Name: co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

この作品は、サット・コネクトゥス・プログラム、フォンダシオン・ド・ラ・ヴェルシオン・ド・ストラスブール、«J'ai demandé la lune»、«ウネ・ルーラードはチャーライン»、«ライフピンク»、«フランク、レーヨン・ド・ソレイユ»と«セムール・デ・エトワール»協会からの助成金によって支えられました。HGGの影響を受けた子どもたちやご家族の皆様のご支援に感謝申し上げます。

このプロトコルでは、人間の材料の使用に関連する認定番号はDC-2020-4203です。
1. マイクロ流体装置の製造、準備および処理
<ol><li>従来のフォトリソグラフィ技術を用いてSU-8金型を製造する18。 注:この目的のために、2つのフォトリソグラフィマスクは、シリコンウエハー基板上にフォトレジスト構造の2つの層を構築するように設計されており、薄?...

<ol>
	<li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+molecular+meta-analysis+of+1,000+pediatric+high-grade+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alex's+lemonade+stand+foundation+infant+and+childhood+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011.">Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).</li><li>Blandin, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+environment+and+paired+hierarchical+3D+and+2D+models+of+pediatric+H3.3-mutated+gliomas+recreate+the+patient+tumor+complexity.">Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity.</a> Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+communication+in+brain+cancer.">Synaptic communication in brain cancer.</a> Cancer Research. 80 (14), 2979-2982 (2020).</li><li>Mount, C. W., Yal&#231;&#305;n, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+maps+brain-wide+afferent+oligodendrocyte+precursor+cell+connectivity.">Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity.</a> eLife. 18 (8), 49291 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+astrocyte-synapse+interactions+in+CNS+disorders.">Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders.</a> Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).</li><li>Neftel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+model+of+cellular+states,+plasticity,+and+genetics+for+glioblastoma.">An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma.</a> Cell. 178 (4), 835-849 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+remodeling+of+neural+circuits+in+the+human+brain+decreases+survival.">Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signaling+between+glioblastoma+stem+cells+and+differentiated+tumor+cells+promotes+malignant+progression.">Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+activity-regulated+neuroligin-3+dependency+in+high-grade+glioma.">Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma.</a> Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+glioma+growth+through+Neuroligin-3+secretion.">Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion.</a> Cell. 161 (4), 803-816 (2015).</li><li>Buckingham, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+by+primary+brain+tumors+induces+epileptic+activity.">Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).</li><li>Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glioma+cells+induce+hyperexcitability+in+cortical+networks.">Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks.</a> Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchannel+patterning+strategies+for+in+vitro+structural+connectivity+modulation+of+neural+networks.">Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpiCoDyn:+A+toolbox+for+the+analysis+of+neuronal+network+dynamics+and+connectivity+from+multi-site+spike+signal+recordings.">SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).</li><li>Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+neurite+guidance+to+study+structure-function+relationships+in+topologically-complex+population-based+neural+networks.">Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks.</a> Scientific Reports. 6, 28384 (2016).</li><li>Nguyen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+transcriptional+and+metabolic+responses+of+pediatric+high+grade+gliomas+to+mTOR-HIF-1&#945;+axis+inhibition.">Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1&#945; axis inhibition.</a> Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Cerea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+intracellular+delivery+and+intracellular+recordings+combined+in+MEA+biosensors.">Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors.</a> Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).</li><li>Bruno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multielectrode+arrays+for+spatially+localized+drug+delivery+and+electrical+recordings+of+primary+neuronal+cultures.">Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+chamber+technology+as+building+blocks+for+a+standardized+brain+on+chip+framework.">Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).</li><li>Andreiuk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+polymer+nanoparticles+for+cell+barcoding+in+vitro+and+in+vivo.">Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo.</a> Small. 13 (38), (2017).</li></ol>

本研究は、ヒトhiPS由来の皮質グルタミン酸ニューロンと脳腫瘍細胞との間の微小流体デバイスにおける相互作用を評価するための正確な機能イン ビトロ モデルを説明する。本プロトコルの重要なステップの1つは、グルタマ作動性ニューロンにおけるhiPS分化であり、これはネスチンとSox2免疫蛍光染色の減少とmGluR2およびvGLUT1染色の同時出現によって確認された。それにもかかわらず?...

