Name: co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Satt Conectus-programma, Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» en «Semeurs d'Etoile» verenigingen. We bedanken de kinderen en gezinnen die getroffen zijn door HGG's voor hun bijdragen aan dit onderzoek en hun steun.

Voor dit protocol is het accreditatienummer met betrekking tot het gebruik van menselijke materialen DC-2020-4203.
1. Fabricage, bereiding en behandeling van microfluïdische apparaten
<ol><li>Fabriceer SU-8 mallen met behulp van conventionele fotolithografietechnieken18. OPMERKING: Voor dit doel zijn twee fotolithografiemaskers ontworpen om twee lagen fotoresistente structuren op silicium wafersubstraat en een dunne SU-8 2005 fotoresistente laag (3,2 μm hoog en 6...

<ol>
	<li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+molecular+meta-analysis+of+1,000+pediatric+high-grade+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alex's+lemonade+stand+foundation+infant+and+childhood+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011.">Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).</li><li>Blandin, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+environment+and+paired+hierarchical+3D+and+2D+models+of+pediatric+H3.3-mutated+gliomas+recreate+the+patient+tumor+complexity.">Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity.</a> Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+communication+in+brain+cancer.">Synaptic communication in brain cancer.</a> Cancer Research. 80 (14), 2979-2982 (2020).</li><li>Mount, C. W., Yal&#231;&#305;n, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+maps+brain-wide+afferent+oligodendrocyte+precursor+cell+connectivity.">Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity.</a> eLife. 18 (8), 49291 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+astrocyte-synapse+interactions+in+CNS+disorders.">Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders.</a> Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).</li><li>Neftel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+model+of+cellular+states,+plasticity,+and+genetics+for+glioblastoma.">An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma.</a> Cell. 178 (4), 835-849 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+remodeling+of+neural+circuits+in+the+human+brain+decreases+survival.">Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signaling+between+glioblastoma+stem+cells+and+differentiated+tumor+cells+promotes+malignant+progression.">Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+activity-regulated+neuroligin-3+dependency+in+high-grade+glioma.">Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma.</a> Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+glioma+growth+through+Neuroligin-3+secretion.">Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion.</a> Cell. 161 (4), 803-816 (2015).</li><li>Buckingham, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+by+primary+brain+tumors+induces+epileptic+activity.">Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).</li><li>Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glioma+cells+induce+hyperexcitability+in+cortical+networks.">Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks.</a> Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchannel+patterning+strategies+for+in+vitro+structural+connectivity+modulation+of+neural+networks.">Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpiCoDyn:+A+toolbox+for+the+analysis+of+neuronal+network+dynamics+and+connectivity+from+multi-site+spike+signal+recordings.">SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).</li><li>Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+neurite+guidance+to+study+structure-function+relationships+in+topologically-complex+population-based+neural+networks.">Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks.</a> Scientific Reports. 6, 28384 (2016).</li><li>Nguyen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+transcriptional+and+metabolic+responses+of+pediatric+high+grade+gliomas+to+mTOR-HIF-1&#945;+axis+inhibition.">Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1&#945; axis inhibition.</a> Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Cerea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+intracellular+delivery+and+intracellular+recordings+combined+in+MEA+biosensors.">Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors.</a> Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).</li><li>Bruno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multielectrode+arrays+for+spatially+localized+drug+delivery+and+electrical+recordings+of+primary+neuronal+cultures.">Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+chamber+technology+as+building+blocks+for+a+standardized+brain+on+chip+framework.">Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).</li><li>Andreiuk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+polymer+nanoparticles+for+cell+barcoding+in+vitro+and+in+vivo.">Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo.</a> Small. 13 (38), (2017).</li></ol>

Dit werk beschrijft een nauwkeurig functioneel in vitro model om de interactie tussen menselijke hiPS-afgeleide corticale glutamaterge neuronen en hersentumorcellen in microfluïdische apparaten te evalueren. Een van de cruciale stappen in het huidige protocol was de hiPS-differentiatie in glutamaterge neuronen, die werd bevestigd door de afname van Nestin en Sox2 immunofluorescente kleuring en gelijktijdig verschijnen van mGluR2 en vGLUT1 kleuring. Niettemin bleven er weinig neurale voorlopers over omdat slecht...

