Name: co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från Satt Conectus program, Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» och «Semeurs d'Etoile» föreningar. Vi tackar de barn och familjer som drabbats av tungagg för deras bidrag till denna forskning och deras stöd.

För detta protokoll är ackrediteringsnumret för användning av mänskliga material DC-2020-4203.
1. Mikrofluidisk tillverkning, beredning och behandling av mikrofluidiska enheter
<ol><li>Tillverka SU-8 formar med konventionella fotolitografitekniker18. OBS: För detta ändamål har två fotolitografimasker utformats för att konstruera två lager av fotoresiststrukturer på kiselskivans substrat och ett tunt SU-8 2005-fotoresistskikt (3,2 μm högt och 6 ± 1 μ...

<ol>
	<li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+molecular+meta-analysis+of+1,000+pediatric+high-grade+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alex's+lemonade+stand+foundation+infant+and+childhood+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011.">Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).</li><li>Blandin, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+environment+and+paired+hierarchical+3D+and+2D+models+of+pediatric+H3.3-mutated+gliomas+recreate+the+patient+tumor+complexity.">Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity.</a> Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+communication+in+brain+cancer.">Synaptic communication in brain cancer.</a> Cancer Research. 80 (14), 2979-2982 (2020).</li><li>Mount, C. W., Yal&#231;&#305;n, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+maps+brain-wide+afferent+oligodendrocyte+precursor+cell+connectivity.">Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity.</a> eLife. 18 (8), 49291 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+astrocyte-synapse+interactions+in+CNS+disorders.">Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders.</a> Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).</li><li>Neftel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+model+of+cellular+states,+plasticity,+and+genetics+for+glioblastoma.">An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma.</a> Cell. 178 (4), 835-849 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+remodeling+of+neural+circuits+in+the+human+brain+decreases+survival.">Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signaling+between+glioblastoma+stem+cells+and+differentiated+tumor+cells+promotes+malignant+progression.">Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+activity-regulated+neuroligin-3+dependency+in+high-grade+glioma.">Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma.</a> Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+glioma+growth+through+Neuroligin-3+secretion.">Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion.</a> Cell. 161 (4), 803-816 (2015).</li><li>Buckingham, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+by+primary+brain+tumors+induces+epileptic+activity.">Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).</li><li>Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glioma+cells+induce+hyperexcitability+in+cortical+networks.">Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks.</a> Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchannel+patterning+strategies+for+in+vitro+structural+connectivity+modulation+of+neural+networks.">Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpiCoDyn:+A+toolbox+for+the+analysis+of+neuronal+network+dynamics+and+connectivity+from+multi-site+spike+signal+recordings.">SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).</li><li>Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+neurite+guidance+to+study+structure-function+relationships+in+topologically-complex+population-based+neural+networks.">Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks.</a> Scientific Reports. 6, 28384 (2016).</li><li>Nguyen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+transcriptional+and+metabolic+responses+of+pediatric+high+grade+gliomas+to+mTOR-HIF-1&#945;+axis+inhibition.">Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1&#945; axis inhibition.</a> Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Cerea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+intracellular+delivery+and+intracellular+recordings+combined+in+MEA+biosensors.">Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors.</a> Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).</li><li>Bruno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multielectrode+arrays+for+spatially+localized+drug+delivery+and+electrical+recordings+of+primary+neuronal+cultures.">Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Maisonneuve, B. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+chamber+technology+as+building+blocks+for+a+standardized+brain+on+chip+framework.">Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).</li><li>Andreiuk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+polymer+nanoparticles+for+cell+barcoding+in+vitro+and+in+vivo.">Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo.</a> Small. 13 (38), (2017).</li></ol>

Detta arbete beskriver en korrekt funktionella in vitro modell att utvärdera interaktionen mellan mänskliga hiPS-härledda när glutamatergic nervceller och hjärnan tumöral celler i microfluidic enheter. Ett av de avgörande stegen i detta protokoll var hiPS differentiering i glutamatergic nervceller, som bekräftades av minskningen av Nestin och Sox2 immunofluorescent färgning och samtidiga utseende av mGluR2 och vGLUT1 färgning. Ändå återstod få neurala stamceller som endast hälften av de glutamater...

