Name: co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами программы Satt Conectus, Фонда Страсбургского университета, ассоциаций «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» и «Semeurs d'Etoile». Мы благодарим детей и семьи, пострадавшие от HGG, за их вклад в это исследование и их поддержку.

Для этого протокола номер аккредитации, связанный с использованием материалов человека, - DC-2020-4203.
1. Изготовление, подготовка и обработка микрофлюидных устройств
<ol><li>Изготовление пресс-форм СУ-8 с использованием обычных методов фотолитографии18. ПРИМЕЧАН?...

<ol>
	<li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+molecular+meta-analysis+of+1,000+pediatric+high-grade+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alex's+lemonade+stand+foundation+infant+and+childhood+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011.">Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).</li><li>Blandin, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+environment+and+paired+hierarchical+3D+and+2D+models+of+pediatric+H3.3-mutated+gliomas+recreate+the+patient+tumor+complexity.">Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity.</a> Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+communication+in+brain+cancer.">Synaptic communication in brain cancer.</a> Cancer Research. 80 (14), 2979-2982 (2020).</li><li>Mount, C. W., Yal&#231;&#305;n, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+maps+brain-wide+afferent+oligodendrocyte+precursor+cell+connectivity.">Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity.</a> eLife. 18 (8), 49291 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+astrocyte-synapse+interactions+in+CNS+disorders.">Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders.</a> Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).</li><li>Neftel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+model+of+cellular+states,+plasticity,+and+genetics+for+glioblastoma.">An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma.</a> Cell. 178 (4), 835-849 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+remodeling+of+neural+circuits+in+the+human+brain+decreases+survival.">Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signaling+between+glioblastoma+stem+cells+and+differentiated+tumor+cells+promotes+malignant+progression.">Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+activity-regulated+neuroligin-3+dependency+in+high-grade+glioma.">Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma.</a> Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+glioma+growth+through+Neuroligin-3+secretion.">Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion.</a> Cell. 161 (4), 803-816 (2015).</li><li>Buckingham, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+by+primary+brain+tumors+induces+epileptic+activity.">Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).</li><li>Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glioma+cells+induce+hyperexcitability+in+cortical+networks.">Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks.</a> Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchannel+patterning+strategies+for+in+vitro+structural+connectivity+modulation+of+neural+networks.">Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpiCoDyn:+A+toolbox+for+the+analysis+of+neuronal+network+dynamics+and+connectivity+from+multi-site+spike+signal+recordings.">SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).</li><li>Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+neurite+guidance+to+study+structure-function+relationships+in+topologically-complex+population-based+neural+networks.">Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks.</a> Scientific Reports. 6, 28384 (2016).</li><li>Nguyen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+transcriptional+and+metabolic+responses+of+pediatric+high+grade+gliomas+to+mTOR-HIF-1&#945;+axis+inhibition.">Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1&#945; axis inhibition.</a> Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Cerea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+intracellular+delivery+and+intracellular+recordings+combined+in+MEA+biosensors.">Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors.</a> Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).</li><li>Bruno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multielectrode+arrays+for+spatially+localized+drug+delivery+and+electrical+recordings+of+primary+neuronal+cultures.">Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+chamber+technology+as+building+blocks+for+a+standardized+brain+on+chip+framework.">Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).</li><li>Andreiuk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+polymer+nanoparticles+for+cell+barcoding+in+vitro+and+in+vivo.">Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo.</a> Small. 13 (38), (2017).</li></ol>

В этой работе описывается точная функциональная модель in vitro для оценки взаимодействия между кортикальными глутаматергическими нейронами человека, полученными из hiPS, и опухолевыми клетками головного мозга в микрофлюидных устройствах. Одним из важнейших шагов в настоящем проток?...

