Name: co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios do programa Satt Conectus, Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», "Franck, Rayon de Soleil" e "Semeurs d'Etoile". Agradecemos às crianças e famílias afetadas pelos HGGs por suas contribuições para esta pesquisa e seu apoio.

Para este protocolo, o número de credenciamento relacionado ao uso de materiais humanos é DC-2020-4203.
1. Fabricação, preparação e tratamento de dispositivos microfluidos
<ol><li>Fabricar moldes SU-8 utilizando técnicas de fotolitografia convencionais18. NOTA: Para isso, duas máscaras fotolitografia foram projetadas para construir duas camadas de estruturas fotoresististas no substrato de wafer de silício e uma fina camada fotoresista SU-8 2005 (3,2 μ m ...

<ol>
	<li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+molecular+meta-analysis+of+1,000+pediatric+high-grade+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alex's+lemonade+stand+foundation+infant+and+childhood+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011.">Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).</li><li>Blandin, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+environment+and+paired+hierarchical+3D+and+2D+models+of+pediatric+H3.3-mutated+gliomas+recreate+the+patient+tumor+complexity.">Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity.</a> Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+communication+in+brain+cancer.">Synaptic communication in brain cancer.</a> Cancer Research. 80 (14), 2979-2982 (2020).</li><li>Mount, C. W., Yal&#231;&#305;n, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+maps+brain-wide+afferent+oligodendrocyte+precursor+cell+connectivity.">Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity.</a> eLife. 18 (8), 49291 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+astrocyte-synapse+interactions+in+CNS+disorders.">Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders.</a> Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).</li><li>Neftel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+model+of+cellular+states,+plasticity,+and+genetics+for+glioblastoma.">An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma.</a> Cell. 178 (4), 835-849 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+remodeling+of+neural+circuits+in+the+human+brain+decreases+survival.">Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signaling+between+glioblastoma+stem+cells+and+differentiated+tumor+cells+promotes+malignant+progression.">Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+activity-regulated+neuroligin-3+dependency+in+high-grade+glioma.">Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma.</a> Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+glioma+growth+through+Neuroligin-3+secretion.">Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion.</a> Cell. 161 (4), 803-816 (2015).</li><li>Buckingham, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+by+primary+brain+tumors+induces+epileptic+activity.">Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).</li><li>Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glioma+cells+induce+hyperexcitability+in+cortical+networks.">Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks.</a> Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchannel+patterning+strategies+for+in+vitro+structural+connectivity+modulation+of+neural+networks.">Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpiCoDyn:+A+toolbox+for+the+analysis+of+neuronal+network+dynamics+and+connectivity+from+multi-site+spike+signal+recordings.">SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).</li><li>Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+neurite+guidance+to+study+structure-function+relationships+in+topologically-complex+population-based+neural+networks.">Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks.</a> Scientific Reports. 6, 28384 (2016).</li><li>Nguyen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+transcriptional+and+metabolic+responses+of+pediatric+high+grade+gliomas+to+mTOR-HIF-1&#945;+axis+inhibition.">Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1&#945; axis inhibition.</a> Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Cerea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+intracellular+delivery+and+intracellular+recordings+combined+in+MEA+biosensors.">Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors.</a> Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).</li><li>Bruno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multielectrode+arrays+for+spatially+localized+drug+delivery+and+electrical+recordings+of+primary+neuronal+cultures.">Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+chamber+technology+as+building+blocks+for+a+standardized+brain+on+chip+framework.">Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).</li><li>Andreiuk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+polymer+nanoparticles+for+cell+barcoding+in+vitro+and+in+vivo.">Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo.</a> Small. 13 (38), (2017).</li></ol>

Este trabalho descreve um modelo in vitro funcional preciso para avaliar a interação entre neurônios glutamatergicos cortical derivados do hiPS humano e células tumorais cerebrais em dispositivos microfluidos. Um dos passos cruciais no presente protocolo foi a diferenciação hiPS em neurônios glutamatericos, o que foi confirmado pela diminuição da coloração imunofluorescente Nestin e Sox2 e aparência simultânea da coloração mGluR2 e vGLUT1. No entanto, poucos progenitores neurais permaneceram como ...