小児の高等質神経膠腫(pHGG)は、患者の年齢、腫瘍解剖学的位置および拡張、および分子ドライバに応じて、拡張されたジェノティピックおよび現象の多様性を示す1。彼らは、現在利用可能な治療オプションで制御が不十分であり、小児および青年の脳癌に関連する主要な死因である積極的な脳腫瘍である2。したがって、患者の80%以上が診断後2年以内に再発しており、その中央値の生存率は脳の位置とドライバーの突然変異に応じて9〜15ヶ月である。治癒治療の欠如は、実験室での研究のための主要な衝動であり、新しい革新的な治療アプローチの即時の必要性を強調しています。この目的のために、患者由来細胞株(PDCL)は、2次元(2D)線および/または3次元(3D)神経球でpHGG多様性3 を提供することを期待して開発された。それにもかかわらず、これらの患者由来 のインビトロ 細胞培養は、すべての脳可変状況を模倣するわけではない。これらのモデルは、pHGGに典型的に記載されている巨視的および微視的な神経解剖学的環境を考慮していない。
通常、若い小児のpHGGは主にポンチンおよび視床領域で発達しているのに対し、思春期および若年成人のHGGは皮質領域、特に前頭側頭葉1に集中する。小児期におけるこれらの位置特異性は、神経膠腫形成につながる異なる環境と、腫瘍細胞と特異的神経活動との間の複雑なネットワークを伴うようである4,5,6。メカニズムはまだ特定されていないが、pHGGは主にアストログリアおよびオリゴデンドログリア系統の分化軌道に沿って神経前駆細胞から発達する。これらのグリア系統の役割は、ニューロンの単純な構造的サポートに長い間制限されてきたが、神経回路に完全に統合し、脳の構造領域を再編成し、神経回路を改造することができる複雑な双方向グリア神経相互作用を示すことが明らかに確立された4,7,8.さらに、証拠の断片の増加は、中枢神経系(CNS)が脳癌の開始および進行において重要な役割を果たしていることを示している。最近の研究は、分泌された成長因子と直接電気化学的シナプス通信を通じてグリア悪性腫瘍の成長と有糸分裂を促進すると思われる神経活動に焦点を当てた6,9。相互に、高等度の神経膠腫細胞は、増加するグルタミン酸作動性神経活動と神経機能に影響を与え、それらが構造的および電気的に統合された回路の動作を調節する9。そこで、神経細胞の作用を制御する患者由来モデルと新しい神経科学ツールを用いた研究は、神経膠腫の位置、成長、および進行に対する神経活動の回路特異的効果を示した。これらの神経細胞の突起の大部分は、神経膠腫に関与し、グルタミン酸分泌物を介して通信します。.mGluR2またはvGlut1/2などの特異的グルタミン酸バイオマーカーは、一般的に説明される6。
興味深いことに、その分子異質性にもかかわらず、小児および成人の高等級神経膠腫は、グルタミン酸神経活性および神経リジン-3またはBDNF(脳由来神経栄養因子)などの他の分泌因子に対する典型的な増殖反応を示す4,6,6,10,11,12,13.皮質領域では、小児および成人HGGは、グルタミン酸分泌の増加を介して神経過励起を誘発し、てんかんネットワーク活動に関連する神経膠腫につながるGABAインターニューロンを阻害する14,15。その上、神経回路は、例えば、言語などの特定の神経学的タスクを押す神経膠腫によって改造することができ、追加の組織化された神経活動を要求することができます9。
この根拠に基づいて、神経膠腫細胞とニューロン間の双方向通信の理解を進め、インビトロpHGGアプローチの初期段階で完全に解明し、統合されなければならない。このような革新的なモデリングは、薬物検査中の神経細胞の電気活動への影響を理解し測定し、脳回路へのpHGG応答を予測する上で極めて重要です。マイクロ流体デバイスやpHGG研究などの神経科学ツールの最近の発展は、新しいモデリングアプローチを開発し、インビトロpHGGモデル3、16、17、18、19に脳微小環境を統合することができるベッドです。多電極アレイ(MEA)を用いた電気生理学的記録と組み合わせることで、マイクロ流体デバイス20,21,22は、ニューラルネットワーク全体の電気的活動を記録しながら生理的条件を模倣し、いくつかの条件下でネットワーク接続パラメータを抽出する可能性を提供します。この装置23,24は最初にMEAの直接の部屋の細胞の精密な沈着を可能にする。この技術により、MEA上の細胞播種密度と均質性の制御と、ヒト神経前駆物質のデバイスへの直接分化にとって重要なステップであるメディア交換の細かい制御が可能になります。また、この堆積チャンバは、異なる時点で複数の細胞で播種することができる。
そこで本研究は、ヒト多能性幹細胞(hiPS)由来の多能性幹細胞(hiPS)由来の皮質グルタマ作動性ニューロンおよびpHGG由来細胞をマイクロ流体デバイスに共培養する機能インビトロモデルを開発し、それらの電気的活性を記録して、両細胞集団間の電気的相互作用を評価することを目的とした。まず、hiPS由来の皮質グルタミン酸ニューロンを得て、培養の異なる段階でマイクロ流体デバイスで特徴付け[4日目(D4)、hiPS細胞として、および23日目(D23)、グルタマチル化成熟ニューロンとして。共培養の第2段階では、2つのpHGGモデルが使用された:市販された小児UW479ラインおよびpHGG細胞は患者腫瘍から開始された(BT35)3、H3.3 K27Mドライバー突然変異を有する。最後に、同じマイクロ流体装置への共培養の48時間後にpHGG細胞播種とD23の前にD21でグルタミン酸細胞の電気生理学的記録を行った。グルタミン酸ニューロンとpHGG細胞との相互作用は、記録された電気生理学的活性の有意な増加によって特徴付けられていた。

