Name: co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוכנית Satt Conectus, Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «פרנק, רון דה סוליי» ו «Semeurs d'Etoile» עמותות. אנו מודים לילדים ולמשפחות שנפגעו מהפגנים על תרומתם למחקר זה ולתמיכתם.

עבור פרוטוקול זה, מספר ההסמכה הקשור לשימוש בחומרים אנושיים הוא DC-2020-4203.
1. ייצור, הכנה וטיפול של מכשיר מיקרופלואידי
<ol><li>פברק תבניות SU-8 בטכניקות פוטוליתוגרפיה קונבנציונליות18. הערה: למטרה זו, שתי מסכות פוטוליתוגרפיה תוכננו לבנות שתי שכבות של מבנים פוטוארסיסטי?...

<ol>
	<li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+molecular+meta-analysis+of+1,000+pediatric+high-grade+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alex's+lemonade+stand+foundation+infant+and+childhood+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011.">Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).</li><li>Blandin, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+environment+and+paired+hierarchical+3D+and+2D+models+of+pediatric+H3.3-mutated+gliomas+recreate+the+patient+tumor+complexity.">Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity.</a> Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+communication+in+brain+cancer.">Synaptic communication in brain cancer.</a> Cancer Research. 80 (14), 2979-2982 (2020).</li><li>Mount, C. W., Yal&#231;&#305;n, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+maps+brain-wide+afferent+oligodendrocyte+precursor+cell+connectivity.">Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity.</a> eLife. 18 (8), 49291 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+astrocyte-synapse+interactions+in+CNS+disorders.">Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders.</a> Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).</li><li>Neftel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+model+of+cellular+states,+plasticity,+and+genetics+for+glioblastoma.">An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma.</a> Cell. 178 (4), 835-849 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+remodeling+of+neural+circuits+in+the+human+brain+decreases+survival.">Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signaling+between+glioblastoma+stem+cells+and+differentiated+tumor+cells+promotes+malignant+progression.">Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+activity-regulated+neuroligin-3+dependency+in+high-grade+glioma.">Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma.</a> Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+glioma+growth+through+Neuroligin-3+secretion.">Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion.</a> Cell. 161 (4), 803-816 (2015).</li><li>Buckingham, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+by+primary+brain+tumors+induces+epileptic+activity.">Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).</li><li>Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glioma+cells+induce+hyperexcitability+in+cortical+networks.">Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks.</a> Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchannel+patterning+strategies+for+in+vitro+structural+connectivity+modulation+of+neural+networks.">Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpiCoDyn:+A+toolbox+for+the+analysis+of+neuronal+network+dynamics+and+connectivity+from+multi-site+spike+signal+recordings.">SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).</li><li>Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+neurite+guidance+to+study+structure-function+relationships+in+topologically-complex+population-based+neural+networks.">Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks.</a> Scientific Reports. 6, 28384 (2016).</li><li>Nguyen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+transcriptional+and+metabolic+responses+of+pediatric+high+grade+gliomas+to+mTOR-HIF-1&#945;+axis+inhibition.">Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1&#945; axis inhibition.</a> Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Cerea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+intracellular+delivery+and+intracellular+recordings+combined+in+MEA+biosensors.">Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors.</a> Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).</li><li>Bruno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multielectrode+arrays+for+spatially+localized+drug+delivery+and+electrical+recordings+of+primary+neuronal+cultures.">Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+chamber+technology+as+building+blocks+for+a+standardized+brain+on+chip+framework.">Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).</li><li>Andreiuk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+polymer+nanoparticles+for+cell+barcoding+in+vitro+and+in+vivo.">Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo.</a> Small. 13 (38), (2017).</li></ol>

עבודה זו מתארת מודל במבחנה תפקודית מדויקת כדי להעריך את האינטראקציה בין נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח נגזר hiPS אנושי ותאים סרטניים במוח במכשירים מיקרופלואידיים. אחד הצעדים המכריעים בפרוטוקול הנוכחי היה בידול hiPS נוירונים גלוטמטרגיים, אשר אושר על ידי הירידה של כתמים אימונופלואורסצ...

