Name: co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions du programme Satt Conectus, de la Fondation de l’Université de Strasbourg, des associations « J’ai demandé la lune », « Une roulade pour Charline », « LifePink », « Franck, Rayon de Soleil » et « Semeurs d’Etoile ». Nous remercions les enfants et les familles touchés par les GHG pour leur contribution à cette recherche et leur soutien.

Pour ce protocole, le numéro d’accréditation relatif à l’utilisation de matériel humain est DC-2020-4203.
1. Fabrication, préparation et traitement de dispositifs microfluidiques
<ol><li>Fabriquer des moules SU-8 en utilisant des techniques de photolithographie conventionnelles18. REMARQUE: À cette fin, deux masques de photolithographie ont été conçus pour construire deux couches de structures de résine photosensible sur un substrat de plaquette de si...

<ol>
	<li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+molecular+meta-analysis+of+1,000+pediatric+high-grade+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alex's+lemonade+stand+foundation+infant+and+childhood+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011.">Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).</li><li>Blandin, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+environment+and+paired+hierarchical+3D+and+2D+models+of+pediatric+H3.3-mutated+gliomas+recreate+the+patient+tumor+complexity.">Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity.</a> Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+communication+in+brain+cancer.">Synaptic communication in brain cancer.</a> Cancer Research. 80 (14), 2979-2982 (2020).</li><li>Mount, C. W., Yal&#231;&#305;n, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+maps+brain-wide+afferent+oligodendrocyte+precursor+cell+connectivity.">Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity.</a> eLife. 18 (8), 49291 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+astrocyte-synapse+interactions+in+CNS+disorders.">Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders.</a> Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).</li><li>Neftel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+model+of+cellular+states,+plasticity,+and+genetics+for+glioblastoma.">An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma.</a> Cell. 178 (4), 835-849 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+remodeling+of+neural+circuits+in+the+human+brain+decreases+survival.">Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signaling+between+glioblastoma+stem+cells+and+differentiated+tumor+cells+promotes+malignant+progression.">Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+activity-regulated+neuroligin-3+dependency+in+high-grade+glioma.">Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma.</a> Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+glioma+growth+through+Neuroligin-3+secretion.">Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion.</a> Cell. 161 (4), 803-816 (2015).</li><li>Buckingham, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+by+primary+brain+tumors+induces+epileptic+activity.">Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).</li><li>Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glioma+cells+induce+hyperexcitability+in+cortical+networks.">Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks.</a> Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchannel+patterning+strategies+for+in+vitro+structural+connectivity+modulation+of+neural+networks.">Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpiCoDyn:+A+toolbox+for+the+analysis+of+neuronal+network+dynamics+and+connectivity+from+multi-site+spike+signal+recordings.">SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).</li><li>Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. 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A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Cerea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+intracellular+delivery+and+intracellular+recordings+combined+in+MEA+biosensors.">Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors.</a> Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).</li><li>Bruno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multielectrode+arrays+for+spatially+localized+drug+delivery+and+electrical+recordings+of+primary+neuronal+cultures.">Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+chamber+technology+as+building+blocks+for+a+standardized+brain+on+chip+framework.">Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).</li><li>Andreiuk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+polymer+nanoparticles+for+cell+barcoding+in+vitro+and+in+vivo.">Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo.</a> Small. 13 (38), (2017).</li></ol>

Ce travail décrit un modèle fonctionnel in vitro précis pour évaluer l’interaction entre les neurones glutamatergiques corticaux dérivés de hiPS humains et les cellules tumorales cérébrales dans des dispositifs microfluidiques. L’une des étapes cruciales du présent protocole était la différenciation hiPS dans les neurones glutamatergiques, qui a été confirmée par la diminution de la coloration immunofluorescente Nestin et Sox2 et l’apparition simultanée de la coloration mGluR2 et vGLUT1. N?...

