Name: co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Satt Conectus-programmet Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» og «Semeurs d'Etoile»-foreninger. Vi takker barna og familiene som er berørt av HGG-er for deres bidrag til denne forskningen og deres støtte.

For denne protokollen er akkrediteringsnummeret knyttet til bruk av menneskelige materialer DC-2020-4203.
1. Mikrofluidisk enhet fabrikasjon, forberedelse og behandling
<ol><li>Fabriker SU-8-former ved hjelp av konvensjonelle fotolittografiteknikker18. MERK: For dette formålet, to fotolitografimasker er designet for å konstruere to lag med fotoresiststrukturer på silisiumskiveunderlag og et tynt SU-8 2005 fotoresistlag (3,2 μm høyt og 6 ± 1 μm bredt) som def...

<ol>
	<li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+molecular+meta-analysis+of+1,000+pediatric+high-grade+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alex's+lemonade+stand+foundation+infant+and+childhood+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011.">Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).</li><li>Blandin, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+environment+and+paired+hierarchical+3D+and+2D+models+of+pediatric+H3.3-mutated+gliomas+recreate+the+patient+tumor+complexity.">Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity.</a> Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+communication+in+brain+cancer.">Synaptic communication in brain cancer.</a> Cancer Research. 80 (14), 2979-2982 (2020).</li><li>Mount, C. W., Yal&#231;&#305;n, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+maps+brain-wide+afferent+oligodendrocyte+precursor+cell+connectivity.">Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity.</a> eLife. 18 (8), 49291 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+astrocyte-synapse+interactions+in+CNS+disorders.">Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders.</a> Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).</li><li>Neftel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+model+of+cellular+states,+plasticity,+and+genetics+for+glioblastoma.">An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma.</a> Cell. 178 (4), 835-849 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+remodeling+of+neural+circuits+in+the+human+brain+decreases+survival.">Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signaling+between+glioblastoma+stem+cells+and+differentiated+tumor+cells+promotes+malignant+progression.">Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+activity-regulated+neuroligin-3+dependency+in+high-grade+glioma.">Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma.</a> Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+glioma+growth+through+Neuroligin-3+secretion.">Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion.</a> Cell. 161 (4), 803-816 (2015).</li><li>Buckingham, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+by+primary+brain+tumors+induces+epileptic+activity.">Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).</li><li>Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glioma+cells+induce+hyperexcitability+in+cortical+networks.">Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks.</a> Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchannel+patterning+strategies+for+in+vitro+structural+connectivity+modulation+of+neural+networks.">Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpiCoDyn:+A+toolbox+for+the+analysis+of+neuronal+network+dynamics+and+connectivity+from+multi-site+spike+signal+recordings.">SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).</li><li>Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+neurite+guidance+to+study+structure-function+relationships+in+topologically-complex+population-based+neural+networks.">Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks.</a> Scientific Reports. 6, 28384 (2016).</li><li>Nguyen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+transcriptional+and+metabolic+responses+of+pediatric+high+grade+gliomas+to+mTOR-HIF-1&#945;+axis+inhibition.">Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1&#945; axis inhibition.</a> Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Cerea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+intracellular+delivery+and+intracellular+recordings+combined+in+MEA+biosensors.">Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors.</a> Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).</li><li>Bruno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multielectrode+arrays+for+spatially+localized+drug+delivery+and+electrical+recordings+of+primary+neuronal+cultures.">Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+chamber+technology+as+building+blocks+for+a+standardized+brain+on+chip+framework.">Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).</li><li>Andreiuk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+polymer+nanoparticles+for+cell+barcoding+in+vitro+and+in+vivo.">Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo.</a> Small. 13 (38), (2017).</li></ol>

Dette arbeidet beskriver en nøyaktig funksjonell in vitro-modell for å evaluere samspillet mellom humane hiPS-avledede kortikale glutamatergeiske nevroner og hjernesvulstceller i mikrofluidiske enheter. Et av de avgjørende trinnene i den nåværende protokollen var hiPS-differensiering i glutamatergiske nevroner, som ble bekreftet av nedgangen i Nestin og Sox2 immunfluorescent farging og samtidig utseende av mGluR2 og vGLUT1 farging. Likevel forble få nevrale forfedre som bare halvparten av glutamatergiske c...