גליומות ילדים ברמה גבוהה (pHGG) מציגות מגוון גנוטיפי ופנוטיפי מורחב בהתאם לגיל המטופל, מיקום גידול אנטומי והרחבה, ונהגים מולקולריים1. הם גידולים אגרסיביים במוח הנשלטים בצורה גרועה עם אפשרויות הטיפול הקיימות כיום והם הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן המוח אצל ילדים ומתבגרים2. אז, יותר מ -80% מהחולים מתדרדרים בתוך 2 שנים לאחר האבחון שלהם, וההישרדות החציונית שלהם היא 9-15 חודשים, בהתאם למיקומים במוח ולמוטציות הנהג. היעדר טיפול מרפא הוא הדחף העיקרי למחקר במעבדה ומדגיש את הצורך המיידי בגישות טיפוליות חדשניות חדשות. לשם כך פותחו קווי תאים שמקורם במטופלים (PDCL) בתקווה לספק את מגוון ה-pHGG3 בקווים דו-ממדיים (דו-ממדיים) ו/או נוירוספרות תלת-ממדיות. עם זאת, תרביות תאי ההחמקה שמקורן בחולה אינן מחקות את כל מצבי משתני המוח. מודלים אלה אינם מתייחסים לסביבות הנוירו-אנטומיות המקרוסקופיות והמיקרוסקופיות המתוארות בדרך כלל ב- pHGG.
בדרך כלל, pHGG אצל ילדים צעירים מתפתח בעיקר באזורים פונטין ותלמיים, בעוד HGG של מתבגרים וצעירים להתרכז באזורים קליפת המוח, במיוחד באונה הקדמית1. נראה כי מיקומים ספציפיים אלה בגילאי ילדים כוללים סביבות שונות המובילות לגלומות ורשת מורכבת בין תאים סרטניים ופעילות עצבית ספציפית4,5,6. למרות מנגנונים עדיין לא מזוהים, pHGG מתפתח בעיקר מתאי מבשר עצבי לאורך מסלול הבידול של שושלות אסטרוגליות ואוליגודנדרוגליות. בעוד שתפקידן של שושלות גליה אלה הוגבל במשך זמן רב לתמיכה מבנית פשוטה עבור נוירונים, כעת נקבע בבירור כי הם משתלבים לחלוטין במעגלים עצביים ומציגים אינטראקציות גליה-נוירונית דו-כיווניות מורכבות המסוגלות לארגן מחדש אזורים מבניים במוח ולעצב מחדש מעגלים עצביים4,7,8 . יתר על כן, פיסות הולכות וגדלות של ראיות מצביעות על כך שמערכת העצבים המרכזית (CNS) ממלאת תפקיד קריטי בייזום והתקדמות סרטן המוח. עבודות אחרונות התמקדו בפעילות עצבית, אשר נראה להניע צמיחה ומיטוזה של ממאירות גליה באמצעות גורמי גדילה מופרשים ותקשורת סינפטית אלקטרוכימית ישירה6,9. באופן הדדי, תאי גליומה בדרגה גבוהה נראה להשפיע על תפקוד עצבי עם פעילות עצבית גלוטמטרגית גוברת לווסת את הפעולה של המעגלים שבהם הם משולבים מבנית וחשמלית9. לכן, מחקרים שהשתמשו במודלים שמקורם במטופל ובכלים חדשניים למדעי המוח השולטים בפעולה של נוירונים הדגימו השפעה ספציפית למעגל של פעילות עצבית על מיקום גליומה, צמיחה והתקדמות. רוב התחזיות העצביות המעורבות גליומות הן גלוטמטרגיות ומתקשרות באמצעות הפרשות גלוטמט. סמנים ביולוגיים גלוטמטריים ספציפיים כגון mGluR2 או vGlut1/2 מתוארים בדרך כלל6.
מעניין, למרות ההטרוגניות המולקולרית שלהם, גליומות ילדים ומבוגרים בדרגה גבוהה מראות תגובה נפוצה טיפוסית לפעילות עצבית גלוטמטרגית וגורמים מופרשים אחרים כגון נוירוליגין-3 או BDNF (גורם נוירוטרופי המופק מהמוח)4,6,10,11,12,13 . באזורים קליפת המוח, HGGs ילדים ומבוגרים יכול לגרום hyperexcitability עצבית באמצעות הפרשת גלוטמט מוגברת לעכב אינטראורונים גאבא המוביל gliomas הקשורים לפעילות רשת אפילפטית14,15. נוסף על כך, מעגלים עצביים יכולים להיות משופצים על ידי gliomas דוחף משימות נוירולוגיות ספציפיות, למשל, שפה, והוא יכול לפקיע פעילות עצבית מאורגנת נוספת9.
בהתבסס על רציונל זה, קידום ההבנה של תקשורת דו-כיוונית בין תאי גליומה נוירונים חייב להיות מואר לחלוטין בשילוב עם השלבים המוקדמים של גישות pHGG במבחנה. מידול חדשני כזה חיוני להבנת ומדידת השפעת הפעילות החשמלית העצבית במהלך בדיקות סמים וחיזוי תגובת pHGG למעגלים מוחיים. ההתפתחויות האחרונות בכלי מדעי המוח, כגון מכשירים מיקרופלואידיים ועבודות מחקר pHGG, הן המיטה לפתח גישות מידול חדשות ולהיות מסוגל עכשיו לשלב מיקרו-סביבה במוח במודלים של pHGG במבחנה3,16,17,18,19. יחד עם הקלטות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות מערכים multielectrode (MEA), התקנים microfluidic20,21,22 מציעים את האפשרות לחקות תנאים פיזיולוגיים תוך רישום הפעילות החשמלית של הרשת העצבית כולה לחלץ פרמטרי קישוריות רשת במספר תנאים. מכשיר זה 23,24 מאפשר תחילה את התצהיר המדויק של תאים בתא ישירות על MEA. טכנולוגיה זו מאפשרת שליטה על צפיפות זריעת תאים והומוגניות על MEA ושליטה עדינה של חילופי מדיה, המהווה צעד קריטי לבידול צאצא עצבי אנושי ישירות למכשירים. יתר על כן, תא התצהיר הנוכחי יכול להיות זרע עם תאים מרובים בנקודות זמן שונות.
לכן, מחקר זה נועד לפתח מודל במבחנה מודל co-culturing גזע Pluripotent אנושי (hiPS) נגזר גלוטמטרגי תאים שמקורם pHGG לתוך מכשירים microfluidic ותיעוד הפעילות החשמלית שלהם כדי להעריך אינטראקציות חשמליות בין שתי אוכלוסיות התא. ראשית, נוירונים גלוטמטרגיים בקליפת המוח הושגו ואופיינו במכשירים מיקרופלואידיים בשלבים שונים של תרבית [יום 4 (D4), כתאי hiPS, וביום 21 (D21) וביום 23 (D23), כמו נוירונים התבגר גלוטמטרגי]. עבור השלב השני של תרבות משותפת, נעשה שימוש בשני דגמי pHGG: קו UW479 ילדים ממוסחר ותאי pHGG יזם מגידול חולה (BT35)3, נושא מוטציה נהג H3.3 K27M. לבסוף, ביצענו הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של תאים גלוטמטרגיים ב- D21 לפני זריעת תאי pHGG ו- D23 לאחר 48 שעות של תרבית משותפת לאותו מכשיר מיקרופלואידי. האינטראקציות בין נוירונים גלוטמטרגיים לתאי pHGG התאפיינו בעלייה משמעותית בפעילות האלקטרופיזיולוגית המתועדת.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td >MCS</td>
