Name: co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del programma Satt Conectus, Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» e «Semeurs d'Etoile». Ringraziamo i bambini e le famiglie colpite dagli HHG per il loro contributo a questa ricerca e il loro sostegno.

Per questo protocollo, il numero di accreditamento relativo all'uso di materiali umani è DC-2020-4203.
1. Fabbricazione, preparazione e trattamento di dispositivi microfluidici
<ol><li>Fabbricare stampi SU-8 utilizzando tecniche di fotolitografia convenzionali18. NOTA: A tale scopo, sono state progettate due maschere fotolitografiche per costruire due strati di strutture fotoresistenti su substrato di wafer di silicio e un sottile strato di fotoresist su SU-8 2005...

<ol>
	<li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+molecular+meta-analysis+of+1,000+pediatric+high-grade+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alex's+lemonade+stand+foundation+infant+and+childhood+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011.">Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).</li><li>Blandin, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+environment+and+paired+hierarchical+3D+and+2D+models+of+pediatric+H3.3-mutated+gliomas+recreate+the+patient+tumor+complexity.">Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity.</a> Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+communication+in+brain+cancer.">Synaptic communication in brain cancer.</a> Cancer Research. 80 (14), 2979-2982 (2020).</li><li>Mount, C. W., Yal&#231;&#305;n, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+maps+brain-wide+afferent+oligodendrocyte+precursor+cell+connectivity.">Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity.</a> eLife. 18 (8), 49291 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+astrocyte-synapse+interactions+in+CNS+disorders.">Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders.</a> Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).</li><li>Neftel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+model+of+cellular+states,+plasticity,+and+genetics+for+glioblastoma.">An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma.</a> Cell. 178 (4), 835-849 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+remodeling+of+neural+circuits+in+the+human+brain+decreases+survival.">Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signaling+between+glioblastoma+stem+cells+and+differentiated+tumor+cells+promotes+malignant+progression.">Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+activity-regulated+neuroligin-3+dependency+in+high-grade+glioma.">Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma.</a> Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+glioma+growth+through+Neuroligin-3+secretion.">Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion.</a> Cell. 161 (4), 803-816 (2015).</li><li>Buckingham, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+by+primary+brain+tumors+induces+epileptic+activity.">Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).</li><li>Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glioma+cells+induce+hyperexcitability+in+cortical+networks.">Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks.</a> Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchannel+patterning+strategies+for+in+vitro+structural+connectivity+modulation+of+neural+networks.">Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpiCoDyn:+A+toolbox+for+the+analysis+of+neuronal+network+dynamics+and+connectivity+from+multi-site+spike+signal+recordings.">SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).</li><li>Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+neurite+guidance+to+study+structure-function+relationships+in+topologically-complex+population-based+neural+networks.">Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks.</a> Scientific Reports. 6, 28384 (2016).</li><li>Nguyen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+transcriptional+and+metabolic+responses+of+pediatric+high+grade+gliomas+to+mTOR-HIF-1&#945;+axis+inhibition.">Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1&#945; axis inhibition.</a> Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Cerea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+intracellular+delivery+and+intracellular+recordings+combined+in+MEA+biosensors.">Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors.</a> Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).</li><li>Bruno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multielectrode+arrays+for+spatially+localized+drug+delivery+and+electrical+recordings+of+primary+neuronal+cultures.">Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+chamber+technology+as+building+blocks+for+a+standardized+brain+on+chip+framework.">Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).</li><li>Andreiuk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+polymer+nanoparticles+for+cell+barcoding+in+vitro+and+in+vivo.">Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo.</a> Small. 13 (38), (2017).</li></ol>

Questo lavoro descrive un accurato modello funzionale in vitro per valutare l'interazione tra neuroni glutamatergici corticali umani derivati da hiPS e cellule tumorali cerebrali in dispositivi microfluidici. Uno dei passaggi cruciali del presente protocollo è stata la differenziazione hiPS nei neuroni glutamatergici, che è stata confermata dalla diminuzione della colorazione immunofluorescente Nestin e Sox2 e dalla comparsa simultanea della colorazione mGluR2 e vGLUT1. Tuttavia, pochi progenitori neurali sono...

