeller3,16,17,18,19. Kombineret med elektrofysiologiske optagelser ved hjælp af multielektrode arrays (MEA), mikrofluidiske enheder20,21,22 giver mulighed for at efterligne fysiologiske forhold, mens registrering af den elektriske aktivitet i hele neurale netværk og udtrække netværksforbindelse parametre under flere betingelser. Denne enhed23,24 tillader først den præcise aflejring af celler i et kammer direkte på MEA. Denne teknologi gør det muligt at styre celle såtæthed og homogenitet på MEA og fin kontrol af medieudveksling, hvilket er et kritisk skridt for menneskelig neural stamfaderdifferentiering direkte i enheder. Desuden kan det nuværende depositionskammer sås med flere celler på forskellige tidspunkter.
Så denne undersøgelse havde til formål at udvikle en funktionel in vitro model co-culturing menneskelige Pluripotent Stem (hiPS)-afledte kortikale glutamatergiske neuroner og pHGG-afledte celler i mikrofluidiske enheder og registrere deres elektriske aktivitet til at evaluere elektriske interaktioner mellem begge cellepopulationer. For det første blev hiPS-afledte kortikale glutamatergiske neuroner opnået og karakteriseret i mikrofluidiske enheder på forskellige stadier af kultur [dag 4 (D4), som hiPS-celler og dag 21 (D21) og dag 23 (D23), som glutamatergiske modnede neuroner]. For det andet trin i co-kultur, to pHGG modeller blev brugt: kommercialiseret pædiatrisk UW479 linje og pHGG celler indledt fra en patient tumor (BT35)3, der bærer en H3.3 K27M driver mutation. Endelig udførte vi elektrofysiologiske optagelser af glutamatergiske celler på D21 før pHGG cellesåning og D23 efter 48 timers co-kultur i den samme mikrofluidiske enhed. Samspillet mellem glutamatergiske neuroner og pHGG-celler var karakteriseret ved en betydelig stigning i den registrerede elektrofysiologiske aktivitet.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td >MCS</td>
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >53750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >51999</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accutase</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6964</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ala -Gln (GlutaMAX)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G8541</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axel Observer 7 Microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >431007-9904-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon&#174;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >353109</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >HERASafe type KS12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Colibri 7 LED</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >4230529710-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >
			<div>Cortical Glutamatergic Neurons</div>
			</td>
			<td >BrainXell</td>
			<td >BX-0300</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31331-028</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12 Medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8437</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS 1X</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >L0615-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasYFlaskTM&#160;cell culture flasks 75cm3</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >500105</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Geltrex</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A1413201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Memmert</td>
			<td >IC0150med</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MCS InterFace Boarder</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEA2100</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P10</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729020</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P100</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P1000</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729070</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P200</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729060</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >33290</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiChannel Experimenter</td>
			<td >MCS</td>
			<td >-</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N2 Supplement-A</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >7152</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal Medium</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21103049</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurocult SM1 neuronal supplement</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >5711</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 0.1 - 10 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >030570ACL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 1 - 200 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >032260CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 50 - 1250 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >134760CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >X0557-100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >4000202/4038202</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 10 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357551</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 5 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357543</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plaque chauffante (CultureTemp)</td>
			<td >Belart</td>
			<td >370151000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6407</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primovert microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >415510-1100-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scepter (Handheld Automated Cell Counter)</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >PHCC00000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TGF-&#946;1</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >100-21C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352070</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions

Pædiatriske høj kvalitet gliomer (pHGG) repræsenterer barndom og unge hjernekræft, der bærer en hurtig dyster prognose. Da der er behov for at overvinde modstanden mod de nuværende behandlinger og finde en ny måde at helbrede på, er det meget krævende at modellere sygdommen så tæt som muligt i en in vitro-indstilling for at teste nye lægemidler og terapeutiske procedurer. At studere deres grundlæggende patobiologiske processer, herunder glutamatergisk neuron hyperexcitability, vil være et reelt fremskridt i forståelsen af interaktioner mellem miljøhjernen og pHGG-cellerne. Derfor, at genskabe neuroner / pHGG celle interaktioner, dette arbejde viser udviklingen af en funktionel in vitro model co-culturing human-induceret Pluripotent Stem (hiPS)-afledt kortikale glutamatergiske neuroner pHGG celler i opdelte mikrofluidiske enheder og en proces til at registrere deres elektrofysiologiske modifikationer. Det første skridt var at differentiere og karakterisere menneskelige glutamatergiske neuroner. For det andet blev cellerne kultiveret i mikrofluidiske enheder med pHGG afledte cellelinjer. Hjernens mikromiljø og neuronal aktivitet blev derefter inkluderet i denne model for at analysere pHGG-cellernes elektriske indvirkning på disse mikromiljøniske neuroner. Elektrofysiologiske optagelser er koblet ved hjælp af multielektrode arrays (MEA) til disse mikrofluidiske enheder til at efterligne fysiologiske forhold og til at registrere den elektriske aktivitet i hele neurale netværk. En betydelig stigning i neuron excitabilitet blev understreget i overværelse af tumorceller.

Før man studerede elektriske interaktioner mellem glutamatergiske neuroner og gliomceller, blev hiPS-afledte kortikale glutamatergiske neuroner karakteriseret for at validere muligheden for at dyrke dem i mikrofluidiske enheder (Figur 1A). Deres karakterisering blev vurderet ved hjælp af Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotropiske glutamatreceptorer 2) og vGLUT1 immunstaining, repræsenteret i figur 1A(2-7). Da Nestin er et ...

Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Nylige værker afdække neuronal indvirkning på høj kvalitet pædiatriske gliom (pHGG) celler og deres gensidige interaktioner. Det nuværende arbejde viser udviklingen af en in vitro model co-culturing pHGG celler og glutamatergic neuroner og indspillet deres elektrofysiologiske interaktioner til at efterligne disse interaktiviteter.

Co-kultur af glutamatergiske neuroner og pædiatriske høj kvalitet Glioma celler i mikrofluidiske enheder til at vurdere elektriske interaktioner

