Name: co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por becas del programa Satt Conectus, Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» y «Semeurs d'Etoile». Agradecemos a los niños y familias afectados por losHGG por sus contribuciones a esta investigación y su apoyo.

Para este protocolo, el número de acreditación relacionado con el uso de materiales humanos es DC-2020-4203.
1. Fabricación, preparación y tratamiento de dispositivos microfluídicos
<ol><li>Fabrica moldes SU-8 utilizando técnicas de fotolitografía convencionales18. NOTA: Para este propósito, se han diseñado dos máscaras de fotolitografía para construir dos capas de estructuras fotorresistentes sobre sustrato de oblea de silicio y una capa fotorresistente...

<ol>
	<li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+molecular+meta-analysis+of+1,000+pediatric+high-grade+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alex's+lemonade+stand+foundation+infant+and+childhood+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011.">Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).</li><li>Blandin, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+environment+and+paired+hierarchical+3D+and+2D+models+of+pediatric+H3.3-mutated+gliomas+recreate+the+patient+tumor+complexity.">Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity.</a> Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+communication+in+brain+cancer.">Synaptic communication in brain cancer.</a> Cancer Research. 80 (14), 2979-2982 (2020).</li><li>Mount, C. W., Yal&#231;&#305;n, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+maps+brain-wide+afferent+oligodendrocyte+precursor+cell+connectivity.">Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity.</a> eLife. 18 (8), 49291 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+activity-regulated+neuroligin-3+dependency+in+high-grade+glioma.">Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma.</a> Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+glioma+growth+through+Neuroligin-3+secretion.">Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion.</a> Cell. 161 (4), 803-816 (2015).</li><li>Buckingham, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+by+primary+brain+tumors+induces+epileptic+activity.">Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).</li><li>Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glioma+cells+induce+hyperexcitability+in+cortical+networks.">Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks.</a> Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchannel+patterning+strategies+for+in+vitro+structural+connectivity+modulation+of+neural+networks.">Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpiCoDyn:+A+toolbox+for+the+analysis+of+neuronal+network+dynamics+and+connectivity+from+multi-site+spike+signal+recordings.">SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).</li><li>Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+neurite+guidance+to+study+structure-function+relationships+in+topologically-complex+population-based+neural+networks.">Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks.</a> Scientific Reports. 6, 28384 (2016).</li><li>Nguyen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+transcriptional+and+metabolic+responses+of+pediatric+high+grade+gliomas+to+mTOR-HIF-1&#945;+axis+inhibition.">Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1&#945; axis inhibition.</a> Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Cerea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+intracellular+delivery+and+intracellular+recordings+combined+in+MEA+biosensors.">Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors.</a> Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).</li><li>Bruno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multielectrode+arrays+for+spatially+localized+drug+delivery+and+electrical+recordings+of+primary+neuronal+cultures.">Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+chamber+technology+as+building+blocks+for+a+standardized+brain+on+chip+framework.">Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).</li><li>Andreiuk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+polymer+nanoparticles+for+cell+barcoding+in+vitro+and+in+vivo.">Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo.</a> Small. 13 (38), (2017).</li></ol>

Este trabajo describe un modelo funcional in vitro preciso para evaluar la interacción entre las neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de hiPS humanas y las células tumorales cerebrales en dispositivos microfluídicos. Uno de los pasos cruciales en el presente protocolo fue la diferenciación hiPS en neuronas glutamatérgicas, que se confirmó por la disminución de la tinción inmunofluorescente de Nestin y Sox2 y la aparición simultánea de tinción mGluR2 y vGLUT1. Sin embargo, pocos progenitores ...