Os gliomas pediátricos de alto grau (pHGG) apresentam uma diversidade genotípica e fenotípica estendida, dependendo da idade do paciente, localização e extensão anatômicas do tumor e drivers moleculares1. São tumores cerebrais agressivos que são mal controlados com as opções de tratamento disponíveis atualmente e são a principal causa de morte relacionada a cânceres cerebrais em crianças e adolescentes2. Assim, mais de 80% dos pacientes estão recaídas dentro de 2 anos após seu diagnóstico, e sua sobrevida mediana é de 9 a 15 meses, dependendo das localizações cerebrais e mutações do motorista. A ausência de tratamento curativo é o principal impulso para pesquisas laboratoriais e destaca a necessidade imediata de novas abordagens terapêuticas inovadoras. Para isso, as linhas celulares derivadas do paciente (PDCL) foram desenvolvidas com a esperança de fornecer a diversidade pHGG3 em linhas bidimensionais (2D) e/ou neuroesferas tridimensionais (3D). No entanto, essas culturas celulares in vitro derivadas do paciente não imitam todas as situações variáveis cerebrais. Esses modelos não consideram os ambientes neuroscópicos e microscópicos macroscópicos tipicamente descritos no pHGG.
Normalmente, o pHGG em crianças mais jovens está se desenvolvendo principalmente em regiões pontinas e talámicas, enquanto o HGG de adolescentes e jovens adultos se concentra nas áreas corticais, especialmente nos lobos frontotemporâneos1. Essas especificidades de localização em idades pediátricas parecem envolver diferentes ambientes que levam à gliomagênese e a uma rede metiço entre células tumorais e atividade neuronal específica4,5,6. Embora os mecanismos ainda não sejam identificados, o pHGG desenvolve-se principalmente a partir de células precursoras neurais ao longo da trajetória de diferenciação das linhagens astroglial e oligodendroglial. Embora o papel dessas linhagens gliais tenha sido por muito tempo restrito ao simples suporte estrutural para os neurônios, agora está claramente estabelecido que eles se integram inteiramente em circuitos neurais e exibem complexas interações gliais-neuronais complexas capazes de reorganizar regiões estruturais do cérebro e remodelar circuitos neuronais4,7,8 . Além disso, o aumento de fragmentos de evidências indica que o sistema nervoso central (SNC) desempenha um papel crítico na iniciação e progressão do câncer cerebral. Trabalhos recentes se concentraram na atividade neuronal, que parece impulsionar o crescimento e a mitose das malignidades gliais através de fatores de crescimento secretados e comunicações sinápticas eletroquímicas diretas6,9. Reciprocamente, as células de glioma de alto grau parecem influenciar a função neuronal com uma atividade neuronal glutamatergic crescente e modular o funcionamento dos circuitos nos quais estão estruturalmente e eletricamente integrados9. Assim, estudos usando modelos derivados do paciente e novas ferramentas de neurociência que controlam a ação dos neurônios demonstraram um efeito específico do circuito da atividade neuronal na localização, crescimento e progressão do glioma. A maioria dessas projeções neuronais envolvidas em gliomas são glutamatergicas e se comunicam através de secreções de glutamato. Biomarcadores glutamérgicos específicos, como mGluR2 ou vGlut1/2, são comumente descritos6.
Curiosamente, apesar de sua heterogeneidade molecular, gliomas pediátricos e adultos de alto grau mostram uma resposta proliferativa típica à atividade neuronal glutamatergica e outros fatores secretados como neuroligina-3 ou BDNF (fator neurotrófico derivado do cérebro)4,6,10,11,12,13 . Nas regiões corticais, os HGGs pediátricos e adultos podem induzir a hiperexcitabilidade neuronal através de uma secreção de glutamato aumentada e inibir interneurônios GABA que levam a gliomas associados à atividade da rede epiléptica14,15. Além disso, circuitos neurais podem ser remodelados por gliomas empurrando tarefas neurológicas específicas, por exemplo, linguagem, e podem requisitar atividades neuronais organizadas adicionais9.
Com base nessa lógica, o avanço da compreensão das comunicações bidirecionais entre células glioma e neurônios deve ser totalmente elucidado e integrado com os estágios iniciais das abordagens in vitro pHGG. Tal modelagem inovadora é crucial para entender e medir o impacto da atividade elétrica neuronal durante o teste de drogas e antecipar a resposta do PHGG em circuitos cerebrais. Desenvolvimentos recentes em ferramentas de neurociência, como dispositivos microfluidos e trabalhos de pesquisa pHGG, são o leito para desenvolver novas abordagens de modelagem e agora ser capaz de integrar o microambiente cerebral em modelos in vitro pHGG3,16,17,18,19. Juntamente com gravações eletrofisiológicas usando matrizes multieletrônicas (MEA), dispositivos microfluidos20,21,22 oferecem a possibilidade de imitar condições fisiológicas ao registrar a atividade elétrica de toda a rede neural e extrair parâmetros de conectividade de rede em várias condições. Este dispositivo23,24 permite primeiro a deposição precisa de células em uma câmara diretamente no MEA. Esta tecnologia permite o controle da densidade de semeadura celular e homogeneidade no MEA e o controle fino da troca de mídia, que é um passo crítico para a diferenciação de progenitores neurais humanos diretamente em dispositivos. Além disso, a atual câmara de deposição pode ser semeada com múltiplas células em diferentes pontos de tempo.
Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver um modelo in vitro funcional co-culminando neurônios glutamatergicos derivados do padrão pluripotente (hiPS) derivados de neurônios glutamatergicos derivados e células derivadas do pHGG em dispositivos microfluidos e registrando sua atividade elétrica para avaliar interações elétricas entre ambas as populações celulares. Primeiro, os neurônios glutamatericos cortical derivados do hiPS foram obtidos e caracterizados em dispositivos microfluidos em diferentes estágios da cultura [dia 4 (D4), como células hiPS, e dia 21 (D21) e dia 23 (D23), como neurônios amadurecidos glutamater]. Para a segunda etapa da cocultura, foram utilizados dois modelos pHGG: a linha UW479 pediátrica comercializada e as células pHGG iniciadas a partir de um tumor do paciente (BT35)3, com uma mutação do driver H3.3 K27M. Finalmente, realizamos gravações eletrofisiológicas de células glutamatergicas em D21 antes da semeadura celular pHGG e D23 após 48 h de co-cultura no mesmo dispositivo microfluido. As interações entre neurônios glutamatergicos e células pHGG foram caracterizadas por um aumento significativo na atividade eletrofisiológica registrada.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td >MCS</td>
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >53750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >51999</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accutase</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6964</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ala -Gln (GlutaMAX)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G8541</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axel Observer 7 Microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >431007-9904-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon&#174;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >353109</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >HERASafe type KS12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Colibri 7 LED</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >4230529710-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >
			<div>Cortical Glutamatergic Neurons</div>
			</td>
			<td >BrainXell</td>
			<td >BX-0300</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31331-028</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12 Medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8437</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS 1X</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >L0615-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasYFlaskTM&#160;cell culture flasks 75cm3</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >500105</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Geltrex</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A1413201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Memmert</td>
			<td >IC0150med</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MCS InterFace Boarder</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEA2100</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P10</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729020</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P100</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P1000</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729070</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P200</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729060</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >33290</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiChannel Experimenter</td>
			<td >MCS</td>
			<td >-</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N2 Supplement-A</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >7152</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal Medium</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21103049</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurocult SM1 neuronal supplement</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >5711</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 0.1 - 10 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >030570ACL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 1 - 200 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >032260CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 50 - 1250 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >134760CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >X0557-100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >4000202/4038202</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 10 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357551</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 5 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357543</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plaque chauffante (CultureTemp)</td>
			<td >Belart</td>
			<td >370151000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6407</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primovert microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >415510-1100-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scepter (Handheld Automated Cell Counter)</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >PHCC00000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TGF-&#946;1</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >100-21C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
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co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions

gliomas pediátricos de alto grau (pHGG) representam cânceres cerebrais infantis e adolescentes que carregam um rápido prognóstico sombrio. Uma vez que há a necessidade de superar a resistência aos tratamentos atuais e encontrar uma nova forma de cura, modelar a doença o mais próximo possível em um ambiente in vitro para testar novas drogas e procedimentos terapêuticos é altamente exigente. Estudar seus processos patobiológicos fundamentais, incluindo a hiperexcitabilidade do neurônio glutamtergógico, será um verdadeiro avanço na compreensão das interações entre o cérebro ambiental e as células pHGG. Portanto, para recriar as interações de neurônios/células pHGG, este trabalho mostra o desenvolvimento de um modelo in vitro funcional co-culturando tronco pluripotente induzido por humano (hiPS) neurônios glutamatericos derivados pHGG células pHGG em dispositivos microfluidos compartimentalizados e um processo para registrar suas modificações eletrofisiológicas. O primeiro passo foi diferenciar e caracterizar neurônios glutamatericos humanos. Em segundo lugar, as células foram cultivadas em dispositivos microfluidos com linhas celulares derivadas pHGG. O microambiente cerebral e a atividade neuronal foram então incluídos neste modelo para analisar o impacto elétrico das células pHGG nesses neurônios microambientes. Gravações eletrofisiológicas são acopladas usando matrizes multielerodas (MEA) a esses dispositivos microfluidos para imitar condições fisiológicas e registrar a atividade elétrica de toda a rede neural. Um aumento significativo da excitabilidade dos neurônios foi sublinhado na presença de células tumorais.