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >53750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >51999</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accutase</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6964</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ala -Gln (GlutaMAX)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G8541</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axel Observer 7 Microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >431007-9904-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon&#174;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >353109</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >HERASafe type KS12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Colibri 7 LED</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >4230529710-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >
			<div>Cortical Glutamatergic Neurons</div>
			</td>
			<td >BrainXell</td>
			<td >BX-0300</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31331-028</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12 Medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8437</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS 1X</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >L0615-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasYFlaskTM&#160;cell culture flasks 75cm3</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >500105</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Geltrex</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A1413201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Memmert</td>
			<td >IC0150med</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MCS InterFace Boarder</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEA2100</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P10</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729020</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P100</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P1000</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729070</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P200</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729060</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >33290</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiChannel Experimenter</td>
			<td >MCS</td>
			<td >-</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N2 Supplement-A</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >7152</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal Medium</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21103049</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurocult SM1 neuronal supplement</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >5711</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 0.1 - 10 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >030570ACL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 1 - 200 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >032260CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 50 - 1250 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >134760CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >X0557-100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >4000202/4038202</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 10 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357551</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 5 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357543</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plaque chauffante (CultureTemp)</td>
			<td >Belart</td>
			<td >370151000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6407</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primovert microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >415510-1100-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scepter (Handheld Automated Cell Counter)</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >PHCC00000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TGF-&#946;1</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >100-21C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352070</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions

גליומות ילדים ברמה גבוהה (pHGG) מייצגות סרטן מוח בילדות ובמתבגרים הנושאים פרוגנוזה עגומה מהירה. מכיוון שיש צורך להתגבר על ההתנגדות לטיפולים הנוכחיים ולמצוא דרך חדשה לריפוי, מידול המחלה קרוב ככל האפשר במסגרת מבישה לבדיקת תרופות חדשות והליכים טיפוליים הוא תובעני מאוד. לימוד התהליכים הפתוביולוגיים הבסיסיים שלהם, כולל רגישות יתר של נוירונים גלוטמטרגיים, יהיה התקדמות אמיתית בהבנת אינטראקציות בין המוח הסביבתי לתאי pHGG. לכן, כדי לשחזר נוירונים / אינטראקציות תא pHGG, עבודה זו מראה את ההתפתחות של מודל במבחנה פונקציונלי פולחן שיתוף פולחן גזע Pluripotent המושרה על ידי האדם (hiPS) נגזר נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח pHGG תאים לתוך התקנים microfluidic ממודר ותהליך כדי לתעד את השינויים האלקטרופיזיולוגיים שלהם. הצעד הראשון היה להבדיל ולאפיין נוירונים גלוטמטרגיים אנושיים. שנית, התאים היו בתרבית במכשירים מיקרופלואידיים עם קווי תאים נגזרים pHGG. מיקרו-סביבה מוחית ופעילות עצבית נכללו אז במודל זה כדי לנתח את ההשפעה החשמלית של תאי pHGG על הנוירונים המיקרו-סביבתיים האלה. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מצמידות באמצעות מערכים רב-אלקטרוניים (MEA) למכשירים מיקרופלואידיים אלה כדי לחקות תנאים פיזיולוגיים ולתעד את הפעילות החשמלית של הרשת העצבית כולה. עלייה משמעותית בעירור הנוירונים הודגשה בנוכחות תאים סרטניים.

