Name: co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

이 작품은 Satt Conectus 프로그램, 퐁디 드 l'Université 드 스트라스부르, «J'ai 요구 라 루네», «Une 룰라드 부어 샬린», «LifePink», «프랭크, 레이온 드 솔레일»과 «셈퍼스 데토일»의 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 이 연구와 지원에 기여한 HG의 영향을 받는 어린이와 가족들에게 감사드립니다.

이 프로토콜의 경우, 인간 물질의 사용과 관련된 인증 번호는 DC-2020-4203입니다.
1. 미세 유체 장치 제조, 준비 및 치료
<ol><li>기존의 포토리소그래피 기법을 사용하여 SU-8 금형을 제작합니다18. 참고: 이를 위해 2개의 포토리소그래피 마스크는 실리콘 웨이퍼 기판에 포토레지스트 구조의 두 층과 얇은 SU-8 2005 포토레지스트 층(3.2 μm 높이 및 6 ± 1 μm 폭)을 구?...

<ol>
	<li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+molecular+meta-analysis+of+1,000+pediatric+high-grade+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alex's+lemonade+stand+foundation+infant+and+childhood+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011.">Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).</li><li>Blandin, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+environment+and+paired+hierarchical+3D+and+2D+models+of+pediatric+H3.3-mutated+gliomas+recreate+the+patient+tumor+complexity.">Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity.</a> Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+communication+in+brain+cancer.">Synaptic communication in brain cancer.</a> Cancer Research. 80 (14), 2979-2982 (2020).</li><li>Mount, C. W., Yal&#231;&#305;n, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+maps+brain-wide+afferent+oligodendrocyte+precursor+cell+connectivity.">Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity.</a> eLife. 18 (8), 49291 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+astrocyte-synapse+interactions+in+CNS+disorders.">Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders.</a> Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).</li><li>Neftel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+model+of+cellular+states,+plasticity,+and+genetics+for+glioblastoma.">An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma.</a> Cell. 178 (4), 835-849 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+remodeling+of+neural+circuits+in+the+human+brain+decreases+survival.">Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signaling+between+glioblastoma+stem+cells+and+differentiated+tumor+cells+promotes+malignant+progression.">Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+activity-regulated+neuroligin-3+dependency+in+high-grade+glioma.">Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma.</a> Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+glioma+growth+through+Neuroligin-3+secretion.">Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion.</a> Cell. 161 (4), 803-816 (2015).</li><li>Buckingham, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+by+primary+brain+tumors+induces+epileptic+activity.">Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).</li><li>Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glioma+cells+induce+hyperexcitability+in+cortical+networks.">Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks.</a> Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchannel+patterning+strategies+for+in+vitro+structural+connectivity+modulation+of+neural+networks.">Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpiCoDyn:+A+toolbox+for+the+analysis+of+neuronal+network+dynamics+and+connectivity+from+multi-site+spike+signal+recordings.">SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).</li><li>Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+neurite+guidance+to+study+structure-function+relationships+in+topologically-complex+population-based+neural+networks.">Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks.</a> Scientific Reports. 6, 28384 (2016).</li><li>Nguyen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+transcriptional+and+metabolic+responses+of+pediatric+high+grade+gliomas+to+mTOR-HIF-1&#945;+axis+inhibition.">Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1&#945; axis inhibition.</a> Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Cerea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+intracellular+delivery+and+intracellular+recordings+combined+in+MEA+biosensors.">Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors.</a> Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).</li><li>Bruno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multielectrode+arrays+for+spatially+localized+drug+delivery+and+electrical+recordings+of+primary+neuronal+cultures.">Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+chamber+technology+as+building+blocks+for+a+standardized+brain+on+chip+framework.">Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).</li><li>Andreiuk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+polymer+nanoparticles+for+cell+barcoding+in+vitro+and+in+vivo.">Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo.</a> Small. 13 (38), (2017).</li></ol>

이 작품은 미세 유체 장치에서 인간 hiPS 파생 된 피질 글루타머기신경과 뇌 종양 세포 사이의 상호 작용을 평가하기 위해 정확한 기능적 인 체외 모델을 설명합니다. 본 프로토콜에서 중요한 단계 중 하나는 글루타머기 뉴런의 hiPS 분화였으며, 네스티닌과 Sox2 면역 형광염색 의 감소및 mGluR2 및 vGLUT1 염색의 동시 출현에 의해 확인되었다. 그럼에도 불구 하 고, 몇 가지 신경 선조 는 글루타머?...