Педиатрические высокодифференцированные глиомы (pHGG) демонстрируют расширенное генотипическое и фенотипическое разнообразие в зависимости от возраста пациента, анатомического расположения и расширения опухоли, а также молекулярных драйверов1. Это агрессивные опухоли головного мозга, которые плохо контролируются с помощью доступных в настоящее время вариантов лечения и являются основной причиной смерти, связанной с раком мозга у детей и подростков2. Так, более 80% пациентов рецидивируют в течение 2 лет после постановки диагноза, а их медиана выживаемости составляет 9-15 месяцев, в зависимости от расположения мозга и мутаций водителя. Отсутствие лечебного лечения является основным стимулом для лабораторных исследований и подчеркивает непосредственную потребность в новых инновационных терапевтических подходах. С этой целью были разработаны клеточные линии, полученные от пациента (PDCL) с надеждой обеспечить разнообразие pHGG3 в двумерных (2D) линиях и / или трехмерных (3D) невросферах. Тем не менее, эти клеточные культуры in vitro, полученные от пациента, не имитируют все переменные ситуации мозга. Эти модели не учитывают макроскопические и микроскопические нейроанатомические среды, обычно описываемые в pHGG.
Обычно pHGG у детей младшего возраста в основном развивается в понтиновой и таламической областях, тогда как HGG подростков и молодых людей концентрируются в кортикальных областях, особенно в лобно-височных долях1. Эти особенности местоположения в педиатрическом возрасте, по-видимому, связаны с различными средами, приводящими к глиомагенезу и заглубляющей сети между опухолевыми клетками и специфической нейронной активностью4,5,6. Хотя механизмы до сих пор не идентифицированы, pHGG в основном развивается из нейронных клеток-предшественников по траектории дифференцировки астроглиальных и олигодендроглиальных линий. Хотя роль этих глиальных линий долгое время ограничивалась простой структурной поддержкой нейронов, в настоящее время четко установлено, что они полностью интегрируются в нейронные цепи и демонстрируют сложные двунаправленные глиально-нейрональные взаимодействия, способные реорганизовывать структурные области мозга и реконструировать нейронные схемы4,7,8 . Более того, увеличение количества доказательств указывает на то, что центральная нервная система (ЦНС) играет решающую роль в инициации и прогрессировании рака мозга. Последние работы были сосредоточены на активности нейронов, которая, по-видимому, стимулирует рост и митоз глиальных злокачественных новообразований через секретируемые факторы роста и прямые электрохимические синаптические коммуникации6,9. Взаимно, полноценные клетки глиомы, по-видимому, влияют на функцию нейронов с увеличением глутаматергической нейронной активности и модулируют работу цепей, в которые они структурно и электрически интегрированы9. Таким образом, исследования с использованием моделей, полученных от пациента, и новых инструментов нейробиологии, контролирующих действие нейронов, продемонстрировали специфическое для схемы влияние нейронной активности на расположение, рост и прогрессирование глиомы. Большинство из этих нейронных проекций, участвующих в глиомах, являются глутаматергическими и сообщаются через секрецию глутамата. Обычно описываются специфические глутаматергические биомаркеры, такие как mGluR2 или vGlut1/26.
Интересно, что, несмотря на свою молекулярную гетерогенность, детские и взрослые полноценные глиомы демонстрируют типичный пролиферативный ответ на глутаматергическую активность нейронов и другие секретируемые факторы, такие как нейролигин-3 или BDNF (нейротрофический фактор мозга)4,6,10,11,12,13 . В корковых областях детские и взрослые HGG могут индуцировать гипервозбудимость нейронов через повышенную секрецию глутамата и ингибировать интернейроны ГАМК, что приводит к глиомам, связанным с эпилептической сетевой активностью14,15. Кроме того, нейронные цепи могут быть реконструированы глиомами, подталкивающими конкретные неврологические задачи, например, язык, и могут реквизировать дополнительную организованную нейронную активность9.
Основываясь на этом обосновании, продвижение понимания двунаправленных связей между клетками глиомы и нейронами должно быть полностью выяснено и интегрировано с ранними стадиями подходов pHGG in vitro. Такое инновационное моделирование имеет решающее значение для понимания и измерения влияния электрической активности нейронов во время тестирования на наркотики и прогнозирования реакции pHGG в схему мозга. Последние разработки в области инструментов нейробиологии, такие как микрофлюидные устройства и исследовательские работы pHGG, являются основой для разработки новых подходов к моделированию и теперь могут интегрировать микросреду мозга в модели pHGG in vitro3,16,17,18,19. В сочетании с электрофизиологическими записями с использованием многоэлектродных массивов (MEA) микрофлюидные устройства20,21,22 предлагают возможность имитировать физиологические условия при записи электрической активности всей нейронной сети и извлекать параметры сетевой связности при нескольких условиях. Это устройство23,24 позволяет сначала точно наносить ячейки в камеру непосредственно на MEA. Эта технология позволяет контролировать плотность и однородность посева клеток на MEA и точно контролировать обмен средами, что является критическим шагом для дифференциации нейронных предшественников человека непосредственно в устройствах. Кроме того, настоящая камера осаждения может быть засеяна несколькими клетками в разные моменты времени.