Les gliomes pédiatriques de haut grade (pHGG) présentent une diversité génotypique et phénotypique étendue en fonction de l’âge du patient, de l’emplacement et de l’extension anatomiques de la tumeur et des facteurs moléculaires1. Ce sont des tumeurs cérébrales agressives qui sont mal contrôlées avec les options de traitement actuellement disponibles et sont la principale cause de décès liés aux cancers du cerveau chez les enfants et les adolescents2. Ainsi, plus de 80% des patients rechutent dans les 2 ans suivant leur diagnostic, et leur survie médiane est de 9 à 15 mois, en fonction de l’emplacement du cerveau et des mutations du conducteur. L’absence de traitement curatif est la principale raison d’être de la recherche en laboratoire et souligne le besoin immédiat de nouvelles approches thérapeutiques innovantes. À cette fin, des lignées cellulaires dérivées de patients (PDCL) ont été développées dans l’espoir de fournir la diversité pHGG3 dans des lignées bidimensionnelles (2D) et / ou des neurosphères tridimensionnelles (3D). Néanmoins, ces cultures cellulaires in vitro dérivées de patients n’imitent pas toutes les situations de variables cérébrales. Ces modèles ne tiennent pas compte des environnements neuro-anatomiques macroscopiques et microscopiques généralement décrits dans pHGG.
Habituellement, le pHGG chez les jeunes enfants se développe principalement dans les régions pontine et thalamique, tandis que le HGG de l’adolescent et du jeune adulte se concentre dans les zones corticales, en particulier dans les lobes frontotemporaux1. Ces spécificités de localisation à travers les âges pédiatriques semblent impliquer différents environnements conduisant à la gliomagenèse et à un réseau d’intrication entre les cellules tumorales et l’activité neuronale spécifique4,5,6. Bien que les mécanismes ne soient pas encore identifiés, le pHGG se développe principalement à partir de cellules précurseurs neurales le long de la trajectoire de différenciation des lignées astrogliales et oligodendrogliales. Alors que le rôle de ces lignées gliales a longtemps été limité à un simple soutien structurel des neurones, il est maintenant clairement établi qu’elles s’intègrent entièrement dans les circuits neuronaux et présentent des interactions gliales-neuronales bidirectionnelles complexes capables de réorganiser les régions structurelles du cerveau et de remodeler les circuits neuronaux4,7,8 . De plus, de plus en plus de preuves indiquent que le système nerveux central (SNC) joue un rôle essentiel dans l’initiation et la progression du cancer du cerveau. Des travaux récents se sont concentrés sur l’activité neuronale, qui semble stimuler la croissance et la mitose des tumeurs malignes gliales par le biais de facteurs de croissance sécrétés et de communications synaptiques électrochimiques directes6,9. Réciproquement, les cellules de gliome de haut grade semblent influencer la fonction neuronale avec une activité neuronale glutamatergique croissante et moduler le fonctionnement des circuits dans lesquels elles sont structurellement et électriquement intégrées9. Ainsi, des études utilisant des modèles dérivés de patients et de nouveaux outils de neurosciences contrôlant l’action des neurones ont démontré un effet spécifique au circuit de l’activité neuronale sur la localisation, la croissance et la progression du gliome. La plupart de ces projections neuronales impliquées dans les gliomes sont glutamatergiques et communiquent par le biais des sécrétions de glutamate. Des biomarqueurs glutamatergiques spécifiques tels que mGluR2 ou vGlut1/2 sont couramment décrits6.
Fait intéressant, malgré leur hétérogénéité moléculaire, les gliomes pédiatriques et adultes de haut grade montrent une réponse proliférative typique à l’activité neuronale glutamatergique et à d’autres facteurs sécrétés tels que la neuroligine-3 ou le BDNF (facteur neurotrophique dérivé du cerveau)4,6,10,11,12,13 . Dans les régions corticales, les HHG pédiatriques et adultes peuvent induire une hyperexcitabilité neuronale par une augmentation de la sécrétion de glutamate et inhiber les interneurones GABA conduisant à des gliomes associés à l’activité du réseau épileptique14,15. En plus de cela, les circuits neuronaux peuvent être remodelés par des gliomes poussant des tâches neurologiques spécifiques, par exemple le langage, et peuvent réquisitionner une activité neuronale organisée supplémentaire9.
Sur la base de cette logique, l’avancement de la compréhension des communications bidirectionnelles entre les cellules de gliome et les neurones doit être entièrement élucidé et intégré aux premiers stades des approches pHGG in vitro. Une telle modélisation innovante est cruciale pour comprendre et mesurer l’impact de l’activité électrique neuronale lors des tests de drogue et anticiper la réponse pHGG dans les circuits cérébraux. Les développements récents dans les outils de neurosciences, tels que les dispositifs microfluidiques et les travaux de recherche pHGG, sont le lit pour développer de nouvelles approches de modélisation et être maintenant en mesure d’intégrer le microenvironnement cérébral dans des modèles pHGG in vitro3,16,17,18,19. Couplés à des enregistrements électrophysiologiques utilisant des réseaux multiélectrodes (MEA), les dispositifs microfluidiques20,21,22 offrent la possibilité d’imiter les conditions physiologiques tout en enregistrant l’activité électrique de l’ensemble du réseau neuronal et d’extraire les paramètres de connectivité réseau dans plusieurs conditions. Ce dispositif23,24 permet d’abord le dépôt précis de cellules dans une chambre directement sur MEA. Cette technologie permet le contrôle de la densité et de l’homogénéité de l’ensemencement cellulaire sur MEA et le contrôle fin de l’échange de milieux, ce qui est une étape critique pour la différenciation des progéniteurs neuronaux humains directement dans les dispositifs. De plus, la chambre de dépôt actuelle peut être ensemencée avec plusieurs cellules à différents moments.