소아 고급 진모(pHGG)는 환자 연령, 종양 해부학적 위치 및 확장 및 분자 동인1에 따라 확장된 지노티픽 및 페노티픽 다이버시티를 나타낸다. 그(것)들은 현재 유효한 처리 선택권으로 제대로 통제되고 아이들과 청소년에 있는 두뇌 암과 관련되되되는 죽음의 주요한 원인인 공격적인 두뇌 종양입니다2. 따라서 환자의 80 % 이상이 진단 후 2 년 이내에 재발하고 있으며, 뇌 위치와 운전자 돌연변이에 따라 평균 생존율은 9-15 개월입니다. 치료 치료의 부재는 실험실 연구를위한 주요 충동이며 새로운 혁신적인 치료 접근 에 대한 즉각적인 필요성을 강조합니다. 이를 위해, 환자 유래 세포주(PDCL)는 2차원(2D) 라인 및/또는 3차원(3D) 신경구에서 pHGG 다이버시티3 를 제공한다는 희망으로 개발되었다. 그럼에도 불구 하 고, 그 환자 파생 된 체 외 세포 배양 모든 뇌 변수 상황을 모방 하지 않습니다. 이러한 모델은 일반적으로 pHGG에 기술된 거시적 및 현미경 신경 해부학 환경을 고려하지 않습니다.
일반적으로, 어린 아이들의 pHGG는 주로 pontine 및 thalamic 지역에서 발전하고 있는 반면, 사춘기와 젊은 성인의 HGG는 피질 지역에 집중하는 반면, 특히 정면 엽1에서. 소아 시대에 걸친 이러한 위치 특이성은 신경종과 종양 세포 와 특정 신경 활동 사이의 복잡한 네트워크로 이어지는 다른 환경을 수반하는 것으로 보입니다4,5,6. 메커니즘은 아직 확인되지 않지만, pHGG는 주로 천체 글리 올과 올리고 의 분화 궤적을 따라 신경 전구체 세포에서 개발. 이러한 신경교 혈통의 역할은 뉴런에 대한 간단한 구조적 지원에 오랫동안 제한되어 왔지만, 이제 는 신경 회로에 완전히 통합하고 뇌의 구조 영역을 재구성하고 뉴런 회로를 리모델링 할 수있는 복잡한 양방향 신경교신경 상호 작용을 나타낸다는 것이 명확합니다4,7,8 . 더욱이, 증거의 파쇄를 증가하는 것은 중추 신경계 (CNS)가 뇌암 개시 및 진행에 중요한 역할을한다는 것을 나타냅니다. 최근 의외의 성장 인자와 직접 전기화학적 시냅스 통신6,9을 통해 글리아 악성종양의 성장과 미토시스를 유도하는 것으로 보이는 신경 활동에 초점을 맞춘 최근 작품. 회귀적으로, 고급 신경교종 세포는 증가하는 글루타머지 뉴런 활동으로 신경 기능에 영향을 미치고 구조적으로 그리고 전기적으로 통합되는 회로의 작동을 조절하는 것처럼 보입니다9. 따라서, 환자 유래 모델과 뉴런 작용을 제어하는 새로운 신경 과학 도구를 사용하여 연구는 신경교종 위치, 성장 및 진행에 신경 활동의 회로 특정 효과를 입증했다. 교종에 관련 된 이러한 신경 투영의 대부분은 글루타머게틱 과 조미료 분비를 통해 의사 소통. mGluR2 또는 vGlut1/2와 같은 특정 글루타마테르기브 바이오마커는 일반적으로 설명되어 있습니다6.
흥미롭게도, 그들의 분자 이질성에도 불구하고, 소아및 성인 고학년 진모는 글루타민간 신경 활동 및 neuroligin-3 또는 BDNF (두뇌 유래 신경 영양인자)와 같은 그밖 분비한 요인에 전형적인 증식 반응을 보여줍니다 (두뇌 유래 신경 영양 인자)4,6,10,11,12,13 . 피질 영역에서, 소아 및 성인 HGGs 증가 된 조미료 분 비를 통해 신경 과민성을 유도 하 고 간 질 네트워크 활동과 관련 된 교감으로 이어지는 GABA 인터뉴런을 억제 할 수 있습니다14,15. 그 위에, 신경 회로는 특정 신경 학 작업을 추진 하는 gliomas에 의해 리모델링 될 수 있습니다., 예를 들어, 언어, 그리고 추가 조직 된 신경 활동을 요구할 수 있습니다9.
이 근거에 근거하여, 신경교종 세포와 신경 사이 양방향 커뮤니케이션의 이해를 전진하는 것은 완전히 해명되고 체외 pHGG 접근의 초기 단계와 통합되어야 합니다. 이러한 혁신적인 모델링은 약물 테스트 중 뉴런 전기 활동 영향을 이해하고 측정하고 뇌 회로에 pHGG 반응을 예측하는 데 매우 중요합니다. 미세 유체 장치 및 pHGG 연구 작품과 같은 신경 과학 도구의 최근 개발은 새로운 모델링 접근 법을 개발하고 이제 체외 pHGG 모델3,16,17,18,19에 뇌 미세 환경을 통합 할 수 있습니다. 다중 전기 극어(MEA)를 이용한 전기생리학적 기록과 결합된 미세유체 장치20,21,22는 전체 신경망의 전기 적 활성을 기록하고 여러 조건하에서 네트워크 연결 파라미터를 추출하면서 생리학적 조건을 모방할 수 있는 가능성을 제공한다. 이 장치23,24는 먼저 MEA에 직접 챔버에서 세포의 정확한 증착을 허용한다. 이 기술은 MEA에 세포 파종 밀도 및 균질성을 제어하고 인간 신경 전조자가 장치로 직접 분화하는 중요한 단계인 미디어 교환의 미세 한 제어를 가능하게합니다. 더욱이, 본 증착 챔버는 상이한 시점에서 다중 세포로 시드될 수 있다.
그래서, 이 연구는 인간 다능성 줄기 (hiPS)유래 된 피질 글루타마테기신경 및 pHGG 유래 세포를 미세 유체 장치로 공동 배양하고 두 세포 집단 사이의 전기 적 상호 작용을 평가하기 위해 전기 활동을 기록하는 기능적 인 시험관 내 모델을 개발하는 것을 목표로했습니다. 첫째, hiPS 유래 피질 글루타마테기닉 뉴런은 다양한 배양 단계[일 4일(D4), hiPS 세포로서, 21일(D21) 및 23일(D23) 및 23일(D23)에서 글루타머기틱 성숙뉴런으로 마이크로유체 장치에서 수득및 특징지어졌다. 공동 배양의 두 번째 단계를 위해, 두 개의 pHGG 모델이 사용되었다: 상용화 된 소아 UW479 라인과 pHGG 세포는 환자 종양에서 시작 (BT35)3, H3.3 K27M 드라이버 돌연변이를 베어링. 마지막으로, 동일한 미세 유체 장치에 공동 배양의 48 h 후 pHGG 세포 파종 및 D23 전에 D21에서 글루타미테르기 세포의 전기 생리학적 기록을 수행했습니다. 글루타미터기뉴런과 pHGG 세포 간의 상호작용은 기록된 전기생리활성의 현저한 증가를 특징으로 하였다.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td >MCS</td>
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >53750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >51999</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accutase</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6964</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ala -Gln (GlutaMAX)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G8541</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axel Observer 7 Microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >431007-9904-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon&#174;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >353109</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >HERASafe type KS12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Colibri 7 LED</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >4230529710-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >
			<div>Cortical Glutamatergic Neurons</div>
			</td>
			<td >BrainXell</td>
			<td >BX-0300</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31331-028</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12 Medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8437</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS 1X</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >L0615-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasYFlaskTM&#160;cell culture flasks 75cm3</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >500105</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Geltrex</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A1413201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Memmert</td>
			<td >IC0150med</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MCS InterFace Boarder</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEA2100</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P10</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729020</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P100</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P1000</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729070</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P200</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729060</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >33290</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiChannel Experimenter</td>
			<td >MCS</td>
			<td >-</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N2 Supplement-A</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >7152</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal Medium</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21103049</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurocult SM1 neuronal supplement</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >5711</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 0.1 - 10 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >030570ACL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 1 - 200 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >032260CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 50 - 1250 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >134760CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >X0557-100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >4000202/4038202</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 10 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357551</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 5 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357543</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plaque chauffante (CultureTemp)</td>
			<td >Belart</td>
			<td >370151000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6407</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primovert microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >415510-1100-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scepter (Handheld Automated Cell Counter)</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >PHCC00000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TGF-&#946;1</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >100-21C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352070</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions

소아 고급 진모 (pHGG)는 급속한 음이없는 예후를 운반하는 유년기 및 사춘기 뇌암을 나타냅니다. 현재 치료에 대한 저항을 극복하고 새로운 치료법을 찾을 필요가 있기 때문에, 새로운 약물과 치료 절차를 테스트하기 위해 체외 설정에서 가능한 한 가까운 질병을 모델링하는 것은 매우 까다롭습니다. 글루타마테어기신경 과민성 을 포함한 그들의 근본적인 병리학 적 과정을 공부하는 것은 환경 두뇌와 pHGG 세포 사이 상호 작용을 이해하는 실제적인 진보가 될 것입니다. 따라서, 뉴런/pHGG 세포 상호 작용을 재현하기 위하여, 이 작품은 인간 유도한 다능성 줄기(hiPS)-유래 된 피질 글루타마테릭 뉴런 pHGG 세포를 구획화된 미세 유체 장치로 pHGG 세포와 그들의 전기생리학적 수정을 기록하는 프로세스를 공동 배양하는 시험관 내 모델의 발달을 보여줍니다. 첫 번째 단계는 인간의 글루타미터기 뉴런을 분화하고 특성화하는 것이었습니다. 둘째, 세포는 pHGG 유래 세포주를 가진 미세유체 장치에서 배양되었다. 뇌 미세 환경과 뉴런 활동은 이러한 마이크로 환경 뉴런에 pHGG 세포의 전기적 영향을 분석하기 위해 이 모델에 포함되었다. 전기 생리학적 기록은 이러한 미세 유체 장치에 다중 전기 분해 어레이(MEA)를 사용하여 생리적 조건을 모방하고 전체 신경망의 전기 활성을 기록합니다. 뉴런 흥분성에 있는 중요한 증가는 종양 세포의 존재에서 밑줄이 있었습니다.