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td >MCS</td>
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >53750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >51999</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accutase</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6964</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ala -Gln (GlutaMAX)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G8541</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axel Observer 7 Microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >431007-9904-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon&#174;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >353109</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >HERASafe type KS12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Colibri 7 LED</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >4230529710-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >
			<div>Cortical Glutamatergic Neurons</div>
			</td>
			<td >BrainXell</td>
			<td >BX-0300</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31331-028</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12 Medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8437</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS 1X</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >L0615-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasYFlaskTM&#160;cell culture flasks 75cm3</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >500105</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Geltrex</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A1413201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Memmert</td>
			<td >IC0150med</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MCS InterFace Boarder</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEA2100</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P10</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729020</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P100</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P1000</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729070</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P200</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729060</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >33290</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiChannel Experimenter</td>
			<td >MCS</td>
			<td >-</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N2 Supplement-A</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >7152</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal Medium</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21103049</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurocult SM1 neuronal supplement</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >5711</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 0.1 - 10 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >030570ACL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 1 - 200 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >032260CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 50 - 1250 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >134760CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >X0557-100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >4000202/4038202</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 10 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357551</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 5 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357543</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plaque chauffante (CultureTemp)</td>
			<td >Belart</td>
			<td >370151000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6407</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primovert microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >415510-1100-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scepter (Handheld Automated Cell Counter)</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >PHCC00000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TGF-&#946;1</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >100-21C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
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co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions

小児の高等神経膠腫(pHGG)は、急速な陰気予後を運ぶ小児および思春期の脳癌を表す。現在の治療法に対する耐性を克服し、新しい治療法を見つける必要があるため、新薬や治療手順をテストするための インビトロ の設定でできるだけ近い病気をモデル化することは非常に厳しいです。グルタミン酸神経過興奮性を含む基本的な病態生物学的プロセスを研究することは、環境脳とpHGG細胞の相互作用を理解する上で本当の進歩となるだろう。したがって、ニューロン/pHGG細胞相互作用を再現するために、この研究は、ヒト誘発多能性幹細胞(hiPS)由来の細胞質性大細胞性大細胞を区分された微小流体デバイスに共培養する機能 インビトロ モデルの開発と、その電気生理学的修飾を記録するプロセスを示す。最初のステップは、ヒトグルタミン酸細胞を区別し、特徴付けでした。第二に、細胞をpHGG由来細胞株を有するマイクロ流体デバイスで培養した。次に、脳微小環境と神経活動をこのモデルに含め、pHGG細胞がこれらの微小環境ニューロンに及ぼす電気的影響を分析した。電気生理学的記録は、多電極アレイ(MEA)を用いてこれらの微小流体デバイスに結合して、生理学的状態を模倣し、ニューラルネットワーク全体の電気的活動を記録する。神経興奮性の有意な増加は、腫瘍細胞の存在下で下線を引いた。

グルタミン酸細胞とグリオーマ細胞の間の電気的相互作用を研究する前に、hiPS由来の皮質グルタミン酸ニューロンは、マイクロ流体デバイスでそれらを培養する可能性を検証することを特徴としていた(図1A)。これらの特性評価は、図1A(2-7)に示されるネスチン、Sox2、mGlurR2(代謝刺激性グルタミン酸受容体2)、およびvG...

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Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

最近の研究では、高等度の小児神経膠腫(pHGG)細胞とそれらの相互相互作用に対する神経細胞の影響を明らかにする。本研究は、イン ビトロ モデルの共培養pHGG細胞とグルタミン酸ニューロンの開発を示し、それらの相互作用を模倣するためにそれらの電気生理学的相互作用を記録した。