Pediatrisk hög kvalitet gliomas (pHGG) uppvisar en utökad genotypisk och fenotypisk mångfald beroende på patientens ålder, tumör anatomiska plats och förlängning och molekylära drivrutiner1. De är aggressiva hjärntumörer som är dåligt kontrollerade med de nuvarande tillgängliga behandlingsalternativen och är den ledande dödsorsaken relaterad till hjärncancer hos barn och ungdomar2. Så, mer än 80% av patienterna återfaller inom 2 år efter sin diagnos, och deras median överlevnad är 9-15 månader, beroende på hjärnplatser och föraren mutationer. Frånvaron av botande behandling är det främsta anloppet för laboratorieforskning och belyser det omedelbara behovet av nya innovativa terapeutiska metoder. För detta ändamål utvecklades patient-härledda cellinjer (PDCL) med hopp om att tillhandahålla pHGG mångfald3 i tvådimensionella (2D) linjer och/eller tredimensionella (3D) neurosfärer. Ändå efterliknar de patient-härledda in vitro cell kulturer inte alla hjärnan variabla situationer. Dessa modeller anser inte makroskopiska och mikroskopiska neuro-anatomiska miljöer som vanligtvis beskrivs i pHGG.
Vanligtvis utvecklas pHGG hos yngre barn främst i pontinska och thalamic regioner, medan ungdomar och unga vuxnaS HGG koncentrerar sig i närområdena, särskilt i frontotemporallober1. Dessa plats-specificiteter över pediatrisk ålder verkar involvera olika miljöer som leder till gliomagenesis och ett inveckling nätverk mellan tumör celler och specifika neuronal verksamhet4,5,6. Även om mekanismer fortfarande inte identifieras, utvecklas pHGG främst från neurala prekursor celler längs differentieringsbanan för astroglia och oligodendroglial härstamningar. Även om rollen för dessa glia härstamningar har länge begränsats till enkelt strukturellt stöd för nervceller, är det nu tydligt fastställt att de integreras helt i neurala kretsar och uppvisar komplexa dubbelriktade glia-neuronala interaktioner som kan omorganisera strukturella regioner i hjärnan och omforma neuronala kretsar4,7,8 . Dessutom tyder ökande strimlor av bevis på att centrala nervsystemet (CNS) spelar en avgörande roll i hjärncancerinitiering och progression. De senaste verken fokuserade på neuronal aktivitet, som verkar driva tillväxt och mitos av glia maligniteter genom utsöndrade tillväxtfaktorer och direkt elektrokemisk synaptisk kommunikation6,9. Ömsesidigt, hög kvalitet glioma celler verkar påverka neuronal funktion med en ökande glutamatergic neuronal aktivitet och modulera driften av kretsar där de är strukturellt och elektriskt integrerade9. Så, studier med patienten-härledda modeller och nya neurovetenskapliga verktyg som styr neuron åtgärder visat en krets-specifika effekt av neuronal aktivitet på glioma plats, tillväxt och progression. De flesta av dessa neuronal projektioner inblandade i gliomas är glutamatergic och kommunicera genom glutamat sekret. Specifika glutamatergiska biomarkörer som mGluR2 eller vGlut1/2 beskrivs ofta6.
Intressant nog, trots deras molekylära heterogenitet, visar pediatriska och vuxna höggradiga gliom ett typiskt proliferativt svar på glutamaterg neuronal aktivitet och andra utsöndrade faktorer som neuroligin-3 eller BDNF (hjärnan-härledd neurotrofisk faktor)4,6,10,11,12,13 . I när regioner, pediatrisk och vuxna HGGs kan inducera neuronal hyperexcitability genom en ökad glutamat utsöndring och hämma GABA interneurons leder till gliomas associerade med epileptiska nätverk verksamhet14,15. Dessutom kan neurala kretsar omformas av gliomas som driver specifika neurologiska uppgifter, till exempel språk, och kan rekvisition ytterligare organiserad neuronal aktivitet9.
Baserat på denna logik, främja förståelsen av dubbelriktad kommunikation mellan glioma celler och nervceller måste vara helt klarlagt och integreras med de tidiga stadierna av in vitro pHGG metoder. Sådan innovativ modellering är avgörande för att förstå och mäta den neuronala elektriska aktivitetspåverkan under drogtester och förutse pHGG-svar i hjärnkretsar. Den senaste utvecklingen inom neurovetenskapliga verktyg, såsom mikrofluidiska enheter och pHGG-forskningsarbete, är sängen för att utveckla nya modelleringsmetoder och nu kunna integrera hjärnmikromiljön i in vitro pHGG-modeller3,16,17,18,19. Tillsammans med elektrofysiologiska inspelningar med multielektrodmatriser (MEA), erbjuder mikrofluidiska enheter20,21,22 möjligheten att efterlikna fysiologiska förhållanden samtidigt som man registrerar den elektriska aktiviteten i hela neurala nätverket och extrahera nätverksanslutningsparametrar under flera förhållanden. Denna enhet23,24 tillåter först exakt deponering av celler i en kammare direkt på MEA. Denna teknik möjliggör kontroll av cellsåddtäthet och homogenitet på MEA och fin kontroll av medieutbyte, vilket är ett kritiskt steg för mänsklig neural stamdifferentiering direkt till enheter. Dessutom kan den nuvarande deponeringskammaren sås med flera celler vid olika tidpunkter.
Så, denna studie syftade till att utveckla en funktionell in vitro-modell samodling mänskliga Pluripotent Stem (hiPS)-härledda när glutamatergiska nervceller och pHGG-härledda celler till mikrofluidiska enheter och registrera deras elektriska aktivitet för att utvärdera elektriska interaktioner mellan båda cellpopulationerna. För det första erhölls hiPS-härledda när glutamaterg neuroner och karakteriseras i mikrofluidiska enheter i olika stadier av kultur [dag 4 (D4), som hiPS-celler och dag 21 (D21) och dag 23 (D23), som glutamatergiska mogna nervceller). För det andra steget i samkultur användes två pHGG-modeller: kommersialiserade pediatrisk UW479 linje och pHGG celler initieras från en patient tumör (BT35)3, med en H3.3 K27M drivrutin mutation. Slutligen utförde vi elektrofysiologiska inspelningar av glutamatergic celler vid D21 före pHGG cell sådd och D23 efter 48 h av samodling i samma microfluidic enhet. Interaktionerna mellan glutamatergiska nervceller och pHGG celler kännetecknades av en betydande ökning av den registrerade elektrofysiologiska aktiviteten.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td >MCS</td>
			<td >256MEA100/30iR-ITO-w/o</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >53750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 &#181;m probe for Scepter counter&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >51999</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accutase</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6964</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ala -Gln (GlutaMAX)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G8541</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axel Observer 7 Microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >431007-9904-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon&#174;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >353109</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >HERASafe type KS12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Colibri 7 LED</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >4230529710-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >
			<div>Cortical Glutamatergic Neurons</div>
			</td>
			<td >BrainXell</td>
			<td >BX-0300</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31331-028</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12 Medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8437</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS 1X</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >L0615-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasYFlaskTM&#160;cell culture flasks 75cm3</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >500105</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Geltrex</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A1413201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BDNF</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >450-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Memmert</td>
			<td >IC0150med</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MCS InterFace Boarder</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEA2100</td>
			<td >MCS</td>
			<td >181205-MEA2100-11240</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P10</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729020</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P100</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P1000</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729070</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette P200</td>
			<td >Sartorius</td>
			<td >LH-729060</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >33290</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiChannel Experimenter</td>
			<td >MCS</td>
			<td >-</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N2 Supplement-A</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >7152</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal Medium</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21103049</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurocult SM1 neuronal supplement</td>
			<td >StemCell</td>
			<td >5711</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 0.1 - 10 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >030570ACL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 1 - 200 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >032260CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non filter tip 50 - 1250 &#181;l ClearLine&#174; sterile in removable-lid rack</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >134760CL</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >X0557-100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >4000202/4038202</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 10 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357551</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette for cell culture 5 mL Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >357543</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plaque chauffante (CultureTemp)</td>
			<td >Belart</td>
			<td >370151000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6407</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primovert microscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >415510-1100-000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scepter (Handheld Automated Cell Counter)</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >PHCC00000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TGF-&#946;1</td>
			<td >Peprotech</td>
			<td >100-21C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon&#174;&#160;</td>
			<td >Dutscher</td>
			<td >352070</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma cells into microfluidic devices to assess electrical interactions