Los gliomas pediátricos de alto grado (pHGG) presentan una diversidad genotípica y fenotípica extendida dependiendo de la edad del paciente, la ubicación y extensión anatómica tumoral y los impulsores moleculares1. Son tumores cerebrales agresivos que están mal controlados con las opciones de tratamiento actualmente disponibles y son la principal causa de muerte relacionada con cánceres cerebrales en niños y adolescentes2. Por lo tanto, más del 80% de los pacientes recaen dentro de los 2 años posteriores a su diagnóstico, y su supervivencia media es de 9 a 15 meses, dependiendo de las ubicaciones del cerebro y las mutaciones impulsoras. La ausencia de tratamiento curativo es el principal impulso para la investigación de laboratorio y destaca la necesidad inmediata de nuevos enfoques terapéuticos innovadores. Para este propósito, se desarrollaron líneas celulares derivadas de pacientes (PDCL) con la esperanza de proporcionar la diversidad de pHGG3 en líneas bidimensionales (2D) y / o neuroesferas tridimensionales (3D). Sin embargo, esos cultivos celulares in vitro derivados del paciente no imitan todas las situaciones de variables cerebrales. Estos modelos no consideran los ambientes neuroanatómicos macroscópicos y microscópicos típicamente descritos en pHGG.
Por lo general, la pHGG en niños más pequeños se desarrolla principalmente en las regiones pontina y talámica, mientras que la HGG de adolescentes y adultos jóvenes se concentra en las áreas corticales, especialmente en los lóbulos frontotemporales1. Estas especificidades de localización a lo largo de las edades pediátricas parecen involucrar diferentes ambientes que conducen a la gliomagénesis y a una red de intricción entre las células tumorales y la actividad neuronal específica4,5,6. Aunque los mecanismos aún no se han identificado, el pHGG se desarrolla principalmente a partir de células precursoras neurales a lo largo de la trayectoria de diferenciación de los linajes astrogliales y oligodendrogliales. Si bien el papel de estos linajes gliales se ha restringido durante mucho tiempo al soporte estructural simple de las neuronas, ahora está claramente establecido que se integran completamente en los circuitos neuronales y exhiben complejas interacciones glial-neuronales bidireccionales capaces de reorganizar las regiones estructurales del cerebro y remodelar los circuitos neuronales4,7,8 . Además, el aumento de fragmentos de evidencia indica que el sistema nervioso central (SNC) desempeña un papel crítico en el inicio y la progresión del cáncer cerebral. Trabajos recientes se centraron en la actividad neuronal, que parece impulsar el crecimiento y la mitosis de las neoplasias gliales malignas a través de factores de crecimiento secretados y comunicaciones sinápticas electroquímicas directas6,9. Recíprocamente, las células de glioma de alto grado parecen influir en la función neuronal con una creciente actividad neuronal glutamatérgica y modular el funcionamiento de los circuitos en los que están integradas estructural y eléctricamente9. Por lo tanto, los estudios que utilizaron modelos derivados del paciente y nuevas herramientas de neurociencia que controlan la acción neuronal demostraron un efecto específico del circuito de la actividad neuronal en la ubicación, el crecimiento y la progresión del glioma. La mayoría de estas proyecciones neuronales involucradas en los gliomas son glutamatérgicas y se comunican a través de secreciones de glutamato. Comúnmente se describen biomarcadores glutamatérgicos específicos como mGluR2 o vGlut1/26.
Curiosamente, a pesar de su heterogeneidad molecular, los gliomas pediátricos y adultos de alto grado muestran una respuesta proliferativa típica a la actividad neuronal glutamatérgica y otros factores secretados como la neuroligina-3 o el BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro)4,6,10,11,12,13 . En las regiones corticales, los HGG pediátricos y adultos pueden inducir hiperexcitabilidad neuronal a través de un aumento de la secreción de glutamato e inhibir las interneuronas gaba que conducen a gliomas asociados con la actividad de la red epiléptica14,15. Además de eso, los circuitos neuronales pueden ser remodelados por gliomas que empujan tareas neurológicas específicas, por ejemplo, el lenguaje, y pueden requerir actividad neuronal organizada adicional9.
Sobre la base de esta lógica, el avance de la comprensión de las comunicaciones bidireccionales entre las células de glioma y las neuronas debe dilucidarse completamente e integrarse con las primeras etapas de los enfoques in vitro de pHGG. Este modelado innovador es crucial para comprender y medir el impacto de la actividad eléctrica neuronal durante las pruebas de drogas y anticipar la respuesta de pHGG en los circuitos cerebrales. Los desarrollos recientes en herramientas de neurociencia, como los dispositivos microfluídicos y los trabajos de investigación de pHGG, son la base para desarrollar nuevos enfoques de modelado y poder integrar ahora el microambiente cerebral en modelos de pHGG in vitro3,16,17,18,19. Junto con los registros electrofisiológicos utilizando matrices multielectrodos (MEA), los dispositivos microfluídicos20,21,22 ofrecen la posibilidad de imitar las condiciones fisiológicas mientras registran la actividad eléctrica de toda la red neuronal y extraen los parámetros de conectividad de la red bajo varias condiciones. Este dispositivo23,24 permite en primer lugar la deposición precisa de células en una cámara directamente sobre MEA. Esta tecnología permite el control de la densidad de siembra celular y la homogeneidad en MEA y el control fino del intercambio de medios, que es un paso crítico para la diferenciación de progenitores neurales humanos directamente en dispositivos. Además, la cámara de deposición actual se puede sembrar con múltiples células en diferentes puntos de tiempo.
Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un modelo funcional in vitro que coculte las neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de Stem (hiPS) humanas y las células derivadas de pHGG en dispositivos microfluídicos y registre su actividad eléctrica para evaluar las interacciones eléctricas entre ambas poblaciones celulares. En primer lugar, se obtuvieron neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de hiPS y se caracterizaron en dispositivos microfluídicos en diferentes etapas de cultivo [día 4 (D4), como células hiPS, y día 21 (D21) y día 23 (D23), como neuronas maduras glutamatérgicas]. Para el segundo paso del cocultivo se utilizaron dos modelos de pHGG: la línea UW479 pediátrica comercializada y las células pHGG iniciadas a partir de un tumor de paciente (BT35)3, con una mutación impulsora H3.3 K27M. Finalmente, realizamos registros electrofisiológicos de células glutamatérgicas en D21 antes de la siembra de células pHGG y D23 después de 48 h de cocultivo en el mismo dispositivo microfluídico. Las interacciones entre las neuronas glutamatérgicas y las células pHGG se caracterizaron por un aumento significativo en la actividad electrofisiológica registrada.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td >MCS</td>
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >53750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >51999</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accutase</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6964</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ala -Gln (GlutaMAX)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G8541</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axel Observer 7 Microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >431007-9904-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon&#174;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >353109</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >HERASafe type KS12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Colibri 7 LED</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >4230529710-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >
			<div>Cortical Glutamatergic Neurons</div>
			</td>
			<td >BrainXell</td>
			<td >BX-0300</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31331-028</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12 Medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8437</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS 1X</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >L0615-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasYFlaskTM&#160;cell culture flasks 75cm3</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >500105</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Geltrex</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A1413201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Memmert</td>
			<td >IC0150med</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MCS InterFace Boarder</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEA2100</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P10</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729020</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P100</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P1000</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729070</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P200</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729060</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >33290</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiChannel Experimenter</td>
			<td >MCS</td>
			<td >-</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N2 Supplement-A</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >7152</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal Medium</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21103049</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurocult SM1 neuronal supplement</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >5711</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 0.1 - 10 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >030570ACL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 1 - 200 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >032260CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 50 - 1250 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >134760CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >X0557-100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >4000202/4038202</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 10 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357551</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 5 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357543</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plaque chauffante (CultureTemp)</td>
			<td >Belart</td>
			<td >370151000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6407</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primovert microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >415510-1100-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scepter (Handheld Automated Cell Counter)</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >PHCC00000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TGF-&#946;1</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >100-21C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
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co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions

Los gliomas pediátricos de alto grado (pHGG) representan cánceres cerebrales infantiles y adolescentes que tienen un pronóstico sombrío rápido. Dado que existe la necesidad de superar la resistencia a los tratamientos actuales y encontrar una nueva forma de curación, modelar la enfermedad lo más cerca posible en un entorno in vitro para probar nuevos medicamentos y procedimientos terapéuticos es muy exigente. El estudio de sus procesos patobiológicos fundamentales, incluida la hiperexcitabilidad de las neuronas glutamatérgicas, será un verdadero avance en la comprensión de las interacciones entre el cerebro ambiental y las células pHGG. Por lo tanto, para recrear las interacciones entre las neuronas y las células pHGG, este trabajo muestra el desarrollo de un modelo funcional in vitro de cocultivo que coculta las neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de Stem (hiPS) inducidas por humanos en células pHGG microfluídicas compartimentadas y un proceso para registrar sus modificaciones electrofisiológicas. El primer paso fue diferenciar y caracterizar las neuronas glutamatérgicas humanas. En segundo lugar, las células se cultivaron en dispositivos microfluídicos con líneas celulares derivadas de pHGG. El microambiente cerebral y la actividad neuronal se incluyeron en este modelo para analizar el impacto eléctrico de las células pHGG en estas neuronas microambientales. Los registros electrofisiológicos se acoplan utilizando matrices multielectrodos (MEA) a estos dispositivos microfluídicos para imitar las condiciones fisiológicas y registrar la actividad eléctrica de toda la red neuronal. Se subrayó un aumento significativo en la excitabilidad neuronal en presencia de células tumorales.