Pediatriske høygradige gliomer (pHGG) viser et utvidet genotypisk og fenotypisk mangfold avhengig av pasientalder, tumoranatomisk plassering og forlengelse og molekylære drivere1. De er aggressive hjernesvulster som er dårlig kontrollert med de tilgjengelige behandlingsalternativene og er den ledende dødsårsaken relatert til hjernekreft hos barn og ungdom2. Så, mer enn 80% av pasientene går tilbake innen 2 år etter diagnosen, og deres median overlevelse er 9-15 måneder, avhengig av hjerneplasseringer og drivermutasjoner. Fraværet av kurativ behandling er den primære trangen til laboratorieforskning og fremhever det umiddelbare behovet for nye innovative terapeutiske tilnærminger. Til dette formål ble pasientavledede cellelinjer (PDCL) utviklet med håp om å gi pHGG-mangfoldet3 i todimensjonale (2D) linjer og / eller tredimensjonale (3D) nevrosfærer. Likevel etterligner de pasientavledede in vitro-cellekulturene ikke alle hjernevariable situasjoner. Disse modellene anser ikke de makroskopiske og mikroskopiske nevroanatomiske miljøene som vanligvis er beskrevet i pHGG.
Vanligvis utvikler pHGG hos yngre barn hovedsakelig i pontin- og thalamic-regioner, mens ungdom og unge voksnes HGG konsentrerer seg i de kortikale områdene, spesielt i frontotemporale lobes1. Disse stedsspesifiktitetene på tvers av barnealder ser ut til å innebære forskjellige miljøer som fører til gliomagenese og et intricating nettverk mellom tumorceller og spesifikk nevronal aktivitet4,5,6. Selv om mekanismer fortsatt ikke er identifisert, utvikler pHGG hovedsakelig fra nevrale forløperceller langs differensieringsbanen til astrogliale og oligodendrogliale avledninger. Mens rollen til disse glial avstamningene lenge har vært begrenset til enkel strukturell støtte for nevroner, er det nå klart fastslått at de integreres helt i nevrale kretser og viser komplekse toveis glial-neuronale interaksjoner som er i stand til å omorganisere strukturelle regioner i hjernen og omdanne nevronale kretser4,7,8 . Videre indikerer økende mengder bevis at sentralnervesystemet (CNS) spiller en kritisk rolle i hjernekreftinitiering og progresjon. Nyere arbeider fokusert på nevronaktivitet, som ser ut til å drive vekst og mitose av glial malignitet gjennom utskilte vekstfaktorer og direkte elektrokjemisk synaptisk kommunikasjon6,9. Reciprocally, høyverdige gliomaceller ser ut til å påvirke nevronfunksjonen med en økende glutamatergisk nevronaktivitet og modulere driften av kretsene de er strukturelt og elektrisk integrert9. Så studier ved hjelp av pasientavledede modeller og nye nevrovitenskapelige verktøy som kontrollerer nevronvirkning viste en kretsspesifikk effekt av nevronaktivitet på gliomaplassering, vekst og progresjon. De fleste av disse nevronale projeksjonene involvert i gliomer er glutamatergiske og kommuniserer gjennom glutamatsekretjoner. Spesifikke glutamatergiske biomarkører som mGluR2 eller vGlut1/2 er ofte beskrevet6.
Interessant, til tross for deres molekylære heterogenitet, viser pediatriske og voksne høyverdige gliomer en typisk proliferativ respons på glutamatergisk nevronaktivitet og andre utskilte faktorer som nevroligin-3 eller BDNF (hjerneavledet nevrotrofisk faktor)4,6,10,11,12,13 . I kortikale regioner kan pediatriske og voksne HGG-er indusere nevronal hypereksitabilitet gjennom økt glutamatsekresjon og hemme GABA-internuroner som fører til gliomer forbundet med epileptisk nettverksaktivitet14,15. På toppen av det kan nevrale kretser ombygges av gliomer som skyver spesifikke nevrologiske oppgaver, for eksempel språk, og kan rekvirere ytterligere organisert nevronaktivitet9.
Basert på denne begrunnelsen må det å fremme forståelsen av toveis kommunikasjon mellom gliomaceller og nevroner være fullt belyst og integrert med de tidlige stadiene av in vitro pHGG-tilnærminger. Slik innovativ modellering er avgjørende for å forstå og måle den nevronale elektriske aktivitetspåvirkningen under legemiddeltesting og forutse pHGG-respons i hjernekretser. Den siste utviklingen innen nevrovitenskapelige verktøy, som mikrofluidiske enheter og pHGG-forskningsarbeider, er sengen for å utvikle nye modelleringsmetoder og nå kunne integrere hjernemikromiljø i in vitro pHGG-modeller3,16,17,18,19. Kombinert med elektrofysiologiske opptak ved hjelp av multielektrorode arrays (MEA), tilbyr mikrofluidiske enheter20,21,22 muligheten til å etterligne fysiologiske forhold mens du registrerer den elektriske aktiviteten til hele nevrale nettverket og trekker ut nettverkstilkoblingsparametere under flere forhold. Denne enheten23,24 tillater først presis avsetning av celler i et kammer direkte på MEA. Denne teknologien muliggjør kontroll av cellesåingstetthet og homogenitet på MEA og den fine kontrollen av medieutveksling, noe som er et kritisk skritt for menneskelig nevral forfederdifferensiering direkte i enheter. Videre kan det nåværende avsetningskammeret bli sådd med flere celler på forskjellige tidspunkter.