Pediatrisk hög kvalitet gliomas (pHGG) representerar barndom och ungdomar hjärncancer som bär en snabb dyster prognos. Eftersom det finns ett behov av att övervinna resistensen mot nuvarande behandlingar och hitta ett nytt sätt att bota, är modellering av sjukdomen så nära som möjligt i en in vitro-inställning för att testa nya läkemedel och terapeutiska förfaranden mycket krävande. Att studera deras grundläggande patobiologiska processer, inklusive glutamaterg neuron hyperexcitabilitet, kommer att vara ett verkligt framsteg i förståelsen av interaktioner mellan miljöhjärnan och pHGG-celler. Därför, för att återskapa nervceller/pHGG cell interaktioner, visar detta arbete utvecklingen av en funktionell in vitro modell co-culturing mänskliga-inducerad Pluripotent Stem (hiPS)-härledda när glutamatergic nervceller pHGG celler i compartmentalized microfluidic enheter och en process för att registrera deras elektrofysiologiska modifieringar. Det första steget var att differentiera och karakterisera mänskliga glutamatergiska nervceller. För det andra odlades cellerna i mikrofluidiska enheter med pHGG härledda cellinjer. Hjärnan microenvironment och neuronal aktivitet ingick sedan i denna modell för att analysera den elektriska effekten av pHGG celler på dessa mikro-miljömässiga nervceller. Elektrofysiologiska inspelningar kopplas med hjälp av multielektrodmatriser (MEA) till dessa mikrofluidiska enheter för att efterlikna fysiologiska förhållanden och för att registrera den elektriska aktiviteten i hela neurala nätverket. En betydande ökning av neuron excitability betonades i närvaro av tumör celler.