Ainsi, cette étude visait à développer un modèle fonctionnel in vitro co-cultivant des neurones glutamatergiques corticaux dérivés de la tige pluripotente humaine (hiPS) et des cellules dérivées de pHGG dans des dispositifs microfluidiques et enregistrant leur activité électrique pour évaluer les interactions électriques entre les deux populations cellulaires. Tout d’abord, des neurones glutamatergiques corticaux dérivés de hiPS ont été obtenus et caractérisés dans des dispositifs microfluidiques à différents stades de culture [jour 4 (D4), en tant que cellules hiPS, et jour 21 (D21) et jour 23 (D23), en tant que neurones matures glutamatergiques]. Pour la deuxième étape de la co-culture, deux modèles pHGG ont été utilisés : la lignée pédiatrique UW479 commercialisée et les cellules pHGG initiées à partir d’une tumeur patiente (BT35)3, porteuses d’une mutation pilote H3.3 K27M. Enfin, nous avons effectué des enregistrements électrophysiologiques de cellules glutamatergiques à D21 avant l’ensemencement des cellules pHGG et D23 après 48 h de co-culture dans le même dispositif microfluidique. Les interactions entre les neurones glutamatergiques et les cellules pHGG ont été caractérisées par une augmentation significative de l’activité électrophysiologique enregistrée.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td >MCS</td>
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >53750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >51999</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accutase</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6964</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ala -Gln (GlutaMAX)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G8541</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axel Observer 7 Microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >431007-9904-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon&#174;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >353109</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >HERASafe type KS12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Colibri 7 LED</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >4230529710-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >
			<div>Cortical Glutamatergic Neurons</div>
			</td>
			<td >BrainXell</td>
			<td >BX-0300</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31331-028</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12 Medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8437</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS 1X</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >L0615-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasYFlaskTM&#160;cell culture flasks 75cm3</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >500105</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Geltrex</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A1413201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Memmert</td>
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			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MCS InterFace Boarder</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEA2100</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P10</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729020</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P100</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P1000</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729070</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P200</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729060</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >33290</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiChannel Experimenter</td>
			<td >MCS</td>
			<td >-</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N2 Supplement-A</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >7152</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal Medium</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21103049</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurocult SM1 neuronal supplement</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >5711</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 0.1 - 10 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >030570ACL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 1 - 200 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >032260CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 50 - 1250 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >134760CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >X0557-100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >4000202/4038202</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 10 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357551</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 5 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357543</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plaque chauffante (CultureTemp)</td>
			<td >Belart</td>
			<td >370151000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6407</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primovert microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >415510-1100-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scepter (Handheld Automated Cell Counter)</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >PHCC00000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TGF-&#946;1</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >100-21C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352070</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions

Les gliomes pédiatriques de haut grade (pHGG) représentent des cancers du cerveau chez l’enfant et l’adolescent qui entraînent un pronostic lugubre rapide. Puisqu’il est nécessaire de surmonter la résistance aux traitements actuels et de trouver une nouvelle façon de guérir, modéliser la maladie aussi près que possible dans un cadre in vitro pour tester de nouveaux médicaments et procédures thérapeutiques est très exigeant. L’étude de leurs processus pathobiologiques fondamentaux, y compris l’hyperexcitabilité des neurones glutamatergiques, constituera une véritable avancée dans la compréhension des interactions entre le cerveau environnemental et les cellules pHGG. Par conséquent, pour recréer les interactions neurones/cellules pHGG, ce travail montre le développement d’un modèle in vitro fonctionnel co-cultivant des neurones corticaux glutamatergiques dérivés de la tige pluripotente induite par l’homme (hiPS) dans des cellules pHGG corticales en dispositifs microfluidiques compartimentés et un processus pour enregistrer leurs modifications électrophysiologiques. La première étape consistait à différencier et à caractériser les neurones glutamatergiques humains. Deuxièmement, les cellules ont été cultivées dans des dispositifs microfluidiques avec des lignées cellulaires dérivées de pHGG. Le microenvironnement cérébral et l’activité neuronale ont ensuite été inclus dans ce modèle pour analyser l’impact électrique des cellules pHGG sur ces neurones micro-environnementaux. Les enregistrements électrophysiologiques sont couplés à l’aide de réseaux multiélectrodes (MEA) à ces dispositifs microfluidiques pour imiter les conditions physiologiques et enregistrer l’activité électrique de l’ensemble du réseau neuronal. Une augmentation significative de l’excitabilité des neurones a été soulignée en présence de cellules tumorales.