I gliomi pediatrici di alto grado (pHGG) presentano un'estesa diversità genotipica e fenotipica a seconda dell'età del paziente, della posizione e dell'estensione anatomica del tumore e dei driver molecolari1. Sono tumori cerebrali aggressivi che sono scarsamente controllati con le opzioni di trattamento attualmente disponibili e sono la principale causa di morte correlata ai tumori cerebrali nei bambini e negli adolescenti2. Quindi, oltre l'80% dei pazienti recidiva entro 2 anni dalla diagnosi e la loro sopravvivenza mediana è di 9-15 mesi, a seconda delle posizioni cerebrali e delle mutazioni del conducente. L'assenza di trattamenti curativi è l'urgenza primaria per la ricerca di laboratorio ed evidenzia l'immediata necessità di nuovi approcci terapeutici innovativi. A tale scopo, sono state sviluppate linee cellulari derivate dal paziente (PDCL) con la speranza di fornire la diversità pHGG3 in linee bidimensionali (2D) e / o neurosfere tridimensionali (3D). Tuttavia, quelle colture cellulari in vitro derivate dal paziente non imitano tutte le situazioni variabili del cervello. Questi modelli non considerano gli ambienti neuro-anatomici macroscopici e microscopici tipicamente descritti in pHGG.
Di solito, il pHGG nei bambini più piccoli si sviluppa principalmente nelle regioni pontine e talamiche, mentre l'HGG adolescenziale e del giovane adulto si concentra nelle aree corticali, specialmente nei lobi frontotemporali1. Queste specificità di localizzazione in tutte le età pediatriche sembrano coinvolgere ambienti diversi che portano alla gliomagenesi e a una rete intricata tra le cellule tumorali e l'attività neuronale specifica4,5,6. Sebbene i meccanismi non siano ancora identificati, il pHGG si sviluppa principalmente da cellule precursori neurali lungo la traiettoria di differenziazione dei lignaggi astrogliali e oligodendrogliali. Mentre il ruolo di questi lignaggi gliali è stato a lungo limitato al semplice supporto strutturale per i neuroni, ora è chiaramente stabilito che si integrano interamente nei circuiti neurali e mostrano complesse interazioni bidirezionali gliale-neuronale in grado di riorganizzare le regioni strutturali del cervello e rimodellare i circuiti neuronali4,7,8 . Inoltre, l'aumento di brandelli di prove indica che il sistema nervoso centrale (SNC) svolge un ruolo critico nell'inizio e nella progressione del cancro al cervello. Lavori recenti si sono concentrati sull'attività neuronale, che sembra guidare la crescita e la mitosi delle neoplasie gliali attraverso fattori di crescita secreti e comunicazioni sinaptiche elettrochimiche dirette6,9. Reciprocamente, le cellule di glioma di alto grado sembrano influenzare la funzione neuronale con una crescente attività neuronale glutamatergica e modulare il funzionamento dei circuiti in cui sono strutturalmente ed elettricamente integrate9. Quindi, gli studi che utilizzano modelli derivati dal paziente e nuovi strumenti di neuroscienza che controllano l'azione dei neuroni hanno dimostrato un effetto specifico del circuito dell'attività neuronale sulla posizione, la crescita e la progressione del glioma. La maggior parte di queste proiezioni neuronali coinvolte nei gliomi sono glutamatergiche e comunicano attraverso le secrezioni di glutammato. Biomarcatori glutamatergici specifici come mGluR2 o vGlut1/2 sono comunemente descritti6.
È interessante notare che, nonostante la loro eterogeneità molecolare, i gliomi pediatrici e adulti di alto grado mostrano una tipica risposta proliferativa all'attività neuronale glutammatergica e ad altri fattori secreti come la neuroligina-3 o bdNF (fattore neurotrofico derivato dal cervello)4,6,10,11,12,13 . Nelle regioni corticali, gli HHG pediatrici e adulti possono indurre ipereccitabilità neuronale attraverso un aumento della secrezione di glutammato e inibire gli interneuroni GABA che portano a gliomi associati all'attività della rete epilettica14,15. Inoltre, i circuiti neurali possono essere rimodellati dai gliomi spingendo specifici compiti neurologici, ad esempio il linguaggio, e possono richiedere un'ulteriore attività neuronale organizzata9.
Sulla base di questo razionale, l'avanzamento della comprensione delle comunicazioni bidirezionali tra cellule di glioma e neuroni deve essere completamente chiarito e integrato con le prime fasi degli approcci pHGG in vitro. Tale modellazione innovativa è fondamentale per comprendere e misurare l'impatto dell'attività elettrica neuronale durante i test antidroga e anticipare la risposta pHGG nei circuiti cerebrali. I recenti sviluppi negli strumenti di neuroscienza, come i dispositivi microfluidici e i lavori di ricerca pHGG, sono il terreno per sviluppare nuovi approcci di modellazione ed essere ora in grado di integrare il microambiente cerebrale in modelli pHGG in vitro3,16,17,18,19. Accoppiati con registrazioni elettrofisiologiche che utilizzano array multielettrodi (MEA), i dispositivi microfluidici20,21,22 offrono la possibilità di imitare le condizioni fisiologiche registrando l'attività elettrica dell'intera rete neurale ed estrarre i parametri di connettività di rete in diverse condizioni. Questo dispositivo23,24 permette innanzitutto la deposizione precisa delle cellule in una camera direttamente su MEA. Questa tecnologia consente il controllo della densità e dell'omogeneità della semina cellulare su MEA e il controllo fine dello scambio di media, che è un passo fondamentale per la differenziazione del progenitore neurale umano direttamente nei dispositivi. Inoltre, l'attuale camera di deposizione può essere seminata con più cellule in diversi punti temporali.