Antes de estudiar las interacciones eléctricas entre las neuronas glutamatérgicas y las células de glioma, se caracterizaron las neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de hiPS para validar la viabilidad de cultivarlas en dispositivos microfluídicos (Figura 1A). Su caracterización fue evaluada utilizando Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotrópicos Glutamato Receptores 2) e inmunotinción vGLUT1, representada en la Figura 1A<strong...

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Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Trabajos recientes descubren el impacto neuronal en las células de glioma pediátrico de alto grado (pHGG) y sus interacciones recíprocas. El presente trabajo muestra el desarrollo de un modelo in vitro que co-cultiva células pHGG y neuronas glutamatérgicas y registra sus interacciones electrofisiológicas para imitar esas interactividades.

Cocultivo de neuronas glutamatérgicas y células pediátricas de glioma de alto grado en dispositivos microfluídicos para evaluar las interacciones eléctricas

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Las interacciones entre las células de glioma maligno y sus neuronas circundantes están ganando interés. Aquí, mostramos el desarrollo de un modelo in vitro de co-cultivo derivado de neuronas glutamatérgicas corticales y células tumorales. Los dispositivos microfluidos utilizados para los cocultivos acoplados a matrices multielectrodos permiten el estudio de diferentes tipos de células y realizan registros de actividad eléctrica en diferentes puntos temporales de los cultivos.Este método es particularmente útil para estudios funcionales y mecanicistas y para analizar los efectos de los agentes farmacológicos que bloquean la migración celular pediátrica de glioma de alto grado y la interacción con las neuronas. Para comenzar a cultivar las neuronas glutamatérgicas corticales humanas derivadas de IPS comercializadas, vacíe los depósitos de entrada y salida del dispositivo microfluídico mediante aspiración de pipeta, dejando que solo los canales del dispositivo se llenen con medio. Sembra las células IPS humanas agregando 10 microlitros de 6.5 millones de células IPS humanas por mililitro de suspensión en el medio y deja que el dispositivo esté debajo del capó durante 15 minutos para permitir que las células se adhieran.Después de 15 minutos, llene los depósitos de entrada y salida con 50 microlitros de medio de cultivo del cuarto día, luego transfiera el dispositivo a la incubadora para mantener las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 23 días. Reemplace el medio cada tres o cuatro días como se describe en el texto. Para contar las células y evaluar la viabilidad utilizando un microscopio de contraste de fase estándar, tome imágenes microscópicas en el día 4, el día 21 y el día 23.Cultivo de líneas celulares UW479 y BT35 en DMEM y F-12 GlutaMAX suplementado con suero bovino fetal al 10% en un matraz de cultivo celular. Mantener el cultivo celular bajo un ambiente controlado a 37 grados centígrados en condiciones normóxicas durante todo el experimento. Observe cada línea celular para alcanzar el 80% de confluencia.El día 21 post-cultivo de neuronas glutamatérgicas, comience el co-cultivo mediante la tripsinización de las células UW479 y BT35. Sembra las células tripsinizadas UW479 y BT35 sobre las neuronas glutamatérgicas adherentes maduras en cada dispositivo microfluídico dedicado. Mantener los cocultivos durante dos días bajo un ambiente controlado a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con neurona glutamatérgica D11 y medio en adelante.Contar las células de glioma pediátrico de alto grado utilizando las imágenes microscópicas analizadas con el software de análisis de imágenes para evaluar su viabilidad y calcular el porcentaje de células. Coloque el MFD en el dispositivo de grabación y utilice un software disponible comercialmente para realizar el registro electrofisiológico de las neuronas glutamatérgicas el día 21. Antes de sembrar células de glioma pediátrico de alto grado, realizar un segundo registro electrofisiológico de las neuronas glutamatérgicas diferenciadas cultivadas como control paralelo al cocultivo.Realizar otro registro electrofisiológico el día 23 después de dos días del cocultivo. Las neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de IPS humanas se caracterizaron y evaluaron utilizando nestina, SOX2, receptores metabotrópicos de glutamato II e inmunotinción VGLUT1. La nestina es una proteína de filamento intermedio y se expresó en células indiferenciadas del SNC.SOX2 también se expresó en células indiferenciadas del epitelio neural en el SNC. El porcentaje de células nestinas y SOX2 positivas disminuyó desde el cuarto día hasta el día 21, confirmando el estado diferenciado de las neuronas glutamatérgicas. Las imágenes microscópicas revelaron una distribución progresiva de las neuronas glutamatérgicas a través de dispositivos microfluídicos.Cuando se agregaron BT35 y UW479 al cultivo, se observó que las células flotantes estaban presentes después de la siembra de células de glioma en el día 21, que desapareció progresivamente hasta el día 23 y se hizo adherente en el dispositivo. Los porcentajes de células viables para BT35 y UW479 eran comparables e implicaban que las líneas celulares derivadas del paciente podían usarse adecuadamente. La detección de picos y el diagrama ráster en el día 23 de cultivo mostraron un aumento de la actividad eléctrica después de agregar células de glioma pediátrico de alto grado.Para monitorear la sincronicidad de la actividad de la red neuronal, se registró la velocidad de disparo instantáneo en BT35 o neuronas glutamatérgicas. La diferencia en la actividad eléctrica entre las neuronas glutamatérgicas cultivadas individualmente y cocultivadas fue significativa en el día 23. El desarrollo metodológico adicional puede incluir la evaluación funcional de la red con análisis de ráfagas y correlaciones cruzadas temporales especiales de la red.Ahora, los investigadores tienen una herramienta prometedora para explorar las interacciones y la orientación farmacológica de las líneas tumorales pediátricas de glioma de alto grado y las neuronas PSC altas. Se pueden usar varias líneas tumorales y varios tipos de neuronas.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplante de Tumores cerebrales pediátricos de Zebrafish en huéspedes inmune-competentes para el estudio a largo plazo del comportamiento de la célula de tumor y de la respuesta de la droga

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

General protocolo muestra y médula de proceso para medir enfermedad Residual medible y células leucémicas en la leucemia mieloide aguda

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Aislamiento de células madre mesenquimales del tejido de la pulpa y cocultivo con células de cáncer para estudiar sus interacciones

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Evaluación de biomarcadores en Glioma por Immunohistochemistry en parafina-encajado 3D Glioma desarrolló culturas

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Medición de la remodelación ósea y recreación del microambiente tumor-óseo utilizando la cocultura calvaria y la histomorfometría

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-cultivo De Glioblastoma Células Madre-como En Las Neuronas Modeladas Para Estudiar La Migración Y Las Interacciones Celulares

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flujo de trabajo de detección rápido para identificar una posible terapia combinada para GBM utilizando células madre de glioma derivadas del paciente

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Ensayos de inmunocitoquímica de células 3D vivas del glioma difuso de línea media infantil

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generación y cultivo de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Optimización de los parámetros de rendimiento del ensayo de longitud de telómeros TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...