לפני לימוד אינטראקציות חשמליות בין נוירונים גלוטמטריים לתאי גליומה, תאי עצב גלוטמטרגיים בקליפת המוח ממקור HIPS התאפיינו כדי לאמת את ההיתכנות של פולחן שלהם במכשירים מיקרופלואידיים (איור 1A). האפיון שלהם הוערך באמצעות נסטין, Sox2, mGlurR2 (קולטני גלוטמט מטאבוטרופיים 2),...

Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

עבודות אחרונות לחשוף את ההשפעה העצבית על גליומה ילדים ברמה גבוהה (pHGG) תאים ואינטראקציות הדדיות שלהם. העבודה הנוכחית מראה את ההתפתחות של מודל אין ויטרו פולחן תאי pHGG cohGG נוירונים גלוטמטרגיים ותיעדה את האינטראקציות האלקטרופיזיולוגיות שלהם כדי לחקות את האינטראקטיביות האלה.

תרבית משותפת של נוירונים גלוטמטריים ותאי גליומה ברמה גבוהה לילדים למכשירים מיקרופלואידיים להערכת אינטראקציות חשמליות

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

האינטראקציות בין תאי הglioma הממאירים לבין הנוירונים הסובבים שלהם צוברות עניין. כאן, אנו מראים את ההתפתחות של מודל אין ויטרו פולחן משותף שמקורו נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח ותאי הגידול. המכשירים המיקרופלודיים המשמשים לתרבויות משותפות בשילוב מערכים רב-אלקטרוניים מאפשרים לחקור סוגי תאים שונים ולבצע הקלטות פעילות חשמלית בנקודות זמן שונות של התרבויות.שיטה זו מועילה במיוחד למחקרים פונקציונליים ומכניסטיים ולניתוח ההשפעות של סוכנים פרמקולוגיים החוסמים נדידת תאי גליומה ברמה גבוהה בילדים ואינטראקציה עם נוירונים. כדי להתחיל פולחן נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח הממוסחרים שמקורם ב- IPS, רוקנו את מאגרי הכניסה והשקע של המכשיר המיקרופלואידי על ידי שאיפת פיפטה, ומאפשרים רק לערוצי המכשיר להתמלא במדיום. זרעו את תאי ה-IPS האנושיים על ידי הוספת 10 מיקרוליטרים של 6.5 מיליון תאי IPS אנושיים למיליליטר השעיה במדיום ותנו למכשיר להיות מתחת למכסה המנוע במשך 15 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד.לאחר 15 דקות, מלאו הן את מאגרי הכניסה והן את מאגרי השקע ב-50 מיקרוליטרים של מדיום תרבית יום רביעי, ואז העבירו את המכשיר לאינקובטור כדי לשמור על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 23 ימים. החלף את המדיום כל שלושה עד ארבעה ימים כמתואר בטקסט. כדי לספור את התאים ולהעריך את הכדאיות באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה סטנדרטי, צלם תמונות מיקרוסקופיות ביום הרביעי, ביום ה -21 וביום ה -23.תרבית הן UW479 והן BT35 קווי תאים ב- DMEM ו- F-12 גלוטמקס בתוספת סרום בקר עוברי 10% בבקבוק תרבית תאים. לשמור על תרבית התאים תחת סביבה מבוקרת ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים נורמוקסיים לאורך כל הניסוי. שים לב לכל קו תא כדי להגיע ל-80% השפעה.ביום 21 לאחר תרבית של נוירונים גלוטמטרגיים, להתחיל תרבות משותפת על ידי טריפסינג UW479 ותאי BT35. זרעו את תאי UW479 ו- BT35 המנוסים על גבי תאי הגלוטמטרג החסידים הבוגרים בכל מכשיר מיקרופלואידי ייעודי. לשמור על תרביות משותפות במשך יומיים תחת סביבה מבוקרת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עם נוירון גלוטמטרגי D11 ואילך בינוני.לספור תאי גליומה ברמה גבוהה ילדים באמצעות התמונות מיקרוסקופיות שנותחו עם תוכנת ניתוח התמונה כדי להעריך את הכדאיות שלהם ולחשב את אחוז התאים. מקם את ה- MFD במכשיר ההקלטה והשתמש בתוכנה הזמינה מסחרית לביצוע ההקלטה האלקטרופיזיולוגית של נוירונים גלוטמטרגיים ביום ה -21. לפני זריעת תאי גליומה ברמה גבוהה לילדים, בצע הקלטה אלקטרופיזיולוגית שנייה של נוירונים גלוטמטרגיים מובחנים בתרבית שליטה במקביל לתרבות המשותפת.בצע הקלטה אלקטרופיזיולוגית נוספת ביום ה -23 לאחר יומיים של תרבות משותפת. נוירונים גלוטמטרגיים דמויי קליפת המוח ממקור IPS התאפיינו והוערכה באמצעות קנין, SOX2, קולטני גלוטמט מטאבוטרופיים II, וחיסון VGLUT1. Nestin הוא חלבון חוט ביניים והוא בא לידי ביטוי בתאי CNS לא מואצים.SOX2 בא לידי ביטוי גם בתאים לא מורגשים של האפיתל העצבי במערכת העצבים. אחוז התאים של Nestin ו-SOX2 ירד מהיום הרביעי ליום ה-21, מה שמאשר את המצב המובחן של נוירונים גלוטמטרגיים. התמונות המיקרוסקופיות חשפו הפצה מתקדמת של נוירונים גלוטמטרגיים במכשירים מיקרופלואידיים.כאשר BT35 ו- UW479 נוספו לתרבות, נצפתה כי התאים הצפים היו נוכחים לאחר זריעת תאי גליומה ביום ה -21, שנעלם בהדרגה עד היום ה -23 והפך לדבק במכשיר. אחוזי התאים בני קיימא עבור BT35 ו- UW479 היו דומים ורמזו כי ניתן להשתמש כראוי בקווי תאים שמקורם בחולים. זיהוי ספייק ועלילת רסטר ביום ה -23 של התרבות הראו פעילות חשמלית מוגברת לאחר הוספת תאי גליומה ברמה גבוהה לילדים.כדי לפקח על הסינכרוניות של פעילות הרשת העצבית, נרשם קצב הירי המיידי ב- BT35 או בתאי עצב גלוטמטרגיים. ההבדל בפעילות החשמלית בין נוירונים גלוטמטרגיים בתרבית אישית ובתרבית משותפת היה משמעותי ביום ה -23. התפתחות מתודולוגית נוספת עשויה לכלול את ההערכה התפקודית של הרשת עם ניתוח פרץ ומתאם חוצה זמני מיוחד של הרשת.עכשיו, לחוקרים יש כלי מבטיח לחקור אינטראקציות ומיקוד פרמקולוגי של קווי גידול גליומה ברמה גבוהה ילדים נוירונים PSC גבוה. מספר קווי גידול ומספר סוגי נוירונים עשויים לשמש.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