Antes de estudar as interações elétricas entre neurônios glutamatergicos e células glioma, os neurônios glutamatergicos cortical derivados do hiPS foram caracterizados para validar a viabilidade de culminá-los em dispositivos microfluidos (Figura 1A). Sua caracterização foi avaliada utilizando Nestin, Sox2, mGlurR2 (receptores metabotrópicos de glutamato 2), e imunostaining vGLUT1, representado na Figura 1A(2-7)</strong...

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Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Trabalhos recentes revelam o impacto neuronal em células de glioma pediátrico de alto grau (pHGG) e suas interações recíprocas. O presente trabalho mostra o desenvolvimento de um modelo in vitro co-culminando células pHGG e neurônios glutamatergicos e registrou suas interações eletrofisiológicas para imitar essas interatividades.

Co-cultura de neurônios glutamatergicos e células glioma pediátricas de alto grau em dispositivos microfluidos para avaliar interações elétricas

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

As interações entre as células malignas do glioma e seus neurônios circundantes estão ganhando interesse. Aqui, mostramos o desenvolvimento de um modelo in vitro co-culminando neurônios glutamatericos derivados e células tumorais. Os dispositivos microfluidos usados para co-culturas acoplado a matrizes multieletrísicas permitem o estudo de diferentes tipos de células e realizam registros de atividade elétrica em diferentes pontos de tempo das culturas.Este método é particularmente útil para estudos funcionais e mecanicistas e para a análise dos efeitos de agentes farmacológicos que bloqueiam a migração celular pediátrica de alto grau e a interação com os neurônios. Para começar a culminar os neurônios glutamatericos cortical derivados do IPS humano comercializados, esvazie os reservatórios de entrada e saída do dispositivo microfluido por aspiração de pipeta, permitindo que apenas os canais do dispositivo sejam preenchidos com meio. Semear as células IPS humanas adicionando 10 microlitrais de 6,5 milhões de células IPS humanas por suspensão mililitro no meio e deixar o dispositivo ficar sob o capô por 15 minutos para permitir que as células se conectem.Após 15 minutos, encha tanto os reservatórios de entrada quanto os reservatórios de saída com 50 microliters do quarto dia de cultura média, em seguida, transfira o dispositivo para a incubadora para manter as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 23 dias. Substitua o meio a cada três ou quatro dias, conforme descrito no texto. Para contar as células e avaliar a viabilidade usando um microscópio de contraste de fase padrão, tire fotos microscópicas no 4º dia, 21º dia e 23º dia.Cultura tanto as linhas celulares UW479 quanto BT35 em DMEM e F-12 GlutaMAX suplementadas com soro bovino 10% fetal em um frasco de cultura celular. Manter a cultura celular sob um ambiente controlado a 37 graus Celsius em condições normóxias durante todo o experimento. Observe cada linha celular para atingir 80% de confluência.No dia 21 pós-cultura de neurônios glutamatericos, comece a co-cultura experimentando células UW479 e BT35. Semente as células UW479 e BT35 experimentadas em cima dos neurônios glutamatericos adeptos maduros em cada dispositivo microfluido dedicado. Mantenha as co-culturas por dois dias sob um ambiente controlado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com neurônio glutamatergic D11 e meio em diante.Conte células de glioma pediátricas de alto grau usando as imagens microscópicas analisadas com o software de análise de imagens para avaliar sua viabilidade e calcular a porcentagem de células. Coloque o MFD no dispositivo de gravação e use um software comercialmente disponível para realizar o registro eletrofisiológico de neurônios glutamatericos no 21º dia. Antes de semear células de glioma pediátricas de alto grau, realize um segundo registro eletrofisiológico dos neurônios glutamatergicos diferenciados cultivados como controle paralelo à co-cultura.Realize outra gravação eletrofisiológica no dia 23 após dois dias da co-cultura. Os neurônios glutaméricos cortical derivados do IPS humano foram caracterizados e avaliados usando nestin, SOX2, receptores de glutamato metabotrópico II e imunostaining VGLUT1. Nestin é uma proteína de filamento intermediário e foi expressa em células CNS indiferenciadas.SOX2 também foi expresso em células indiferenciadas do epitélio neural em CNS. A porcentagem de células nestin e SOX2-positivas diminuiu do quarto dia para o 21º dia, confirmando o estado diferenciado dos neurônios glutamatericos. As imagens microscópicas revelaram uma distribuição progressiva de neurônios glutamatericos através de dispositivos microfluidos.Quando BT35 e UW479 foram adicionados à cultura, observou-se que as células flutuantes estavam presentes após a semeadura de células glioma no 21º dia, que progressivamente desapareceu até o 23º dia e se tornou aderente no dispositivo. As porcentagens de células viáveis para BT35 e UW479 foram comparáveis e implicaram que as linhas celulares derivadas do paciente poderiam ser usadas adequadamente. A detecção de picos e o enredo raster no 23º dia de cultura mostraram aumento da atividade elétrica depois de adicionar células de glioma pediátricas de alto grau.Para monitorar a sincronicidade da atividade da rede neural, foi registrada a taxa de disparo instantânea em neurônios BT35 ou glutamatergic. A diferença na atividade elétrica entre os neurônios glutamatergicos individualmente cultivados e co-cultivados foi significativa no 23º dia. O desenvolvimento metodológico adicional pode incluir a avaliação funcional da rede com análise de estouro e correlações interversais temporais especiais da rede.Agora, os pesquisadores têm uma ferramenta promissora para explorar interações e alvos farmacológicos de linhas de tumor glioma pediátrica de alto grau e neurônios altos do PSC. Várias linhas tumorais e vários tipos de neurônios podem ser usados.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplante de Tumores Cerebrais Pediátricos de Zebrafish em Hospedeiros Imune-competentes para Estudo a Longo Prazo do Comportamento de Células Tumorais e Resposta a Medicamentos

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Pesquisa do câncer

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido pulpar e co-cultura com células cancerosas para estudar suas interações

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Avaliação de biomarcadores em Glioma por imuno-histoquímica na parafina Glioma 3D Neurosphere culturas

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Medição da remodelagem óssea e recriação do microambiente tumor-osso usando a cocultura da Calvaria e a histomormormetria

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-cultura de células-tronco semelhantes ao Glioblastoma em neurônios padronizados para estudar migração e interações celulares

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Um fluxo de trabalho de triagem rápida para identificar terapia de combinação potencial para GBM usando células-tronco glioma derivadas do paciente

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Ensaios de imunocitoquímica de células 3D vivas de glioma difuso da linha média pediátrica

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Geração e Cultivo de Organoides Derivados de Pacientes com Câncer de Ovário Seroso de Alto Grau

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Otimização dos parâmetros de desempenho do ensaio de comprimento telomérico TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...