Таким образом, это исследование было направлено на разработку функциональной модели in vitro , совместно культивирующей человеческие плюрипотентные стволовые (hiPS) корковые глутаматергические нейроны и клетки, полученные из pHGG, в микрофлюидные устройства и записывающую их электрическую активность для оценки электрических взаимодействий между обеими клеточными популяциями. Во-первых, кортикальные глутаматергические нейроны, полученные из hiPS, были получены и охарактеризованы в микрофлюидных устройствах на разных стадиях культивирования [день 4 (D4), как клетки hiPS, и день 21 (D21) и день 23 (D23), как глутаматергические зрелые нейроны]. Для второго этапа совместной культивирования использовались две модели pHGG: коммерциализированная педиатрическая линия UW479 и клетки pHGG, инициированные из опухоли пациента (BT35)3, несущие мутацию драйвера H3.3 K27M. Наконец, мы выполнили электрофизиологические записи глутаматергических клеток на D21 перед посевом pHGG-клеток и D23 после 48 ч совместной культуры в одно и то же микрофлюидное устройство. Взаимодействия между глутаматергическими нейронами и pHGG-клетками характеризовались значительным увеличением регистрируемой электрофизиологической активности.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td >MCS</td>
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >53750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >51999</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accutase</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6964</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ala -Gln (GlutaMAX)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G8541</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axel Observer 7 Microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >431007-9904-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon&#174;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >353109</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >HERASafe type KS12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Colibri 7 LED</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >4230529710-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >
			<div>Cortical Glutamatergic Neurons</div>
			</td>
			<td >BrainXell</td>
			<td >BX-0300</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31331-028</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12 Medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8437</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS 1X</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >L0615-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasYFlaskTM&#160;cell culture flasks 75cm3</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >500105</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Geltrex</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A1413201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Memmert</td>
			<td >IC0150med</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MCS InterFace Boarder</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEA2100</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P10</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729020</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P100</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P1000</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729070</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P200</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729060</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >33290</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiChannel Experimenter</td>
			<td >MCS</td>
			<td >-</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N2 Supplement-A</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >7152</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal Medium</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21103049</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurocult SM1 neuronal supplement</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >5711</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 0.1 - 10 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >030570ACL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 1 - 200 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >032260CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 50 - 1250 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >134760CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >X0557-100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >4000202/4038202</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 10 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357551</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 5 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357543</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plaque chauffante (CultureTemp)</td>
			<td >Belart</td>
			<td >370151000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6407</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primovert microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >415510-1100-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scepter (Handheld Automated Cell Counter)</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >PHCC00000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TGF-&#946;1</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >100-21C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352070</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions

Детские высокодифференцированные глиомы (pHGG) представляют собой рак мозга у детей и подростков, которые имеют быстрый мрачный прогноз. Поскольку существует необходимость преодолеть устойчивость к текущим методам лечения и найти новый способ лечения, моделирование заболевания как можно ближе в условиях in vitro для тестирования новых лекарств и терапевтических процедур является очень требовательным. Изучение их фундаментальных патобиологических процессов, включая гипервозбудимость глутаматергических нейронов, станет реальным шагом вперед в понимании взаимодействий между мозгом окружающей среды и клетками pHGG. Таким образом, чтобы воссоздать взаимодействия нейронов / клеток pHGG, эта работа показывает разработку функциональной модели in vitro , кокультурирующей индуцированные человеком плюрипотентные стволовые (hiPS) корковые глутаматергические нейроны pHGG в разделенные микрофлюидные устройства и процесс регистрации их электрофизиологических модификаций. Первым шагом была дифференциация и характеристика глутаматергических нейронов человека. Во-вторых, клетки культивировали в микрофлюидных устройствах с клеточными линиями, полученными из pHGG. Микроокружение мозга и активность нейронов были затем включены в эту модель для анализа электрического воздействия клеток pHGG на эти нейроны микросреды. Электрофизиологические записи соединяются с использованием многоэлектродных массивов (MEA) с этими микрофлюидными устройствами для имитации физиологических условий и записи электрической активности всей нейронной сети. Значительное увеличение возбудимости нейронов было подчеркнуто в присутствии опухолевых клеток.

