Name: co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Satt Conectus-Programms, der Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» und «Semeurs d'Etoile» unterstützt. Wir danken den von HGGs betroffenen Kindern und Familien für ihre Beiträge zu dieser Forschung und ihre Unterstützung.

Für dieses Protokoll lautet die Akkreditierungsnummer für die Verwendung menschlicher Materialien DC-2020-4203.
1. Herstellung, Herstellung und Behandlung mikrofluidischer Geräte
<ol><li>Herstellung von SU-8-Formen mit herkömmlichen Photolithographietechniken18. HINWEIS: Zu diesem Zweck wurden zwei Photolithographiemasken entwickelt, um zwei Schichten von Fotolackstrukturen auf Siliziumwafersubstrat und eine dünne SU-8 2005-Fotolackschicht (3,2 μm hoch und 6 ...

<ol>
	<li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+molecular+meta-analysis+of+1,000+pediatric+high-grade+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alex's+lemonade+stand+foundation+infant+and+childhood+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011.">Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).</li><li>Blandin, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+environment+and+paired+hierarchical+3D+and+2D+models+of+pediatric+H3.3-mutated+gliomas+recreate+the+patient+tumor+complexity.">Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity.</a> Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+communication+in+brain+cancer.">Synaptic communication in brain cancer.</a> Cancer Research. 80 (14), 2979-2982 (2020).</li><li>Mount, C. W., Yal&#231;&#305;n, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+maps+brain-wide+afferent+oligodendrocyte+precursor+cell+connectivity.">Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity.</a> eLife. 18 (8), 49291 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+astrocyte-synapse+interactions+in+CNS+disorders.">Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders.</a> Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).</li><li>Neftel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+model+of+cellular+states,+plasticity,+and+genetics+for+glioblastoma.">An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma.</a> Cell. 178 (4), 835-849 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+remodeling+of+neural+circuits+in+the+human+brain+decreases+survival.">Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signaling+between+glioblastoma+stem+cells+and+differentiated+tumor+cells+promotes+malignant+progression.">Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+activity-regulated+neuroligin-3+dependency+in+high-grade+glioma.">Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma.</a> Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+glioma+growth+through+Neuroligin-3+secretion.">Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion.</a> Cell. 161 (4), 803-816 (2015).</li><li>Buckingham, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+by+primary+brain+tumors+induces+epileptic+activity.">Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).</li><li>Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glioma+cells+induce+hyperexcitability+in+cortical+networks.">Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks.</a> Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchannel+patterning+strategies+for+in+vitro+structural+connectivity+modulation+of+neural+networks.">Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpiCoDyn:+A+toolbox+for+the+analysis+of+neuronal+network+dynamics+and+connectivity+from+multi-site+spike+signal+recordings.">SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).</li><li>Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+neurite+guidance+to+study+structure-function+relationships+in+topologically-complex+population-based+neural+networks.">Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks.</a> Scientific Reports. 6, 28384 (2016).</li><li>Nguyen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+transcriptional+and+metabolic+responses+of+pediatric+high+grade+gliomas+to+mTOR-HIF-1&#945;+axis+inhibition.">Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1&#945; axis inhibition.</a> Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Cerea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+intracellular+delivery+and+intracellular+recordings+combined+in+MEA+biosensors.">Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors.</a> Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).</li><li>Bruno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multielectrode+arrays+for+spatially+localized+drug+delivery+and+electrical+recordings+of+primary+neuronal+cultures.">Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+chamber+technology+as+building+blocks+for+a+standardized+brain+on+chip+framework.">Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).</li><li>Andreiuk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+polymer+nanoparticles+for+cell+barcoding+in+vitro+and+in+vivo.">Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo.</a> Small. 13 (38), (2017).</li></ol>

Diese Arbeit beschreibt ein genaues funktionelles In-vitro-Modell zur Bewertung der Interaktion zwischen humanen hiPS-abgeleiteten kortikalen glutamatergen Neuronen und Hirntumorzellen in mikrofluidischen Geräten. Einer der entscheidenden Schritte im vorliegenden Protokoll war die hiPS-Differenzierung in glutamatergen Neuronen, die durch die Abnahme der Nestin- und Sox2-Immunfluoreszenzfärbung und das gleichzeitige Auftreten von mGluR2- und vGLUT1-Färbung bestätigt wurde. Dennoch blieben nur wenige neuronale...