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Samspillet mellem de ondartede gliomceller og deres omgivende neuroner vinder interesse. Her viser vi udviklingen af en in vitro model co-culturing afledte kortikale glutamatergiske neuroner og tumorceller. De mikrofludiske enheder, der anvendes til co-kulturer koblet til multielektrode arrays tillader undersøgelse af forskellige celletyper og udføre elektriske aktivitet optagelser på forskellige tidspunkter af kulturer.Denne metode er især nyttig til funktionelle og mekanistiske undersøgelser og til analyse af virkningerne af farmakologiske midler, der blokerer pædiatrisk høj kvalitet gliom celle migration og interaktion med neuroner. For at begynde at dyrke de kommercialiserede menneskelige IPS-afledte kortikale glutamatergiske neuroner, tømme indløbs- og udløbsreservoirerne i den mikrofluidiske enhed ved pipette aspiration, så kun enhedens kanaler fyldes med medium. Frø de menneskelige IPS-celler ved at tilføje 10 mikroliter af 6,5 millioner menneskelige IPS-celler pr. milliliter suspension i mediet og lad enheden være under emhætten i 15 minutter for at tillade celler at vedhæfte.Efter 15 minutter fyldes både indløbs- og udløbsreservoirer med 50 mikroliters dag fire kulturmedium og overfør derefter enheden til inkubatoren for at opretholde cellerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 23 dage. Erstat mediet hver tredje til fjerde dag som beskrevet i teksten. For at tælle cellerne og vurdere levedygtigheden ved hjælp af et standardfasekontrastmikroskop skal du tage mikroskopiske billeder på 4. dag, 21. dag og 23. dag.Kultur både UW479 og BT35 cellelinjer i DMEM og F-12 GlutaMAX suppleret med 10% fosterkvæg serum i en celle kultur kolbe. Opretholde cellekultur under et kontrolleret miljø ved 37 grader Celsius i normoxiske forhold i hele eksperimentet. Overhold hver cellelinje for at nå 80% sammenløb.På dag 21 post-kultur af glutamatergic neuroner, starte co-kultur ved trypsinizing UW479 og BT35 celler. Frø de trypsiniserede UW479- og BT35-celler oven på de modne klæbende glutamatergiske neuroner i hver dedikeret mikrofluidisk enhed. Opretholde co-kulturer i to dage under et kontrolleret miljø ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid med glutamatergic neuron D11 og videre medium.Tæl pædiatriske gliomceller af høj kvalitet ved hjælp af de mikroskopiske billeder analyseret med billedanalysesoftwaren for at vurdere deres levedygtighed og beregne procentdelen af celler. Placer MFD i optageenheden og brug en kommercielt tilgængelig software til at udføre den elektrofysiologiske optagelse af glutamatergiske neuroner på den 21. dag. Før såning pædiatriske høj kvalitet gliom celler, udføre en anden elektrofysiologisk registrering af differentierede glutamatergic neuroner dyrkes som kontrol parallelt med co-kultur.Udfør en anden elektrofysiologisk optagelse på den 23. dag efter to dage af co-kulturen. HumanE IPS-afledte kortikale glutamatrgiske neuroner blev karakteriseret og vurderet ved hjælp af nestin, SOX2, metabotropiske glutamatreceptorer II og VGLUT1 immunstaining. Nestin er et mellemliggende glødetrådsprotein, og det blev udtrykt i udifferentierede CNS-celler.SOX2 blev også udtrykt i udifferentierede celler i det neurale epitel i CNS. Nestin- og SOX2-positive celler faldt fra den fjerde dag til den 21. dag, hvilket bekræftede den differentierede tilstand af glutamatergiske neuroner. De mikroskopiske billeder afslørede en progressiv fordeling af glutamatergiske neuroner på tværs af mikrofluidiske enheder.Da BT35 og UW479 blev føjet til kulturen, blev det observeret, at de flydende celler var til stede efter glioomcellesåning på den 21. dag, som gradvist forsvandt indtil den 23. dag og blev klæbende i enheden. Procentdelen af levedygtige celler for BT35 og UW479 var sammenlignelige og indebar, at patientafledte cellelinjer kunne anvendes korrekt. Spike detektion og raster plot på den 23. dag af kultur viste øget elektrisk aktivitet efter at have tilføjet pædiatriske høj kvalitet gliom celler.For at overvåge synkroniciteten af den neurale netværksaktivitet blev den øjeblikkelige fyringshastighed i BT35 eller glutamatergiske neuroner registreret. Forskellen i elektrisk aktivitet mellem de individuelt dyrkede og co-dyrkede glutamatrgiske neuroner var signifikant på den 23. dag. Yderligere metodologisk udvikling kan omfatte funktionel vurdering af netværket med burst analyse og særlige tidsmæssige krydskorrelationer af netværket.Nu, forskere har et lovende værktøj til at udforske interaktioner og farmakologisk målretning af pædiatriske høj kvalitet gliom tumor linjer og høje PSC neuroner. Flere tumor linjer og flere neuron typer kan anvendes.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantation af zebrafisk-pædiatriske hjernetumorer til immunkompetente værter til langvarig undersøgelse af tumorcelleradfærd og lægemiddelrespons

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattende protokol til prøven og proces knoglemarven til at måle målbare Residual sygdom og Leukemic stamceller i akut Myeloid leukæmi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymale stamceller isoleret fra Pulp væv og fælles kultur med kræftceller til at studere deres interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Evaluering af biomarkører i gliom af Immunhistokemi på Paraffin-Embedded 3D gliom Neurosphere kulturer

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Måling Bone Remodeling og genskabe Tumor-Bone Microenvironment Brug Calvaria Co-kultur og Histomorphometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-kultur af Glioblastoma Stamceller på mønstrede neuroner til at studere migration og cellulære interaktioner

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

En hurtig screeningsarbejdsgang til identifikation af potentiel kombinationsbehandling for GBM ved hjælp af patientafledte gliomstamceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Live-3D-celle immuncytokemiske assays af pædiatrisk diffust midterliniegliom

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generering og dyrkning af højkvalitets serøs ovariecancer patientafledte organoider

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Optimering af ydeevneparametre for TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...