グルタミン酸ニューロンと小児の高品位グリオーマ細胞の微小流体デバイスへの共培養による電気的相互作用の評価

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

悪性グリオーマ細胞とその周囲のニューロンとの相互作用が関心を集めています。ここでは、インビトロモデルの共同培養由来皮質グルタミン酸ニューロンと腫瘍細胞の開発を示す。多電極アレイに結合された共培養に使用されるマイクロフルディックデバイスは、異なる細胞タイプの研究を可能にし、培養の異なる時点で電気活動記録を行う。この方法は、機能および機械学的研究および小児のハイグレードグリオーマ細胞の移動およびニューロンとの相互作用を妨げ薬理学的薬剤の効果を分析するのに特に有用である。製品化されたヒトIPS由来皮質グルタミン酸ニューロンの培養を開始するために、マイクロ流体デバイスの入口および出口貯留部をピペット吸引によって空にし、デバイスチャネルのみを培地で満たさせる。培地中の1ミリリットルの懸濁液あたり650万個のヒトIPS細胞の10マイクロリットルを加えてヒトIPS細胞にシードを入れ、デバイスを15分間ボンネットの下に入れて細胞を取り付けます。15分後、インレットと出口の両方のリザーバーに50マイクロリットルの4つの培養培地を充填し、その後、23日間摂氏37度と5%の二酸化炭素で細胞を維持するためにインキュベーターにデバイスを移します。テキストに記載されているとおり、3 ~ 4 日ごとにメディアを交換します。細胞を数え、標準的な位相コントラスト顕微鏡を用いて生存率を評価するには、4日目、21日目、23日目に顕微鏡写真を撮ります。DMEMおよびF-12グルタマックスにおけるUW479およびBT35細胞株の両方を細胞培養フラスコにおいて10%の胎児ウシ血清を補充した。実験を通してノルモキシ条件で摂氏37度で制御された環境下で細胞培養を維持する。各細胞株が80%の合流性に達するのを観察してください。21日目にグルタミン酸細胞の培養後、UW479およびBT35細胞をトリプシン化して共培養を開始する。トリプシン化されたUW479およびBT35細胞を、各専用のマイクロ流体デバイスの成熟した付着性グルタミン酸ニューロンの上にシードします。摂氏37度の制御された環境下で2日間、グルタミン酸ニューロンD11および培地に対して5%の二酸化炭素を共培養します。画像解析ソフトウェアで分析された顕微鏡写真を使用して小児の高等神経膠腫細胞を数え、その生存率を評価し、細胞の割合を計算する。記録装置にMFDを入れ、市販のソフトウェアを使用して、グルタミン酸ニューロンの電気生理学的記録を21日目に行う。小児のハイグレードグリオーマ細胞を播種する前に、共培養に平行して制御として培養した分化されたグルタミン酸ニューロンの第2の電気生理学的記録を行う。23日目に、共培養の2日後に別の電気生理学的記録を行う。ヒトIPS由来の皮質グルタミン酸細胞は、ネスチン、SOX2、代謝性グルタミン酸受容体II、およびVGLUT1免疫染色を用いて特徴付け、評価された。ネスチンは中間フィラメントタンパク質であり、未分化CNS細胞で発現した。SOX2は、CNSにおける神経上皮の未分化細胞においても発現した。ネスチンとSOX2陽性細胞の割合は4日目から21日目まで減少し、グルタミン酸細胞の分化状態を確認した。顕微鏡画像は、微小流体デバイス全体のグルタミン酸ニューロンの進行分布を明らかにした。BT35とUW479を培養に添加すると、21日目にグリオーマ細胞播種後に浮遊細胞が存在することが観察され、23日目まで徐々に消失し、装置中に付着した。BT35およびUW479の生存細胞の割合は同等であり、患者由来細胞株を適切に使用できることを暗示した。培養23日目のスパイク検出およびラスタプロットは、小児の高級グリオーマ細胞を添加した後の電気的活性の増加を示した。ニューラルネットワーク活性のシンクロニシティをモニタリングするために、BT35またはグルタミン酸ニューロンにおける瞬間的な発火率を記録した。個々に培養したグルタミン酸ニューロンと共培養型グルタミン酸ニューロンとの間の電気的活性の差は、23日目に有意であった。さらなる方法論的開発には、バースト解析を伴うネットワークの機能的評価およびネットワークの特殊な時間的相互相関が含まれ得る。現在、研究者は、小児の高等神経膠腫腫瘍株と高PSCニューロンの相互作用と薬理学的標的化を探求する有望なツールを持っています。いくつかの腫瘍ラインといくつかのニューロンタイプが使用される可能性があります。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫適格宿主への移植

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

サンプルおよび測定可能な残存病変と急性骨髄性白血病の白血病幹細胞を測定するプロセス骨髄に対する包括的なプロトコル

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

それらの相互作用を研究する歯髄組織と癌細胞との共培養から間葉系幹細胞の分離

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

パラフィン埋め込まれた 3 D 神経膠腫 Neurosphere 文化に免疫組織化学による神経膠腫におけるバイオ マーカーの評価

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

カルバリア共培養と組織病量を用いた骨リモデリングと腫瘍-骨微小環境の再現

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

パターン化ニューロン上の神経膠芽腫幹細胞の共培養による移動と細胞相互作用の研究

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

患者由来グリオーマ幹細胞を用いたGBMの潜在的併用療法を同定するための迅速スクリーニングワークフロー

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

小児びまん性正中線神経膠腫の生3D細胞免疫細胞化学アッセイ

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

高悪性度漿液性卵巣癌患者由来オルガノイドの作製と培養

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

TAGGGテロメア長アッセイの性能パラメータの最適化

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...