Pädiatrische hochgradige Gliome (pHGG) weisen eine erweiterte genotypische und phänotypische Vielfalt auf, abhängig vom Alter des Patienten, der anatomischen Lage und Erweiterung des Tumors sowie den molekularen Treibern1. Es handelt sich um aggressive Hirntumore, die mit den derzeit verfügbaren Behandlungsmöglichkeiten schlecht kontrolliert werden und die häufigste Todesursache im Zusammenhang mit Hirntumoren bei Kindern und Jugendlichen sind2. So erleiden mehr als 80% der Patienten innerhalb von 2 Jahren nach ihrer Diagnose einen Rückfall, und ihr medianes Überleben beträgt 9-15 Monate, abhängig von Gehirnstandorten und Treibermutationen. Das Fehlen einer kurativen Behandlung ist der primäre Drang zur Laborforschung und unterstreicht den unmittelbaren Bedarf an neuen innovativen Therapieansätzen. Zu diesem Zweck wurden patientenabgeleitete Zelllinien (PDCL) mit der Hoffnung entwickelt, die pHGG-Diversität3 in zweidimensionalen (2D) Linien und/oder dreidimensionalen (3D) Neurosphären bereitzustellen. Dennoch ahmen diese von Patienten abgeleiteten In-vitro-Zellkulturen nicht alle variablen Situationen des Gehirns nach. Diese Modelle berücksichtigen nicht die makroskopischen und mikroskopischen neuroanatomischen Umgebungen, die typischerweise in pHGG beschrieben werden.
Normalerweise entwickelt sich pHGG bei jüngeren Kindern hauptsächlich in pontinen und thalamischen Regionen, während sich das HGG von Jugendlichen und jungen Erwachsenen in den kortikalen Bereichen konzentriert, insbesondere in frontotemporalen Lappen1. Diese Standortspezifitäten im pädiatrischen Alter scheinen verschiedene Umgebungen zu umfassen, die zu Gliomagenese und einem sich verbindenden Netzwerk zwischen Tumorzellen und spezifischer neuronaler Aktivität führen4,5,6. Obwohl Mechanismen noch nicht identifiziert sind, entwickelt sich pHGG hauptsächlich aus neuronalen Vorläuferzellen entlang der Differenzierungsbahn von astroglialen und oligodendroglialen Linien. Während die Rolle dieser Glialinien lange Zeit auf einfache strukturelle Unterstützung für Neuronen beschränkt war, ist es jetzt klar erwiesen, dass sie sich vollständig in neuronale Schaltkreise integrieren und komplexe bidirektionale glia-neuronale Interaktionen aufweisen, die in der Lage sind, strukturelle Regionen des Gehirns zu reorganisieren und neuronale Schaltkreise umzugestalten4,7,8 . Darüber hinaus deuten zunehmende Fetzen von Beweisen darauf hin, dass das zentrale Nervensystem (ZNS) eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und progression von Hirntumoren spielt. Jüngste Arbeiten konzentrierten sich auf neuronale Aktivität, die das Wachstum und die Mitose von glialen Malignomen durch sezernierte Wachstumsfaktoren und direkte elektrochemische synaptische Kommunikation anzutreiben scheint6,9. Reziprok umgekehrt scheinen hochgradige Gliomzellen die neuronale Funktion mit zunehmender glutamaterger neuronaler Aktivität zu beeinflussen und modulieren den Betrieb der Schaltkreise, in die sie strukturell und elektrisch integriert sind9. Studien, die von Patienten abgeleitete Modelle und neuartige neurowissenschaftliche Werkzeuge zur Kontrolle der Neuronenwirkung verwendeten, zeigten eine schaltkreisspezifische Wirkung der neuronalen Aktivität auf die Lage, das Wachstum und die Progression von Gliomen. Die meisten dieser neuronalen Projektionen, die an Gliomen beteiligt sind, sind glutamaterg und kommunizieren über Glutamatsekretionen. Spezifische glutamaterge Biomarker wie mGluR2 oder vGlut1/2 werden häufig beschrieben6.
Interessanterweise zeigen pädiatrische und adulte hochgradige Gliome trotz ihrer molekularen Heterogenität eine typische proliferative Reaktion auf glutamaterge neuronale Aktivität und andere sezernierte Faktoren wie Neuroligin-3 oder BDNF (brain-derived neurotrophic factor)4,6,10,11,12,13 . In kortikalen Regionen können pädiatrische und erwachsene HGGs durch eine erhöhte Glutamatsekretion neuronale Übererregbarkeit induzieren und GABA-Interneuronen hemmen, was zu Gliomen führt, die mit epileptischer Netzwerkaktivität assoziiert sind14,15. Darüber hinaus können neuronale Schaltkreise durch Gliome, die bestimmte neurologische Aufgaben, z. B. Sprache, vorantreiben, umgestaltet werden und zusätzliche organisierte neuronale Aktivitäten erfordern9.
Basierend auf dieser Begründung muss das Verständnis der bidirektionalen Kommunikation zwischen Gliomzellen und Neuronen vollständig aufgeklärt und in die frühen Stadien der In-vitro-pHGG-Ansätze integriert werden. Eine solche innovative Modellierung ist entscheidend für das Verständnis und die Messung der Auswirkungen der neuronalen elektrischen Aktivität während des Drogentests und die Antizipation der pHGG-Reaktion in die Schaltkreise des Gehirns. Jüngste Entwicklungen in neurowissenschaftlichen Werkzeugen, wie mikrofluidische Geräte und pHGG-Forschungsarbeiten, sind das Fundament, um neue Modellierungsansätze zu entwickeln und nun in der Lage zu sein, die Mikroumgebung des Gehirns in In-vitro-pHGG-Modelle zu integrieren3,16,17,18,19. Gekoppelt mit elektrophysiologischen Aufzeichnungen unter Verwendung von Multielektrodenarrays (MEA) bieten mikrofluidische Bauelemente20,21,22 die Möglichkeit, physiologische Bedingungen nachzuahmen, während die elektrische Aktivität des gesamten neuronalen Netzwerks aufgezeichnet und Netzwerkkonnektivitätsparameter unter verschiedenen Bedingungen extrahiert werden. Dieses Gerät23,24 ermöglicht zunächst die präzise Abscheidung von Zellen in einer Kammer direkt auf MEA. Diese Technologie ermöglicht die Kontrolle der Zellsaatdichte und -homogenität auf MEA und die Feinsteuerung des Medienaustauschs, was ein kritischer Schritt für die Differenzierung des menschlichen neuronalen Vorläufers direkt in Geräte ist. Darüber hinaus kann die vorliegende Abscheidungskammer mit mehreren Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten ausgesät werden.