글루타미터기뉴런과 신경교종 세포 간의 전기적 상호작용을 연구하기 전에 hiPS 유래 피질 글루타머기뉴런은 미세유체 장치에서 배양할 수 있는 타당성을 검증하는 것이 특징이었습니다(그림 1A). 이들의 특성화는 네스티닌, 삭스2, mGlurR2(대사위픽 글루타민체 수용체 2) 및 vGLUT1 면역스테인링을 사용하여 평가되었으며, 도 1A(2-7)<...

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Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

최근 작품은 고급 소아 신경 교종에 신경 영향을 발견 (pHGG) 세포와 그들의 상호 작용. 본 작품은 생체 외 모델의 발달을 pHGG 세포와 글루타미터기뉴런과 기록하여 그 간 작용을 모방하였다.

글루타미터기뉴런과 소아 고학년 신경교세포의 공동 배양을 미세유체 장치로 결합하여 전기 적 상호 작용을 평가합니다.

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

악성 신경 종 세포와 그들의 주변 신경 사이 상호 작용 관심을 얻고 있다. 여기서, 우리는 유래 된 피질 글루타머기 뉴런 및 종양 세포를 공동 배양하는 체외 모델의 발달을 보여줍니다. 다중 전극 어레이에 결합된 공동 배양에 사용되는 마이크로플루딕 장치는 다양한 세포 유형의 연구를 허용하고 배양의 다른 시점에서 전기 활동 기록을 수행할 수 있습니다.이 방법은 기능및 기계학 연구 와 소아 고급 신경교종 세포 이동 및 뉴런과의 상호 작용을 차단하는 약리학 에이전트의 효과를 분석하는 데 특히 도움이됩니다. 상용화된 인간 IPS 유래 피질 글루타마테기닉 뉴런을 배양하기 시작하려면, 파이펫 포부에 의해 미세유체 장치의 입구 및 출구 저장소를 비우고 장치 채널만 매체로 채워지게 한다. 인간 IPS 세포를 배지에 밀리리터 서스펜션당 650만 개의 인간 IPS 세포의 10마이크로리터를 첨가하고 세포가 부착할 수 있도록 15분 동안 후드 아래에 장치가 있게 하였다.15분 후, 4일 배양 배지의 50마이크로리터로 입구와 출구 저장소를 모두 채운 다음, 23일 동안 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지하기 위해 인큐베이터로 장치를 옮기다. 텍스트에 설명된 대로 3~4일마다 미디어를 교체합니다. 세포를 계산하고 표준 상 대비 현미경을 사용하여 생존가능성을 평가하기 위해 4일, 21일 및 23일에 현미경 사진을 찍습니다.DMEM과 F-12 글루타맥스의 UW479 및 BT35 세포주 모두 세포 배양플라스크에서 10%의 태아 소 혈청을 보충하였다. 실험 전반에 걸쳐 노목상 조건에서 섭씨 37도에서 조절된 환경에서 세포 배양을 유지한다. 80%의 합류에 도달하기 위하여 각 세포줄을 관찰하십시오.21일째에 글루타머틱 뉴런의 배양 후, UW479 및 BT35 세포를 트립시닉하여 공동 배양을 시작합니다. 각 전용 미세 유체 장치에서 성숙한 부착 글루타마테기뉴런 위에 트립시화 된 UW479 및 BT35 세포를 시드하십시오. 대조환경하에서 2일 동안 공동배양을 섭씨 37도, 글루타미터기칼 뉴런 D11및 이후 배지로 이산화탄소 5%로 유지한다.소아 고급 신경종 세포를 이미지 분석 소프트웨어로 분석하여 분석한 현미경 사진을 사용하여 생존가능성을 평가하고 세포의 백분율을 계산합니다. MFD를 기록 장치에 배치하고 21일에 글루타미테르기뉴런의 전기생리학적 기록을 수행하기 위해 시판되는 소프트웨어를 사용합니다. 소아 고급 신경교종 세포를 종자하기 전에, 공동 배양에 평행하게 대조군으로 배양된 분화 된 글루타머기 뉴런의 제2 전기 생리학적 기록을 수행한다.공동 배양 이틀 후 인 23 일에 또 다른 전기 생리학적 기록을 수행하십시오. 인간 IPS 유래 피질 글루타마테기크 뉴런은 네스티닌, SOX2, 대사트로픽 글루타민산 수용체 II 및 VGLUT1 면역스테인링을 사용하여 특징화되고 평가되었다. 네신은 중간 필라멘트 단백질이며 미분화 된 CNS 세포로 발현되었습니다.SOX2는 또한 CNS에서 신경 상피의 미분화 세포에서 발현되었다. 네스틴과 SOX2 양성 세포 비율은 4일째부터 21일까지 감소하여 글루타미터기뉴런의 분화 상태를 확인하였다. 현미경 이미지는 미세 유체 장치에 걸쳐 글루타머기 뉴런의 점진적 분포를 밝혔다.BT35와 UW479가 배양물에 첨가되었을 때, 21일째에 신경교종 세포 파종 후 부동 세포가 존재하여 23일까지 점진적으로 사라지고 장치에 부착된 것으로 관찰되었다. BT35 및 UW479에 대한 실행 가능한 세포의 백분율은 환자 유래 세포주를 적절히 사용할 수 있다는 것을 비교하고 암시했습니다. 배양 23일째에 스파이크 검출 및 래스터 플롯은 소아 고급 신경교종 세포를 첨가한 후 전기 활동이 증가하는 것으로 나타났다.신경망 활동의 동시성을 모니터링하기 위해 BT35 또는 글루타마테르기크 뉴런의 즉각적인 발사 속도가 기록되었습니다. 개별적으로 배양된 글루타미터기뉴런과 공동 배양된 글루타미터기뉴런 간의 전기활동의 차이는 23일째에 유의했다. 추가 방법론적 개발은 네트워크의 버스트 분석 및 특별한 시간적 교차 상관관계를 가진 네트워크의 기능적 평가를 포함할 수 있다.지금, 연구원은 소아 고급 신경교종 종양 선 및 높은 PSC 뉴런의 상호 작용 및 약리학적 표적을 탐구하는 유망한 공구가 있습니다. 몇몇 종양 선 및 몇몇 신경 모형은 이용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기 연구를 위해 면역 능력이있는 숙주 내로 Zebrafish Pediatric Brain 종양을 이식

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

연구

암 연구학

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

펄프 조직 문화와 공동 암 세포와 그들의 상호 작용을 공부 하에서 중간 엽 줄기 세포 분리

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3D Glioma Neurosphere 문화에 의해 Glioma 바이오 마커의 평가

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Calvaria 공동 배양 및 조직 학을 사용하여 뼈 리모델링 및 종양 - 뼈 미세 환경 재현

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

이동 및 세포 상호 작용을 연구하기 위해 패턴 뉴런에 교모 세포 종 줄기 와 같은 세포의 공동 배양

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

환자 유래 신경종 줄기 세포를 사용하여 GBM에 대한 잠재적인 조합 요법을 식별하는 신속한 선별 워크플로우

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

소아 미만성 정중선 신경아교종의 Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

고급 장액성 난소암 환자 유래 오가노이드의 생성 및 배양

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

TAGGG 텔로미어 길이 분석의 성능 매개변수 최적화

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...