Quindi, questo studio mirava a sviluppare un modello funzionale in vitro che co-coltivasse neuroni glutamatergici corticali derivati da stelo pluripotente umano (hiPS) e cellule derivate da pHGG in dispositivi microfluidici e registrasse la loro attività elettrica per valutare le interazioni elettriche tra entrambe le popolazioni cellulari. In primo luogo, i neuroni glutamatergici corticali derivati da hiPS sono stati ottenuti e caratterizzati in dispositivi microfluidici in diversi stadi di coltura [giorno 4 (D4), come cellule hiPS, e giorno 21 (D21) e giorno 23 (D23), come neuroni maturi glutamatergici]. Per la seconda fase della co-coltura, sono stati utilizzati due modelli di pHGG: linea UW479 pediatrica commercializzata e cellule pHGG avviate da un tumore del paziente (BT35)3, portatore di una mutazione driver H3.3 K27M. Infine, abbiamo eseguito registrazioni elettrofisiologiche di cellule glutamatergiche a D21 prima della semina delle cellule pHGG e D23 dopo 48 ore di co-coltura nello stesso dispositivo microfluidico. Le interazioni tra neuroni glutamatergici e cellule pHGG sono state caratterizzate da un aumento significativo dell'attività elettrofisiologica registrata.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td >MCS</td>
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >53750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >51999</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accutase</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6964</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ala -Gln (GlutaMAX)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G8541</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axel Observer 7 Microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >431007-9904-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon&#174;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >353109</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >HERASafe type KS12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Colibri 7 LED</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >4230529710-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >
			<div>Cortical Glutamatergic Neurons</div>
			</td>
			<td >BrainXell</td>
			<td >BX-0300</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31331-028</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12 Medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8437</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS 1X</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >L0615-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasYFlaskTM&#160;cell culture flasks 75cm3</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >500105</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Geltrex</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A1413201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Memmert</td>
			<td >IC0150med</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MCS InterFace Boarder</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEA2100</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P10</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729020</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P100</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P1000</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729070</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P200</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729060</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >33290</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiChannel Experimenter</td>
			<td >MCS</td>
			<td >-</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N2 Supplement-A</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >7152</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal Medium</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21103049</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurocult SM1 neuronal supplement</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >5711</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 0.1 - 10 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >030570ACL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 1 - 200 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >032260CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 50 - 1250 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >134760CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >X0557-100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >4000202/4038202</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 10 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357551</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 5 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357543</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plaque chauffante (CultureTemp)</td>
			<td >Belart</td>
			<td >370151000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6407</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primovert microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >415510-1100-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scepter (Handheld Automated Cell Counter)</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >PHCC00000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TGF-&#946;1</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >100-21C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352070</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions

I gliomi pediatrici di alto grado (pHGG) rappresentano tumori cerebrali infantili e adolescenziali che portano una prognosi rapida e triste. Poiché è necessario superare la resistenza ai trattamenti attuali e trovare un nuovo modo di curare, è molto impegnativo modellare la malattia il più vicino possibile in un ambiente in vitro per testare nuovi farmaci e procedure terapeutiche. Studiare i loro processi patobiologici fondamentali, compresa l'ipereccitabilità dei neuroni glutammatergici, sarà un vero progresso nella comprensione delle interazioni tra il cervello ambientale e le cellule pHGG. Pertanto, per ricreare le interazioni neuroni/cellule pHGG, questo lavoro mostra lo sviluppo di un modello funzionale in vitro che co-coltiva i neuroni glutamatergici corticali derivati dall'uomo (hiPS) in cellule pHGG in dispositivi microfluidici compartimentati e un processo per registrare le loro modifiche elettrofisiologiche. Il primo passo è stato quello di differenziare e caratterizzare i neuroni glutamatergici umani. In secondo luogo, le cellule sono state coltivate in dispositivi microfluidici con linee cellulari derivate da pHGG. Il microambiente cerebrale e l'attività neuronale sono stati quindi inclusi in questo modello per analizzare l'impatto elettrico delle cellule pHGG su questi neuroni micro-ambientali. Le registrazioni elettrofisiologiche sono accoppiate utilizzando array multielettrodi (MEA) a questi dispositivi microfluidici per imitare le condizioni fisiologiche e registrare l'attività elettrica dell'intera rete neurale. Un aumento significativo dell'eccitabilità neuronale è stato sottolineato in presenza di cellule tumorali.