Daher zielte diese Studie darauf ab, ein funktionelles In-vitro-Modell zu entwickeln, das menschliche pluripotente Stamm (hiPS) -abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen und pHGG-abgeleitete Zellen in mikrofluidische Geräte kokulturiert und ihre elektrische Aktivität aufzeichnet, um elektrische Wechselwirkungen zwischen beiden Zellpopulationen zu bewerten. Zuerst wurden hiPS-abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen in mikrofluidischen Geräten in verschiedenen Stadien der Kultur [Tag 4 (D4) als hiPS-Zellen und Tag 21 (D21) und Tag 23 (D23) als glutamaterge gereifte Neuronen] erhalten und charakterisiert. Für den zweiten Schritt der Kokultur wurden zwei pHGG-Modelle verwendet: kommerzialisierte pädiatrische UW479-Linie und pHGG-Zellen, die von einem Patiententumor (BT35)3 initiiert wurden, der eine H3.3 K27M-Treibermutation trug. Schließlich führten wir elektrophysiologische Aufnahmen von glutamatergen Zellen bei D21 vor der pHGG-Zellaussaat und D23 nach 48 h Kokultur in dasselbe mikrofluidische Gerät durch. Die Wechselwirkungen zwischen glutamatergen Neuronen und pHGG-Zellen waren durch einen signifikanten Anstieg der aufgezeichneten elektrophysiologischen Aktivität gekennzeichnet.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td >MCS</td>
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >53750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >51999</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accutase</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6964</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ala -Gln (GlutaMAX)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G8541</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axel Observer 7 Microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >431007-9904-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon&#174;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >353109</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >HERASafe type KS12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Colibri 7 LED</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >4230529710-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >
			<div>Cortical Glutamatergic Neurons</div>
			</td>
			<td >BrainXell</td>
			<td >BX-0300</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31331-028</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12 Medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8437</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS 1X</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >L0615-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasYFlaskTM&#160;cell culture flasks 75cm3</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >500105</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Geltrex</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A1413201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Memmert</td>
			<td >IC0150med</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MCS InterFace Boarder</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEA2100</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P10</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729020</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P100</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P1000</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729070</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P200</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729060</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >33290</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiChannel Experimenter</td>
			<td >MCS</td>
			<td >-</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N2 Supplement-A</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >7152</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal Medium</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21103049</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurocult SM1 neuronal supplement</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >5711</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 0.1 - 10 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >030570ACL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 1 - 200 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >032260CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 50 - 1250 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >134760CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >X0557-100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >4000202/4038202</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 10 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357551</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 5 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357543</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plaque chauffante (CultureTemp)</td>
			<td >Belart</td>
			<td >370151000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6407</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primovert microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >415510-1100-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scepter (Handheld Automated Cell Counter)</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >PHCC00000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TGF-&#946;1</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >100-21C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352070</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions

Pädiatrische hochgradige Gliome (pHGG) repräsentieren Hirntumore im Kindes- und Jugendalter, die eine schnelle düstere Prognose haben. Da es notwendig ist, die Resistenz gegen aktuelle Behandlungen zu überwinden und einen neuen Weg der Heilung zu finden, ist es sehr anspruchsvoll, die Krankheit in einem In-vitro-Setting so nah wie möglich zu modellieren, um neue Medikamente und therapeutische Verfahren zu testen. Die Untersuchung ihrer grundlegenden pathologischen Prozesse, einschließlich der Übererregbarkeit von glutamatergen Neuronen, wird ein echter Fortschritt beim Verständnis der Wechselwirkungen zwischen dem Umweltgehirn und den pHGG-Zellen sein. Um Neuronen/ pHGG-Zellinteraktionen nachzubilden, zeigt diese Arbeit die Entwicklung eines funktionellen In-vitro-Modells , das human-induzierte pluripotente Stamm (hiPS) -abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen pHGG-Zellen in kompartimentierte mikrofluidische Geräte und einen Prozess zur Aufzeichnung ihrer elektrophysiologischen Modifikationen kokulturiert. Der erste Schritt bestand darin, menschliche glutamaterge Neuronen zu differenzieren und zu charakterisieren. Zweitens wurden die Zellen in mikrofluidischen Geräten mit pHGG-abgeleiteten Zelllinien kultiviert. Die Mikroumgebung des Gehirns und die neuronale Aktivität wurden dann in dieses Modell einbezogen, um die elektrischen Auswirkungen von pHGG-Zellen auf diese Mikroumgebungsneuronen zu analysieren. Elektrophysiologische Aufzeichnungen werden unter Verwendung von Multielektrodenarrays (MEA) an diese mikrofluidischen Geräte gekoppelt, um physiologische Bedingungen nachzuahmen und die elektrische Aktivität des gesamten neuronalen Netzwerks aufzuzeichnen. Eine signifikante Erhöhung der Neuronenerregbarkeit wurde in Gegenwart von Tumorzellen unterstrichen.