Så denne studien hadde som mål å utvikle en funksjonell in vitro-modell som kokulturerer menneskelige Pluripotent Stem (hiPS)-avledede kortikale glutamatergiske nevroner og pHGG-avledede celler i mikrofluidiske enheter og registrerer deres elektriske aktivitet for å evaluere elektriske interaksjoner mellom begge cellepopulasjonene. For det første ble hiPS-avledede kortikale glutamaterge nevroner oppnådd og karakterisert i mikrofluidiske enheter på forskjellige stadier av kulturen [dag 4 (D4), som hiPS-celler, og dag 21 (D21) og dag 23 (D23), som glutamatergic modne nevroner]. For det andre trinnet i co-kultur ble to pHGG-modeller brukt: kommersialisert pediatrisk UW479-linje og pHGG-celler initiert fra en pasientsvulst (BT35)3, med en H3.3 K27M drivermutasjon. Til slutt utførte vi elektrofysiologiske opptak av glutamatergiske celler ved D21 før pHGG cellesåing og D23 etter 48 h medkultur i samme mikrofluidiske enhet. Interaksjonene mellom glutamatergeiske nevroner og pHGG-celler var preget av en betydelig økning i den registrerte elektrofysiologiske aktiviteten.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td >MCS</td>
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >53750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >51999</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accutase</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6964</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ala -Gln (GlutaMAX)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G8541</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axel Observer 7 Microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >431007-9904-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon&#174;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >353109</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >HERASafe type KS12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Colibri 7 LED</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >4230529710-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >
			<div>Cortical Glutamatergic Neurons</div>
			</td>
			<td >BrainXell</td>
			<td >BX-0300</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31331-028</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12 Medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8437</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS 1X</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >L0615-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasYFlaskTM&#160;cell culture flasks 75cm3</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >500105</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Geltrex</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A1413201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Memmert</td>
			<td >IC0150med</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MCS InterFace Boarder</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEA2100</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P10</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729020</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P100</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P1000</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729070</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P200</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729060</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >33290</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiChannel Experimenter</td>
			<td >MCS</td>
			<td >-</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N2 Supplement-A</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >7152</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal Medium</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21103049</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurocult SM1 neuronal supplement</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >5711</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 0.1 - 10 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >030570ACL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 1 - 200 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >032260CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 50 - 1250 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >134760CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >X0557-100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >4000202/4038202</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 10 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357551</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 5 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357543</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plaque chauffante (CultureTemp)</td>
			<td >Belart</td>
			<td >370151000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6407</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primovert microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >415510-1100-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scepter (Handheld Automated Cell Counter)</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >PHCC00000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TGF-&#946;1</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >100-21C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352070</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions

Pediatriske høygradede gliomer (pHGG) representerer hjernekreft i barndommen og ungdommen som bærer en rask dyster prognose. Siden det er behov for å overvinne motstanden mot dagens behandlinger og finne en ny måte å kurere på, er det svært krevende å modellere sykdommen så nært som mulig i en in vitro-setting for å teste nye legemidler og terapeutiske prosedyrer. Å studere deres grunnleggende patologiske prosesser, inkludert glutamatergic neuron hyperexcitability, vil være et reelt fremskritt i å forstå interaksjoner mellom miljøhjernen og pHGG-cellene. Derfor, for å gjenskape nevroner / pHGG celleinteraksjoner, viser dette arbeidet utviklingen av en funksjonell in vitro-modell som kokulturerer menneskeskapte Pluripotent Stem (hiPS)-avledede kortikale glutamatergiske nevroner pHGG-celler i inndelte mikrofluidiske enheter og en prosess for å registrere deres elektrofysiologiske modifikasjoner. Det første trinnet var å skille og karakterisere menneskelige glutamatergiske nevroner. For det andre ble cellene dyrket i mikrofluidiske enheter med pHGG-avledede cellelinjer. Hjernemikromiljø og nevronaktivitet ble deretter inkludert i denne modellen for å analysere den elektriske effekten av pHGG-celler på disse mikro-miljømessige nevronene. Elektrofysiologiske opptak kombineres ved hjelp av multielektrorode arrays (MEA) til disse mikrofluidiske enhetene for å etterligne fysiologiske forhold og for å registrere den elektriske aktiviteten til hele nevralnettverket. En betydelig økning i nevron spenning ble understreket i nærvær av tumorceller.