Pediatrische hooggradige gliomen (pHGG) vertonen een uitgebreide genotypische en fenotypische diversiteit, afhankelijk van de leeftijd van de patiënt, tumoranatomische locatie en extensie en moleculaire drivers1. Het zijn agressieve hersentumoren die slecht onder controle zijn met de momenteel beschikbare behandelingsopties en de belangrijkste doodsoorzaak zijn in verband met hersenkanker bij kinderen en adolescenten2. Dus, meer dan 80% van de patiënten recidiveert binnen 2 jaar na hun diagnose, en hun mediane overleving is 9-15 maanden, afhankelijk van hersenlocaties en drivermutaties. De afwezigheid van curatieve behandeling is de primaire drang naar laboratoriumonderzoek en benadrukt de onmiddellijke behoefte aan nieuwe innovatieve therapeutische benaderingen. Voor dit doel werden patiënt-afgeleide cellijnen (PDCL) ontwikkeld in de hoop de pHGG-diversiteit3 te leveren in tweedimensionale (2D) lijnen en / of driedimensionale (3D) neurosferen. Toch bootsen die patiënt-afgeleide in vitro celculturen niet alle hersenvariabele situaties na. Deze modellen houden geen rekening met de macroscopische en microscopische neuro-anatomische omgevingen die doorgaans worden beschreven in pHGG.
Gewoonlijk ontwikkelt pHGG bij jongere kinderen zich voornamelijk in pontine- en thalamische regio's, terwijl HGG van adolescenten en jongvolwassenen zich concentreren in de corticale gebieden, vooral in frontotemporale kwabben1. Deze locatiespecifieke kenmerken in pediatrische leeftijden lijken verschillende omgevingen te omvatten die leiden tot gliomagenese en een ingewikkeld netwerk tussen tumorcellen en specifieke neuronale activiteit4,5,6. Hoewel mechanismen nog steeds niet zijn geïdentificeerd, ontwikkelt pHGG zich voornamelijk uit neurale voorlopercellen langs het differentiatietraject van astrogliale en oligodendrogliale afstammingslijnen. Hoewel de rol van deze gliale afstammingslijnen lange tijd beperkt is gebleven tot eenvoudige structurele ondersteuning voor neuronen, is nu duidelijk vastgesteld dat ze volledig integreren in neurale circuits en complexe bidirectionele gliale-neuronale interacties vertonen die in staat zijn om structurele gebieden van de hersenen te reorganiseren en neuronale circuits te hermodelleren4,7,8 . Bovendien wijzen toenemende flarden bewijs erop dat het centrale zenuwstelsel (CZS) een cruciale rol speelt bij het initiëren en progressie van hersenkanker. Recente werken richtten zich op neuronale activiteit, die de groei en mitose van gliale maligniteiten lijkt te stimuleren door uitgescheiden groeifactoren en directe elektrochemische synaptische communicatie6,9. Omgekeerd lijken hoogwaardige glioomcellen de neuronale functie te beïnvloeden met een toenemende glutamaterge neuronale activiteit en moduleren ze de werking van de circuits waarin ze structureel en elektrisch zijn geïntegreerd9. Dus studies met behulp van patiënt-afgeleide modellen en nieuwe neurowetenschappelijke hulpmiddelen die de werking van neuronen regelen, toonden een circuitspecifiek effect van neuronale activiteit op glioomlocatie, groei en progressie. De meeste van deze neuronale projecties die betrokken zijn bij gliomen zijn glutamaterge en communiceren via glutamaatafscheidingen. Specifieke glutamaterge biomarkers zoals mGluR2 of vGlut1/2 worden vaak beschreven6.
Interessant is dat pediatrische en volwassen hooggradige gliomen, ondanks hun moleculaire heterogeniteit, een typische proliferatieve respons vertonen op glutamaterge neuronale activiteit en andere uitgescheiden factoren zoals neuroligine-3 of BDNF (van de hersenen afgeleide neurotrofe factor)4,6,10,11,12,13 . In corticale regio's kunnen pediatrische en volwassen HGG's neuronale hyperexcitabiliteit induceren door een verhoogde glutamaatsecretie en GABA-interneuronen remmen, wat leidt tot gliomen geassocieerd met epileptische netwerkactiviteit14,15. Bovendien kunnen neurale circuits worden geremodelleerd door gliomen die specifieke neurologische taken pushen, bijvoorbeeld taal, en kunnen ze extra georganiseerde neuronale activiteit eisen9.
Op basis van deze redenering moet het bevorderen van het begrip van bidirectionele communicatie tussen glioomcellen en neuronen volledig worden opgehelderd en geïntegreerd met de vroege stadia van in vitro pHGG-benaderingen. Dergelijke innovatieve modellering is cruciaal bij het begrijpen en meten van de neuronale elektrische activiteitsimpact tijdens het testen van geneesmiddelen en het anticiperen op pHGG-respons in hersencircuits. Recente ontwikkelingen in neurowetenschappelijke hulpmiddelen, zoals microfluïdische apparaten en pHGG-onderzoekswerken, vormen het bed om nieuwe modelleringsbenaderingen te ontwikkelen en nu in staat te zijn om hersenmicro-omgeving te integreren in in vitro pHGG-modellen3,16,17,18,19. In combinatie met elektrofysiologische opnames met behulp van multi-elektrode arrays (MEA), bieden microfluïdische apparaten20,21,22 de mogelijkheid om fysiologische omstandigheden na te bootsen terwijl de elektrische activiteit van het gehele neurale netwerk wordt vastgelegd en netwerkconnectiviteitsparameters onder verschillende omstandigheden worden geëxtraheerd. Dit apparaat23,24 maakt het eerst mogelijk om cellen in een kamer direct op MEA nauwkeurig af te zetten. Deze technologie maakt de controle van celzaaidichtheid en homogeniteit op MEA en de fijne controle van media-uitwisseling mogelijk, wat een cruciale stap is voor menselijke neurale voorloperdifferentiatie rechtstreeks in apparaten. Bovendien kan de huidige depositiekamer worden bezaaid met meerdere cellen op verschillende tijdstippen.