До изучения электрических взаимодействий между глутаматергическими нейронами и клетками глиомы были охарактеризованы корковые глутаматергические нейроны, полученные из hiPS, для проверки возможности их культивирования в микрофлюидных устройствах (рисунок 1A</...

Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Недавние работы раскрывают нейронное воздействие на клетки высокодипломной детской глиомы (pHGG) и их взаимные взаимодействия. Настоящая работа показывает разработку модели in vitro совместного культивирования pHGG-клеток и глутаматергических нейронов и записывающей их электрофизиологические взаимодействия для имитации этих взаимодействий.

Кокультура глутаматергических нейронов и педиатрических клеток глиомы высокой степени в микрофлюидные устройства для оценки электрических взаимодействий

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Взаимодействие между клетками злокачественной глиомы и окружающими их нейронами набирает интерес. Здесь мы показываем разработку модели in vitro совместного культивирования корковых глутаматергических нейронов и опухолевых клеток. Микрофлюдические устройства, используемые для кокультур, связанных с многоэлектродными массивами, позволяют изучать различные типы клеток и выполнять записи электрической активности в разные моменты времени культур.Этот метод особенно полезен для функциональных и механистических исследований и для анализа эффектов фармакологических агентов, которые блокируют детскую миграцию клеток глиомы высокой степени и взаимодействие с нейронами. Чтобы начать культивирование коммерциализированных кортикальных глутаматергических нейронов, полученных из IPS человека, опорожняйте входные и выходные резервуары микрофлюидного устройства с помощью аспирации пипетки, позволяя только каналам устройства быть заполненными средой. Засейте человеческие IPS-клетки, добавив 10 микролитров из 6,5 миллионов человеческих IPS-клеток на миллилитр суспензии в среде и позвольте устройству находиться под капотом в течение 15 минут, чтобы позволить клеткам прикрепиться.Через 15 минут заполните как впускные, так и выходные резервуары 50 микролитрами питательной среды четвертого дня, затем переместите устройство в инкубатор для поддержания клеток при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 23 дней. Заменяйте носитель каждые три-четыре дня, как описано в тексте. Чтобы подсчитать клетки и оценить жизнеспособность с помощью стандартного фазового контрастного микроскопа, сделайте микроскопические снимки на 4-й день, 21-й день и 23-й день.Культивируйте клеточные линии UW479 и BT35 в DMEM и F-12 GlutaMAX с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки в колбе для клеточной культуры. Поддерживайте культуру клеток в контролируемой среде при 37 градусах Цельсия в нормоксических условиях на протяжении всего эксперимента. Наблюдайте за каждой клеточной линией, чтобы достичь 80% слияния.На 21-й день после культивирования глутаматергических нейронов начните совместную культуру, трипсинизируя клетки UW479 и BT35. Посейте трипсинизированные клетки UW479 и BT35 поверх зрелых адгезивных глутаматергических нейронов в каждом выделенном микрофлюидном устройстве. Поддерживайте кокультуры в течение двух дней в контролируемой среде при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа с глутаматергическим нейроном D11 и далее средой.Подсчитайте педиатрические клетки глиомы высокой степени с помощью микроскопических изображений, проанализированных с помощью программного обеспечения для анализа изображений, чтобы оценить их жизнеспособность и рассчитать процент клеток. Поместите МФД в записывающее устройство и используйте коммерчески доступное программное обеспечение для выполнения электрофизиологической записи глутаматергических нейронов на 21-й день. Перед посевом педиатрических полноценных клеток глиомы выполните вторую электрофизиологическую запись дифференцированных глутаматергических нейронов, культивируемых в качестве контроля параллельно кокультуре.Выполните еще одну электрофизиологическую запись на 23-й день после двух дней совместной культуры. Кортикальные глутаматергические нейроны человека, полученные из IPS, были охарактеризованы и оценены с использованием нестина, SOX2, метаботропных глутаматных рецепторов II и иммуноокрашивания VGLUT1. Нестин является промежуточным нитевидным белком и экспрессировался в недифференцированных клетках ЦНС.SOX2 также экспрессировался в недифференцированных клетках нервного эпителия в ЦНС. Процент нестина и SOX2-положительных клеток снижался с четвертого дня до 21-го дня, подтверждая дифференцированное состояние глутаматергических нейронов. Микроскопические изображения показали прогрессивное распределение глутаматергических нейронов по микрофлюидным устройствам.Когда BT35 и UW479 были добавлены в культуру, было замечено, что плавающие клетки присутствовали после посева клеток глиомы на 21-й день, которые постепенно исчезали до 23-го дня и становились адгезивными в устройстве. Процентное содержание жизнеспособных клеток для BT35 и UW479 было сопоставимым и подразумевало, что клеточные линии, полученные от пациента, могут быть использованы надлежащим образом. Обнаружение шипов и растровый график на 23-й день культивирования показали повышенную электрическую активность после добавления педиатрических полноценных клеток глиомы.Для мониторинга синхронности активности нейронной сети регистрировали мгновенную скорость срабатывания в BT35 или глутаматергических нейронах. Разница в электрической активности между индивидуально культивируемыми и совместно культивируемыми глутаматергическими нейронами была значительной на 23-й день. Дальнейшая методологическая разработка может включать функциональную оценку сети с пакетным анализом и специальными временными перекрестными корреляциями сети.Теперь у исследователей есть многообещающий инструмент для изучения взаимодействий и фармакологического таргетинга педиатрических линий опухоли глиомы высокой степени и нейронов с высоким PSC. Может быть использовано несколько опухолевых линий и несколько типов нейронов.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Трансплантация опухолей головного мозга у детей в мозг в иммунокомпетентные хозяева для долгосрочного изучения поведения опухолевых клеток и лекарственного ответа

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Всеобъемлющий протокол выборки и процесс костного мозга для измерения поддающихся оценке остаточной болезни и лейкозных клеток острой миелоидной лейкемией

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Мезенхимальных стволовых клеток изолированно от ткани пульпы и культуры совместно с раковых клеток, чтобы изучить их взаимодействия

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Оценка биомаркеров в глиомы, иммуногистохимия на парафин врезанных 3D глиомы нейросферы культур

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Измерение ремоделирования костей и воссоздания микроокружения опухоли и кости с использованием кокультуры Кальварии и гистоморфометрии

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Кокультура стволовых клеток глиобластомы на узорчатых нейронах для изучения миграции и клеточных взаимодействий

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Быстрый процесс скрининга для определения потенциальной комбинированной терапии GBM с использованием стволовых клеток глиомы, полученных от пациента

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Иммуноцитохимический анализ живых 3D-клеток диффузной срединной глиомы у детей

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Генерация и культивирование высокодифференцированных серозных органоидов, полученных от пациентов с раком яичников

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Оптимизация эксплуатационных параметров анализа длины теломер TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...