Før du studerte elektriske interaksjoner mellom glutamatergiske nevroner og gliomaceller, ble hiPS-avledede kortikale glutamatergiske nevroner karakterisert for å validere muligheten for å dyrke dem i mikrofluidiske enheter (figur 1A). Karakteriseringen ble vurdert ved hjelp av Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotrope glutamatreseptorer 2) og vGLUT1-immunisering, representert i figur 1A(2-7). Siden Nestin er et mellomliggen...

Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Nyere arbeider avdekker nevronal innvirkning på høyverdige pediatriske gliomceller (pHGG) og deres gjensidige interaksjoner. Det nåværende arbeidet viser utviklingen av en in vitro-modell som kokulturerer pHGG-celler og glutamatergeiske nevroner og registrerte deres elektrofysiologiske interaksjoner for å etterligne disse interaktivitetene.

Samkultur av glutamatergeiske nevroner og pediatriske gliomaceller av høy kvalitet til mikrofluidiske enheter for å vurdere elektriske interaksjoner

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Interaksjonene mellom de ondartede gliomacellene og deres omkringliggende nevroner får interesse. Her viser vi utviklingen av en in vitro-modell som kokulturerer avledede kortikale glutamatergeiske nevroner og tumorceller. De mikrofludiske enhetene som brukes til samkulturer koblet til multielektrode arrays tillater studiet av forskjellige celletyper og utfører elektriske aktivitetsopptak på forskjellige tidspunkter i kulturene.Denne metoden er spesielt nyttig for funksjonelle og mekanistiske studier og for å analysere effekten av farmakologiske midler som blokkerer pediatrisk høyverdig gliomacellemigrasjon og interaksjon med nevroner. For å begynne å dyrke de kommersialiserte humane IPS-avledede kortikale glutamatergiske nevronene, tøm innløps- og utløpsreservoarene til den mikrofluidiske enheten ved pipetteaspirasjon, slik at bare enhetskanalene fylles med medium. Frø de menneskelige IPS-cellene ved å legge til 10 mikroliter 6,5 millioner menneskelige IPS-celler per milliliterfjæring i mediet og la enheten være under hetten i 15 minutter for å la cellene feste seg.Etter 15 minutter fyller du både innløps- og utløpsreservoarer med 50 mikroliter av dag fire kulturmedium, og overfør deretter enheten til inkubatoren for å opprettholde cellene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 23 dager. Erstatt mediet hver tredje til fjerde dag som beskrevet i teksten. For å telle cellene og vurdere levedyktighet ved hjelp av et standard fasekontrastmikroskop, ta mikroskopiske bilder på fjerde dag, 21.Kultur både UW479 og BT35 cellelinjer i DMEM og F-12 GlutaMAX supplert med 10% fetal bovint serum i en cellekulturflaske. Opprettholde cellekultur under et kontrollert miljø ved 37 grader Celsius under normoksiske forhold gjennom hele eksperimentet. Vær oppmerksom på hver cellelinje for å nå 80 % samløp.På dag 21 postkultur av glutamatergic nevroner, start co-kultur ved å prøve UW479 og BT35 celler. Frø trypsinized UW479 og BT35 celler på toppen av modne tilhenger glutamatergic nevroner i hver dedikert mikrofluidisk enhet. Oppretthold samkulturene i to dager under et kontrollert miljø ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid med glutamatergisk nevron D11 og videre medium.Tell pediatriske gliomaceller av høy kvalitet ved hjelp av de mikroskopiske bildene analysert med bildeanalyseprogramvaren for å vurdere deres levedyktighet og beregne prosentandelen av celler. Plasser MFD i opptaksenheten og bruk en kommersielt tilgjengelig programvare for å utføre elektrofysiologisk opptak av glutamatergiske nevroner den 21. Før såing pediatriske høyverdige gliomaceller, utfør en annen elektrofysiologisk registrering av de differensierte glutamatergiske nevronene dyrket som kontroll parallelt med medkulturen.Utfør et annet elektrofysiologisk opptak den 23. Humane IPS-avledede kortikale glutamaterge nevroner ble karakterisert og vurdert ved hjelp av nestin, SOX2, metabotrope glutamatreseptorer II og VGLUT1 immunstaining. Nestin er et mellomliggende filamentprotein og det ble uttrykt i undifferentiated CNS-celler.SOX2 ble også uttrykt i uavklarte celler i nevral epitel i CNS. Nestin og SOX2-positive celler prosent redusert fra fjerde dag til den 21. De mikroskopiske bildene avslørte en progressiv fordeling av glutamatergiske nevroner på tvers av mikrofluidiske enheter.Da BT35 og UW479 ble lagt til kulturen, ble det observert at de flytende cellene var til stede etter gliomacellesåing den 21. Prosentandelene av levedyktige celler for BT35 og UW479 var sammenlignbare og antydet at pasientavledede cellelinjer kunne brukes på riktig måte. Spike deteksjon og raster plott på den 23rd dagen av kulturen viste økt elektrisk aktivitet etter å ha lagt pediatriske høyverdige glioma celler.For å overvåke synkroniteten til nevral nettverksaktivitet ble den øyeblikkelige avfyringshastigheten i BT35 eller glutamatergiske nevroner registrert. Forskjellen i elektrisk aktivitet mellom de individuelt dyrkede og samkulturerte glutamatergiske nevronene var signifikant den 23. Videre metodisk utvikling kan omfatte den funksjonelle vurderingen av nettverket med burstanalyse og spesielle tidsmessige krysskorrelasjoner i nettverket.Nå har forskere et lovende verktøy for å utforske interaksjoner og farmakologisk målretting av pediatriske høyverdige glioma tumorlinjer og høye PSC-nevroner. Flere tumorlinjer og flere nevrontyper kan brukes.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantasjon av Zebrafish Pediatric Brain Tumors til Immun-kompetente verter for langvarig studie av Tumor Cell Behavior og Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattende protokoll for å prøve og prosessen benmarg for å måle målbare gjenværende sykdom og Leukemic stamceller i akutt myelogen leukemi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal stamceller isolert fra cellulose vev og co kultur kreftceller å studere deres samhandling

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Evaluering av Biomarkers i Glioma av immunhistokjemi på parafin-Embedded 3D Glioma Neurosphere kulturer

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Måle beinremodellering og gjenskape tumor-bone mikromiljøet ved hjelp av Calvaria co-kultur og histomorfometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Samkultur av Glioblastoma stamceller på mønstrede nevroner for å studere migrasjon og cellulære interaksjoner

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

En arbeidsflyt for rask screening for å identifisere potensiell kombinasjonsterapi for GBM ved bruk av pasientavledede gliomastammeceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Live-3D-celle immunocytokjemi analyser av pediatrisk diffus midtlinje gliom

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generering og dyrking av høygradig serøs eggstokkreft Pasientavledede organoider

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Optimalisering av ytelsesparametere for TAGGG-telomerlengdeanalysen

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...