Deze studie was dus gericht op het ontwikkelen van een functioneel in vitro model dat menselijke Pluripotente Stem (hiPS) -afgeleide corticale glutamaterge neuronen en pHGG-afgeleide cellen co-cultiveert in microfluïdische apparaten en hun elektrische activiteit registreert om elektrische interacties tussen beide celpopulaties te evalueren. Ten eerste werden hiPS-afgeleide corticale glutamaterge neuronen verkregen en gekarakteriseerd in microfluïdische apparaten in verschillende stadia van cultuur [dag 4 (D4), als hiPS-cellen, en dag 21 (D21) en dag 23 (D23), als glutamaterge gerijpte neuronen]. Voor de tweede stap van co-cultuur werden twee pHGG-modellen gebruikt: gecommercialiseerde pediatrische UW479-lijn en pHGG-cellen geïnitieerd uit een patiënttumor (BT35)3, met een H3.3 K27M-drivermutatie. Ten slotte voerden we elektrofysiologische opnames uit van glutamaterge cellen op D21 vóór pHGG-celzaaien en D23 na 48 uur co-kweek in hetzelfde microfluïdische apparaat. De interacties tussen glutamaterge neuronen en pHGG-cellen werden gekenmerkt door een significante toename van de geregistreerde elektrofysiologische activiteit.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td >MCS</td>
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >53750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >51999</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accutase</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6964</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ala -Gln (GlutaMAX)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G8541</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axel Observer 7 Microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >431007-9904-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon&#174;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >353109</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >HERASafe type KS12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Colibri 7 LED</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >4230529710-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >
			<div>Cortical Glutamatergic Neurons</div>
			</td>
			<td >BrainXell</td>
			<td >BX-0300</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31331-028</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12 Medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8437</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS 1X</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >L0615-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasYFlaskTM&#160;cell culture flasks 75cm3</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >500105</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Geltrex</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A1413201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Memmert</td>
			<td >IC0150med</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MCS InterFace Boarder</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEA2100</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P10</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729020</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P100</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P1000</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729070</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P200</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729060</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >33290</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiChannel Experimenter</td>
			<td >MCS</td>
			<td >-</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N2 Supplement-A</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >7152</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal Medium</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21103049</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurocult SM1 neuronal supplement</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >5711</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 0.1 - 10 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >030570ACL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 1 - 200 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >032260CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 50 - 1250 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >134760CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >X0557-100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >4000202/4038202</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 10 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357551</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 5 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357543</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plaque chauffante (CultureTemp)</td>
			<td >Belart</td>
			<td >370151000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6407</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primovert microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >415510-1100-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scepter (Handheld Automated Cell Counter)</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >PHCC00000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TGF-&#946;1</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >100-21C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352070</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions

Pediatrische hooggradige gliomen (pHGG) vertegenwoordigen hersenkanker bij kinderen en adolescenten die een snelle sombere prognose hebben. Omdat het nodig is om de weerstand tegen de huidige behandelingen te overwinnen en een nieuwe manier van genezen te vinden, is het zeer veeleisend om de ziekte zo dicht mogelijk in een in vitro setting te modelleren om nieuwe geneesmiddelen en therapeutische procedures te testen. Het bestuderen van hun fundamentele pathobiologische processen, waaronder glutamaterge neuron hyperexcitabiliteit, zal een echte vooruitgang zijn in het begrijpen van interacties tussen de omgevingshersenen en pHGG-cellen. Daarom, om neuronen / pHGG-celinteracties te recreëren, toont dit werk de ontwikkeling van een functioneel in vitro model dat door de mens geïnduceerde Pluripotente Stem (hiPS) -afgeleide corticale glutamaterge neuronen pHGG-cellen co-cultiveert in gecompartimenteerde microfluïdische apparaten en een proces om hun elektrofysiologische modificaties vast te leggen. De eerste stap was het differentiëren en karakteriseren van menselijke glutamaterge neuronen. Ten tweede werden de cellen gekweekt in microfluïdische apparaten met pHGG-afgeleide cellijnen. Micro-omgeving van de hersenen en neuronale activiteit werden vervolgens in dit model opgenomen om de elektrische impact van pHGG-cellen op deze micro-omgevingsneuronen te analyseren. Elektrofysiologische opnames worden met behulp van multi-elektrode arrays (MEA) gekoppeld aan deze microfluïdische apparaten om fysiologische omstandigheden na te bootsen en de elektrische activiteit van het gehele neurale netwerk vast te leggen. Een significante toename van de prikkelbaarheid van neuronen werd onderstreept in de aanwezigheid van tumorcellen.