Avant d’étudier les interactions électriques entre les neurones glutamatergiques et les cellules de gliome, les neurones glutamatergiques corticaux dérivés de hiPS ont été caractérisés pour valider la faisabilité de leur culture dans des dispositifs microfluidiques (Figure 1A). Leur caractérisation a été évaluée à l’aide de Nestin, Sox2, mGlurR2 (récepteurs métabotropes du glutamate 2) et de l’immunocoloration vGLUT1, représentés à <strong c...

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Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Des travaux récents révèlent l’impact neuronal sur les cellules de gliome pédiatrique de haut grade (pHGG) et leurs interactions réciproques. Les présents travaux montrent le développement d’un modèle in vitro co-cultivant des cellules pHGG et des neurones glutamatergiques et ont enregistré leurs interactions électrophysiologiques pour imiter ces interactivités.

Co-culture de neurones glutamatergiques et de cellules de gliome pédiatrique de haut grade dans des dispositifs microfluidiques pour évaluer les interactions électriques

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Les interactions entre les cellules de gliome malin et leurs neurones environnants suscitent de plus en plus d’intérêt. Ici, nous montrons le développement d’un modèle in vitro co-cultivant des neurones glutamatergiques corticaux dérivés et des cellules tumorales. Les dispositifs microfludiques utilisés pour les co-cultures couplées à des réseaux multiélectrodes permettent d’étudier différents types de cellules et d’effectuer des enregistrements d’activité électrique à différents points temporels des cultures.Cette méthode est particulièrement utile pour les études fonctionnelles et mécanistes et pour analyser les effets des agents pharmacologiques qui bloquent la migration des cellules de gliome pédiatrique de haut grade et l’interaction avec les neurones. Pour commencer à cultiver les neurones glutamatergiques corticaux humains commercialisés dérivés de l’IPS, videz les réservoirs d’entrée et de sortie du dispositif microfluidique par aspiration de pipette, en laissant seuls les canaux de l’appareil être remplis de milieu. Ensemencez les cellules IPS humaines en ajoutant 10 microlitres de 6,5 millions de cellules IPS humaines par suspension millilitre dans le milieu et laissez l’appareil être sous le capot pendant 15 minutes pour permettre aux cellules de se fixer.Après 15 minutes, remplissez les réservoirs d’entrée et de sortie avec 50 microlitres de milieu de culture du quatrième jour, puis transférez l’appareil dans l’incubateur pour maintenir les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 23 jours. Remplacez le support tous les trois à quatre jours comme décrit dans le texte. Pour compter les cellules et évaluer la viabilité à l’aide d’un microscope à contraste de phase standard, prenez des photos microscopiques au 4e jour, au 21e jour et au 23e jour.Cultiver les lignées cellulaires UW479 et BT35 dans du DMEM et du F-12 GlutaMAX complété par du sérum bovin fœtal à 10% dans une fiole de culture cellulaire. Maintenir la culture cellulaire dans un environnement contrôlé à 37 degrés Celsius dans des conditions normoxiques tout au long de l’expérience. Observez chaque lignée cellulaire pour atteindre 80% de confluence.Le jour 21 de la post-culture de neurones glutamatergiques, commencez la co-culture en trypsinisant les cellules UW479 et BT35. Ensemencez les cellules TRYPSINISÉES UW479 et BT35 sur les neurones glutamatergiques adhérents matures dans chaque dispositif microfluidique dédié. Maintenir les co-cultures pendant deux jours dans un environnement contrôlé à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec le neurone glutamatergique D11 et le milieu ultérieur.Compter les cellules de gliome pédiatrique de haut grade à l’aide des images microscopiques analysées avec le logiciel d’analyse d’images pour évaluer leur viabilité et calculer le pourcentage de cellules. Placez le MFD dans l’appareil d’enregistrement et utilisez un logiciel disponible dans le commerce pour effectuer l’enregistrement électrophysiologique des neurones glutamatergiques le 21ème jour. Avant d’ensemencer des cellules de gliome pédiatrique de haut grade, effectuez un deuxième enregistrement électrophysiologique des neurones glutamatergiques différenciés cultivés comme témoin parallèlement à la co-culture.Effectuer un autre enregistrement électrophysiologique le 23ème jour après deux jours de co-culture. Les neurones glutamatergiques corticaux humains dérivés de l’IPS ont été caractérisés et évalués à l’aide de nestin, SOX2, des récepteurs métabotropiques du glutamate II et de l’immunocoloration VGLUT1. Nestin est une protéine de filament intermédiaire et elle a été exprimée dans des cellules indifférenciées du SNC.SOX2 a également été exprimé dans des cellules indifférenciées de l’épithélium neural dans le SNC. Le pourcentage de cellules nestines et SOX2 positives a diminué du quatrième jour au 21e jour, confirmant l’état différencié des neurones glutamatergiques. Les images microscopiques ont révélé une distribution progressive des neurones glutamatergiques à travers les dispositifs microfluidiques.Lorsque BT35 et UW479 ont été ajoutés à la culture, il a été observé que les cellules flottantes étaient présentes après l’ensemencement des cellules de gliome le 21ème jour, qui ont progressivement disparu jusqu’au 23ème jour et sont devenues adhérentes dans l’appareil. Les pourcentages de cellules viables pour BT35 et UW479 étaient comparables et impliquaient que les lignées cellulaires dérivées de patients pouvaient être utilisées de manière appropriée. La détection de pics et le tracé raster au 23e jour de culture ont montré une activité électrique accrue après l’ajout de cellules de gliome pédiatrique de haut grade.Pour surveiller la synchronicité de l’activité du réseau neuronal, la vitesse de déclenchement instantanée dans les neurones BT35 ou glutamatergiques a été enregistrée. La différence d’activité électrique entre les neurones glutamatergiques cultivés individuellement et co-cultivés était significative le 23ème jour. D’autres développements méthodologiques peuvent inclure l’évaluation fonctionnelle du réseau avec une analyse en rafale et des corrélations temporelles temporelles spéciales du réseau.Maintenant, les chercheurs ont un outil prometteur pour explorer les interactions et le ciblage pharmacologique des lignées tumorales de gliome pédiatrique de haut grade et des neurones à PSC élevé. Plusieurs lignes tumorales et plusieurs types de neurones peuvent être utilisés.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantation de tumeurs cérébrales pédiatriques de poisson zèbre dans des hôtes immunisés pour une étude à long terme du comportement des cellules tumorales et de la réponse aux médicaments

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Protocole complet d’échantillon et de la moelle osseuse processus pour mesurer la maladie résiduelle mesurable et des cellules souches leucémiques dans la leucémie myéloïde aiguë

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu de pulpe et co-culture avec les cellules cancéreuses afin d’étudier leurs Interactions

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Évaluation de biomarqueurs dans les gliomes par immunohistochimie sur la paraffine 3D gliome Neurosphère Cultures

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Mesurer le remodelage et la recréation du microenvironnement tumoral-os à l’aide de la co-culture Calvaria et de l’histomorphométrie

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-culture de cellules souches de glioblastome sur des neurones à motifs pour étudier la migration et les interactions cellulaires

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flux de travail de dépistage rapide pour identifier la thérapie combinée potentielle pour le GBM à l’aide de cellules souches de gliome dérivées du patient

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Tests d’immunocytochimie sur cellules 3D vivantes du gliome médian diffus pédiatrique

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Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Génération et culture d’organoïdes dérivés de patients atteints d’un cancer de l’ovaire séreux de haut grade

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Optimisation des paramètres de performance du test de longueur des télomères TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...