השתלת דג הזברה גידולים מוחיים במוח לתוך מארחים המוסמכת החיסונית עבור מחקר לטווח ארוך של התנהגות תאים סרטניים והתגובה לסמים

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

פרוטוקולים מקיפה לדוגמה, מח עצם תהליך למדידת מחלה שיורית מדיד, לוקמיה בתאי גזע לוקמיה מיאלואידית חריפה

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

בידוד תאי גזע mesenchymal זולה רקמות, תרבות משותפת עם תאים סרטניים ללמוד אינטראקציות שלהם

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

הערכה של סמנים Glioma מאת אימונוהיסטוכימיה על תרבויות Neurosphere פרפין-מוטבע Glioma תלת-ממד

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

שיפוץ עצם מדידה ויצירה משולבת של מיקרוסביבה של עצם הגידול באמצעות Calvaria Co-תרבות והימאנורמוטוריקה

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

תרבות משותפת של תאים דמויי גזע גליובלסטומה על נוירונים בדוגמת ללמוד הגירה ואינטראקציות הסלולר

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

זרימת עבודה מהירה של סינון לזיהוי טיפול משולב פוטנציאלי עבור GBM באמצעות תאי גזע גליומה שמקורם במטופל

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

בדיקות אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים של גליומה מפושטת בקו האמצע בילדים

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

יצירה וטיפוח של אורגנואידים שמקורם בסרטן השחלות הסרוסי ברמה גבוהה

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

אופטימיזציה של פרמטרי ביצועים של בדיקת אורך הטלומרים TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...