Prima di studiare le interazioni elettriche tra neuroni glutamatergici e cellule di glioma, i neuroni glutamatergici corticali derivati da hiPS sono stati caratterizzati per convalidare la fattibilità di coltivarli in dispositivi microfluidici (Figura 1A). La loro caratterizzazione è stata valutata utilizzando Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotropic Glutamate Receptors 2) e vGLUT1 immunocolore, rappresentati nella Figura 1A (2-7)</...

Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Lavori recenti scoprono l'impatto neuronale sulle cellule di glioma pediatrico di alto grado (pHGG) e le loro interazioni reciproche. Il presente lavoro mostra lo sviluppo di un modello in vitro che co-coltiva cellule pHGG e neuroni glutamatergici e registra le loro interazioni elettrofisiologiche per imitare tali interattività.

Co-coltura di neuroni glutamatergici e cellule di glioma pediatrico di alto grado in dispositivi microfluidici per valutare le interazioni elettriche

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Le interazioni tra le cellule di glioma maligno e i neuroni circostanti stanno guadagnando interesse. Qui, mostriamo lo sviluppo di un modello in vitro che co-coltiva neuroni glutamatergici corticali derivati e cellule tumorali. I dispositivi microfludici utilizzati per le co-colture accoppiate a array multielettrodi consentono lo studio di diversi tipi di cellule ed eseguono registrazioni di attività elettrica in diversi punti temporali delle colture.Questo metodo è particolarmente utile per studi funzionali e meccanicistici e per analizzare gli effetti degli agenti farmacologici che bloccano la migrazione delle cellule di glioma pediatrico di alto grado e l'interazione con i neuroni. Per iniziare a coltivare i neuroni glutamatergici corticali derivati dall'IPS umano commercializzati, svuotare i serbatoi di ingresso e di uscita del dispositivo microfluidico mediante aspirazione a pipetta, lasciando che solo i canali del dispositivo siano riempiti con il mezzo. Semina le cellule IPS umane aggiungendo 10 microlitri di 6,5 milioni di cellule IPS umane per millilitro di sospensione nel mezzo e lascia che il dispositivo sia sotto il cofano per 15 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi.Dopo 15 minuti, riempire sia i serbatoi di ingresso che di uscita con 50 microlitri del quarto giorno di terreno di coltura, quindi trasferire il dispositivo nell'incubatore per mantenere le celle a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 23 giorni. Sostituire il mezzo ogni tre o quattro giorni come descritto nel testo. Per contare le cellule e valutare la vitalità utilizzando un microscopio a contrasto di fase standard, scattare foto microscopiche al 4 ° giorno, 21 ° giorno e 23 ° giorno.Coltura di entrambe le linee cellulari UW479 e BT35 in DMEM e F-12 GlutaMAX integrate con siero bovino fetale al 10% in un pallone di coltura cellulare. Mantenere la coltura cellulare in un ambiente controllato a 37 gradi Celsius in condizioni normossiche durante l'esperimento. Osservare ogni linea cellulare per raggiungere l'80% di confluenza.Il giorno 21 post-coltura dei neuroni glutamatergici, iniziare la co-coltura tripsinificando le cellule UW479 e BT35. Semina le cellule UW479 e BT35 tripsinizzate sopra i neuroni glutammatergici aderenti maturi in ciascun dispositivo microfluidico dedicato. Mantenere le co-colture per due giorni in un ambiente controllato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con neurone glutamatergico D11 e mezzo successivo.Conta le cellule di glioma pediatrico di alto grado utilizzando le immagini microscopiche analizzate con il software di analisi delle immagini per valutare la loro vitalità e calcolare la percentuale di cellule. Posizionare l'MFD nel dispositivo di registrazione e utilizzare un software disponibile in commercio per eseguire la registrazione elettrofisiologica dei neuroni glutammatergici il 21 ° giorno. Prima di seminare cellule di glioma pediatrico di alto grado, eseguire una seconda registrazione elettrofisiologica dei neuroni glutamatergici differenziati coltivati come controllo parallelo alla co-coltura.Eseguire un'altra registrazione elettrofisiologica il 23 ° giorno dopo due giorni di co-coltura. I neuroni glutamatergici corticali derivati dall'IPS umano sono stati caratterizzati e valutati utilizzando nestin, SOX2, recettori metabotropici del glutammato II e immunocolorazione VGLUT1. La nestin è una proteina del filamento intermedio ed è stata espressa in cellule indifferenziate del SNC.SOX2 è stato anche espresso in cellule indifferenziate dell'epitelio neurale nel SNC. La percentuale di cellule nestine e SOX2-positive è diminuita dal quarto giorno al 21 ° giorno, confermando lo stato differenziato dei neuroni glutamatergici. Le immagini microscopiche hanno rivelato una distribuzione progressiva dei neuroni glutamatergici attraverso dispositivi microfluidici.Quando BT35 e UW479 sono stati aggiunti alla coltura, è stato osservato che le cellule galleggianti erano presenti dopo la semina delle cellule di glioma il 21 ° giorno, che è progressivamente scomparsa fino al 23 ° giorno e sono diventate aderenti al dispositivo. Le percentuali di cellule vitali per BT35 e UW479 erano comparabili e implicavano che le linee cellulari derivate dal paziente potessero essere utilizzate in modo appropriato. Il rilevamento di picchi e il grafico raster il 23 ° giorno di coltura hanno mostrato un aumento dell'attività elettrica dopo l'aggiunta di cellule di glioma pediatrico di alto grado.Per monitorare la sincronicità dell'attività della rete neurale, è stata registrata la velocità di attivazione istantanea nei neuroni BT35 o glutamatergici. La differenza nell'attività elettrica tra i neuroni glutamatergici coltivati individualmente e co-coltivati è stata significativa il 23 ° giorno. Ulteriori sviluppi metodologici possono includere la valutazione funzionale della rete con analisi burst e speciali correlazioni temporali incrociate della rete.Ora, i ricercatori hanno uno strumento promettente per esplorare le interazioni e il targeting farmacologico delle linee tumorali del glioma pediatrico di alto grado e dei neuroni ad alto PSC. Potrebbero essere utilizzate diverse linee tumorali e diversi tipi di neuroni.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Il trapianto di tumori del cervello pediatrico di Zebrafish in ospedali immunitario-competenti per uno studio a lungo termine del comportamento della cellula tumorale e della risposta ai farmaci

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Valutazione di biomarcatori in Glioma mediante immunoistochimica su paraffina 3D Glioma Neurosphere culture

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Misurare il rimodellamento osseo e ricreare il microambiente tumore-osso utilizzando la co-cultura Calvaria e l'ibitorometria

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-coltura di cellule simili a staminali di glioblastoma su neuroni modellati per studiare la migrazione e le interazioni cellulari

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flusso di lavoro di screening rapido per identificare la potenziale terapia combinata per GBM utilizzando cellule staminali di glioma derivate dal paziente

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Saggi di immunocitochimica delle cellule 3D del glioma diffuso della linea mediana pediatrica

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generazione e coltura di organoidi di alto grado derivati da pazienti con carcinoma ovarico sieroso

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Ottimizzazione dei parametri prestazionali del saggio di lunghezza dei telomeri TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...