Vor der Untersuchung elektrischer Wechselwirkungen zwischen glutamatergen Neuronen und Gliomzellen wurden hiPS-abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen charakterisiert, um die Machbarkeit ihrer Kultivierung in mikrofluidischen Geräten zu validieren (Abbildung 1A). Ihre Charakterisierung wurde unter Verwendung von Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotrope Glutamatrezeptoren 2) und vGLUT1-Immunostaining, dargestellt in Abbildung 1A(2-...

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Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Neuere Arbeiten decken die neuronalen Auswirkungen auf hochgradige pädiatrische Gliomzellen (pHGG) und ihre wechselseitigen Interaktionen auf. Die vorliegende Arbeit zeigt die Entwicklung eines In-vitro-Modells , das pHGG-Zellen und glutamaterge Neuronen kokulturiert und ihre elektrophysiologischen Interaktionen aufzeichnet, um diese Wechselwirkungen nachzuahmen.

Kokultur von glutamatergen Neuronen und pädiatrischen hochgradigen Gliomzellen in mikrofluidische Geräte zur Beurteilung elektrischer Wechselwirkungen

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Die Wechselwirkungen zwischen den bösartigen Gliomzellen und ihren umgebenden Neuronen gewinnen an Interesse. Hier zeigen wir die Entwicklung eines In-vitro-Modells, das abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen und Tumorzellen kokulturiert. Die mikrofludischen Geräte, die für Co-Kulturen verwendet werden, die an Multielektrodenarrays gekoppelt sind, ermöglichen die Untersuchung verschiedener Zelltypen und die Durchführung elektrischer Aktivitätsaufzeichnungen zu verschiedenen Zeitpunkten der Kulturen.Diese Methode ist besonders hilfreich für funktionelle und mechanistische Studien und für die Analyse der Wirkungen pharmakologischer Wirkstoffe, die die pädiatrische Migration hochgradiger Gliomzellen und die Interaktion mit Neuronen blockieren. Um mit der Kultivierung der kommerzialisierten menschlichen IPS-abgeleiteten kortikalen glutamatergen Neuronen zu beginnen, leeren Sie die Ein- und Austrittsreservoirs des mikrofluidischen Geräts durch Pipettenaspiration und lassen Sie nur die Gerätekanäle mit Medium füllen. Säen Sie die menschlichen IPS-Zellen, indem Sie 10 Mikroliter von 6,5 Millionen menschlichen IPS-Zellen pro Milliliter-Suspension in das Medium geben und das Gerät für 15 Minuten unter der Haube lassen, damit sich die Zellen anheften können.Füllen Sie nach 15 Minuten sowohl die Einlass- als auch die Auslassbehälter mit 50 Mikrolitern des Kulturmediums des vierten Tages und geben Sie das Gerät dann in den Inkubator, um die Zellen 23 Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zu halten. Ersetzen Sie das Medium alle drei bis vier Tage, wie im Text beschrieben. Um die Zellen zu zählen und die Lebensfähigkeit mit einem Standard-Phasenkontrastmikroskop zu beurteilen, machen Sie mikroskopische Bilder am 4., 21. Tag und 23. Tag.Kultur sowohl UW479- als auch BT35-Zelllinien in DMEM und F-12 GlutaMAX, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum in einem Zellkulturkolben. Halten Sie die Zellkultur während des gesamten Experiments unter einer kontrollierten Umgebung bei 37 Grad Celsius unter normoxischen Bedingungen aufrecht. Beobachten Sie jede Zelllinie, um eine Konfluenz von 80% zu erreichen.Beginnen Sie am Tag 21 nach der Kultur von glutamatergen Neuronen mit der Co-Kultur, indem Sie UW479- und BT35-Zellen trypsinisieren. Säen Sie die trypsinisierten UW479- und BT35-Zellen auf die reifen adhärenten glutamatergen Neuronen in jedes dedizierte mikrofluidische Gerät. Halten Sie die Co-Kulturen für zwei Tage unter einer kontrollierten Umgebung bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit glutamaterge Neuron D11 und höherem Medium.Zählen Sie pädiatrische hochgradige Gliomzellen anhand der mit der Bildanalysesoftware analysierten mikroskopischen Bilder, um ihre Lebensfähigkeit zu beurteilen und den Prozentsatz der Zellen zu berechnen. Platzieren Sie das MFD im Aufnahmegerät und verwenden Sie eine handelsübliche Software, um die elektrophysiologische Aufzeichnung von glutamatergen