Voordat elektrische interacties tussen glutamaterge neuronen en glioomcellen werden bestudeerd, werden hiPS-afgeleide corticale glutamaterge neuronen gekarakteriseerd om de haalbaarheid van het kweken ervan in microfluïdische apparaten te valideren (figuur 1A). Hun karakterisering werd beoordeeld met behulp van Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotrope glutamaatreceptoren 2) en vGLUT1 immunostaining, weergegeven in figuur 1A (2-7)</str...

Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Recente werken onthullen de neuronale impact op hoogwaardige pediatrische glioomcellen (pHGG) en hun wederzijdse interacties. Het huidige werk toont de ontwikkeling van een in vitro model dat pHGG-cellen en glutamaterge neuronen co-cultiveert en hun elektrofysiologische interacties registreerde om die interactiviteiten na te bootsen.

Co-cultuur van glutamaterge neuronen en pediatrische hoogwaardige glioomcellen in microfluïdische apparaten om elektrische interacties te beoordelen

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

De interacties tussen de kwaadaardige glioomcellen en hun omringende neuronen winnen aan belangstelling. Hier tonen we de ontwikkeling van een in vitro model dat afgeleide corticale glutamaterge neuronen en tumorcellen co-cultiveert. De microfludische apparaten die worden gebruikt voor coculturen gekoppeld aan multi-elektrode arrays maken de studie van verschillende celtypen mogelijk en voeren elektrische activiteitsregistraties uit op verschillende tijdstippen van de culturen.Deze methode is met name nuttig voor functionele en mechanistische studies en voor het analyseren van de effecten van farmacologische middelen die pediatrische hoogwaardige glioomcelmigratie en interactie met neuronen blokkeren. Om te beginnen met het kweken van de gecommercialiseerde menselijke IPS-afgeleide corticale glutamaterge neuronen, leegt u de inlaat- en uitlaatreservoirs van het microfluïdische apparaat door pipetpantaspiratie, waarbij alleen de apparaatkanalen met medium worden gevuld. Zaai de menselijke IPS-cellen door 10 microliter van 6,5 miljoen menselijke IPS-cellen per milliliter suspensie in het medium toe te voegen en laat het apparaat gedurende 15 minuten onder de motorkap zitten om cellen te laten hechten.Vul na 15 minuten zowel inlaat- als uitlaatreservoirs met 50 microliter van dag vier kweekmedium en breng het apparaat vervolgens over in de incubator om de cellen gedurende 23 dagen op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide te houden. Vervang het medium om de drie tot vier dagen zoals beschreven in de tekst. Om de cellen te tellen en de levensvatbaarheid te beoordelen met behulp van een standaard fasecontrastmicroscoop, maakt u microscopische foto's op de 4e dag, 21e dag en 23e dag.Kweek zowel UW479- als BT35-cellijnen in DMEM en F-12 GlutaMAX aangevuld met 10% foetaal runderserum in een celkweekkolf. Houd de celcultuur onder een gecontroleerde omgeving op 37 graden Celsius in normoxische omstandigheden gedurende het hele experiment. Observeer elke cellijn om 80% confluentie te bereiken.Op dag 21 post-cultuur van glutamaterge neuronen, start co-cultuur door trypsiniseren VAN UW479 en BT35 cellen. Zaai de trypsinized UW479- en BT35-cellen bovenop de volwassen adherente glutamaterge neuronen in elk speciaal microfluïdisch apparaat. Houd de co-culturen gedurende twee dagen onder een gecontroleerde omgeving bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide met glutamaterge neuron D11 en hoger medium.Tel pediatrische hoogwaardige glioomcellen met behulp van de microscopische foto's die zijn geanalyseerd met de beeldanalysesoftware om hun levensvatbaarheid te beoordelen en het percentage cellen te berekenen. Plaats de MFD in het opnameapparaat en gebruik een in de handel verkrijgbare software om de elektrofysiologische opname van glutamaterge neuronen op de 21e dag uit te voeren. Voordat pediatrische hoogwaardige glioomcellen worden gezaaid, voert u een tweede elektrofysiologische registratie uit van de gedifferentieerde glutamaterge neuronen die zijn gekweekt als controle parallel aan de co-cultuur.Voer nog een elektrofysiologische opname uit op de 23e dag na twee dagen van de co-cultuur. Humane IPS-afgeleide corticale glutamaterge neuronen werden gekarakteriseerd en beoordeeld met behulp van nestine, SOX2, metabotrope glutamaatreceptoren II en VGLUT1-immunostaining. Nestine is een intermediair filamenteiwit en werd tot expressie gebracht in ongedifferentieerde CZS-cellen.SOX2 werd ook tot expressie gebracht in ongedifferentieerde cellen van het neurale epitheel in het CZS. Het percentage nestine- en SOX2-positieve cellen daalde van de vierde dag tot de 21e dag, wat de gedifferentieerde toestand van glutamaterge neuronen bevestigt. De microscopische beelden onthulden een progressieve verdeling van glutamaterge neuronen over microfluïdische apparaten.Toen BT35 en UW479 aan de kweek werden toegevoegd, werd waargenomen dat de zwevende cellen aanwezig waren na glioomcelzaaien op de 21e dag, die geleidelijk verdwenen tot de 23e dag en aanhangend werden in het apparaat. De percentages levensvatbare cellen voor BT35 en UW479 waren vergelijkbaar en impliceerden dat patiënt-afgeleide cellijnen op de juiste manier konden worden gebruikt. Spikedetectie en rasterplot op de 23e dag van de kweek vertoonden verhoogde elektrische activiteit na het toevoegen van pediatrische hoogwaardige glioomcellen.Om de synchroniciteit van de neurale netwerkactiviteit te controleren, werd de momentane vuursnelheid in BT35 of glutamaterge neuronen geregistreerd. Het verschil in elektrische activiteit tussen de individueel gekweekte en gecoöpteerde glutamaterge neuronen was significant op de 23e dag. Verdere methodologische ontwikkeling kan de functionele beoordeling van het netwerk met burst-analyse en speciale temporele kruiscorrelaties van het netwerk omvatten.Nu hebben onderzoekers een veelbelovend hulpmiddel om interacties en farmacologische targeting van pediatrische hoogwaardige glioomtumorlijnen en hoge PSC-neuronen te verkennen. Verschillende tumorlijnen en verschillende neurontypen kunnen worden gebruikt.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantatie van zebravis-pediatrische hersentumoren in immuungecompetente gastheren voor langdurige studie van tumorcellen gedrag en drugrespons

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymale stamcellen isolatie uit Pulp weefsel en co cultuur met kankercellen te bestuderen van hun interacties

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Evaluatie van Biomarkers in Glioma door Immunohistochemistry op 3D Glioma paraffine-ingebedde Neurosphere culturen

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Het meten van bot remodelleren en recreëren van de Tumor-Bone Microenvironment Met behulp van Calvaria Co-cultuur en Histomorphometrie

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-cultuur van Glioblastoom Stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Een snelle screeningsworkflow om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide glioomstamcellen

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Live-3D-cel immunocytochemie Assays van pediatrische diffuse middellijn glioom

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generatie en kweek van hoogwaardige sereuze eierstokkankerpatiënt-afgeleide organoïden

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Optimalisatie van prestatieparameters van de TAGGG-telomeerlengtetest

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...