Neuronen am 21. Tag durchzuführen. Bevor Sie pädiatrische hochgradige Gliomzellen aussäen, führen Sie eine zweite elektrophysiologische Aufzeichnung der differenzierten glutamatergen Neuronen durch, die parallel zur Kokultur als Kontrolle kultiviert wurden.Führen Sie am 23. Tag nach zwei Tagen der Kokultur eine weitere elektrophysiologische Aufnahme durch. Humane IPS-abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen wurden unter Verwendung von Nestin, SOX2, metabotropen Glutamatrezeptoren II und VGLUT1-Immunfärbung charakterisiert und bewertet. Nestin ist ein intermediäres Filamentprotein und wurde in undifferenzierten ZNS-Zellen exprimiert.SOX2 wurde auch in undifferenzierten Zellen des neuronalen Epithels im ZNS exprimiert. Der Prozentsatz der Nestin- und SOX2-positiven Zellen nahm vom vierten Tag bis zum 21. Tag ab, was den differenzierten Zustand der glutamatergen Neuronen bestätigt. Die mikroskopischen Bilder zeigten eine progressive Verteilung von glutamatergen Neuronen über mikrofluidische Geräte.Als BT35 und UW479 der Kultur hinzugefügt wurden, wurde beobachtet, dass die schwimmenden Zellen nach der Gliomzellaussaat am 21. Tag vorhanden waren, die bis zum 23. Tag progressiv verschwanden und im Gerät hafteten. Die Prozentsätze lebensfähiger Zellen für BT35 und UW479 waren vergleichbar und implizierten, dass von Patienten abgeleitete Zelllinien angemessen verwendet werden könnten. Spike-Erkennung und Raster-Plot am 23. Tag der Kultur zeigten erhöhte elektrische Aktivität nach dem Hinzufügen von pädiatrischen hochgradigen Gliomzellen.Um die Synchronizität der neuronalen Netzwerkaktivität zu überwachen, wurde die momentane Feuerrate in BT35- oder glutamatergen Neuronen aufgezeichnet. Der Unterschied in der elektrischen Aktivität zwischen den einzeln kultivierten und kokultivierten glutamatergen Neuronen war am 23. Tag signifikant. Weitere methodische Entwicklungen können die funktionelle Bewertung des Netzwerks mit Burst-Analyse und speziellen zeitlichen Querkorrelationen des Netzwerks umfassen.Jetzt haben Forscher ein vielversprechendes Werkzeug, um Interaktionen und pharmakologisches Targeting von pädiatrischen hochgradigen Gliom-Tumorlinien und hohen PSC-Neuronen zu erforschen. Mehrere Tumorlinien und mehrere Neuronentypen könnten verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantation von Zebrafisch-pädiatrischen Hirntumoren in immune-kompetente Wirte für die Langzeitstudie von Tumorzellverhalten und Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Forschung

Krebsforschung

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Umfassendes Protokoll zur Probe und Prozess des Knochenmarks zur Messung von messbaren Resterkrankung und leukämischen Stammzellen in der akuten myeloischen Leukämie

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymale Stammzellen isoliert von Pulpagewebe und Kokultur mit Krebszellen ihre Interaktionen zu untersuchen

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Bewertung von Biomarkern in Gliom von Immunohistochemistry auf Paraffin-eingebetteten 3D Gliom Neurosphäre Kulturen

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Messung der Knochenumgestaltung und Nachbildung der Tumor-Knochen-Mikroumgebung mit Calvaria-Kokultur und Histomorphometrie

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-Kultur von Glioblastom-Stammzellen auf gemusterten Neuronen zur Untersuchung von Migration und zellulären Interaktionen

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Ein schneller Screening-Workflow zur Identifizierung einer potenziellen Kombinationstherapie für GBM unter Verwendung von vom Patienten abgeleiteten Gliomstammzellen

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie-Assays des pädiatrischen diffusen Mittellinienglioms

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Erzeugung und Kultivierung von hochgradigen serösen Ovarialkarzinom-Organoiden, die von Patientinnen stammen

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Optimierung der Leistungsparameter des TAGGG Telomerlängen-Assays

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...