Innan studera elektriska interaktioner mellan glutamatergic nervceller och glioma celler, hiPS-härledda när glutamaterg neuroner karakteriserades för att validera möjligheten att odla dem i mikrofluidiska enheter (figur 1A). Deras karakterisering bedömdes med Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotropiska glutamatreceptorer 2) och vGLUT1 immunostaining, representerade i figur 1A(2-7). Eftersom Nestin är ett mellanliggande f...

Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions at JoVE.com

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

De senaste verken avslöjar den neuronala inverkan på högkvalitativa pediatrisk gliom (pHGG) celler och deras ömsesidiga interaktioner. Det nuvarande arbetet visar utvecklingen av en in vitro-modell samodling pHGG celler och glutamatergic nervceller och registrerade deras elektrofysiologiska interaktioner för att efterlikna dessa interactivities.

Samkultur av glutamaterga nervceller och pediatriska högkvalitativa gliomceller till mikrofluidiska enheter för att bedöma elektriska interaktioner

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Interaktionerna mellan de maligna gliomcellerna och deras omgivande nervceller ökar intresset. Här visar vi utvecklingen av en in vitro modell co-culturing härledda när glutamatergic nervceller och tumör celler. De mikrofludiska enheter som används för samkulturer kopplade till multielektrodmatriser gör det möjligt att studera olika celltyper och utföra elektriska aktivitetsinspelningar vid olika tidpunkter i kulturerna.Denna metod är särskilt användbar för funktionella och mekanistiska studier och för att analysera effekterna av farmakologiska medel som blockerar pediatrisk höggradig gliom cell migration och interaktion med nervceller. För att börja odla de kommersialiserade mänskliga IPS-härledda närgluterade glutamaterga nervcellerna, töm inlopps- och utloppsreservoarerna i den mikrofluidiska enheten genom pipette-strävan, så att endast enhetskanalerna kan fyllas med medium. Frö de mänskliga IPS-cellerna genom att tillsätta 10 mikroliter av 6,5 miljoner mänskliga IPS-celler per milliliterfjädring i mediet och låt enheten vara under huven i 15 minuter för att låta celler fästa.Efter 15 minuter fyller du både inlopps- och utloppsreservoarer med 50 mikroliter dag fyra kulturmedium och överför sedan enheten till inkubatorn för att behålla cellerna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 23 dagar. Byt ut mediet var tredje till fjärde dag enligt beskrivningen i texten. För att räkna cellerna och bedöma livskraften med hjälp av ett standard faskontrastmikroskop, ta mikroskopiska bilder på 4: e dagen, 21: a dagen och 23: e dagen.Kultur både UW479 och BT35 cellinjer i DMEM och F-12 GlutaMAX kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum i en cell odling kolv. Bevara cellkulturen under en kontrollerad miljö vid 37 grader Celsius under normoxiska förhållanden under hela experimentet. Observera varje cellinje för att nå 80%confluency.På dag 21 postkultur av glutamatergiska nervceller, börja samkultur genom att trypsinisera UW479 och BT35 celler. Frö de trypsinized UW479 och BT35 celler ovanpå mogna vidhäftande glutamatergic nervceller i varje dedikerad mikrofluidic enhet. Behåll samkulturerna i två dagar under en kontrollerad miljö vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid med glutamaterg neuron D11 och framåt medium.Räkna pediatriska höggradiga gliomceller med hjälp av de mikroskopiska bilder som analyseras med bildanalysprogramvaran för att bedöma deras livskraft och beräkna andelen celler. Placera MFD i inspelningsenheten och använd en kommersiellt tillgänglig programvara för att utföra den elektrofysiologiska inspelningen av glutamatergiska nervceller den 21: a dagen. Innan sådd pediatrisk hög kvalitet glioma celler, utföra en andra elektrofysiologisk inspelning av de differentierade glutamatergic nervceller odlas som kontroll parallellt med samkulturen.Utför en annan elektrofysiologisk inspelning den 23: e dagen efter två dagar av samkulturen. Mänskliga IPS-härledda när glutamaterg neuroner karakteriserades och bedömdes med nestin, SOX2, metabotropiska glutamatreceptorer II och VGLUT1 immunostaining. Nestin är ett mellanliggande filamentprotein och det uttrycktes i odifferentierade CNS-celler.SOX2 uttrycktes också i odifferentierade celler i neurala epitel i CNS. Nestin och SOX2-positiva celler procent minskade från den fjärde dagen till den 21: a dagen, bekräftar det differentierade tillståndet för glutamaterg neuroner. De mikroskopiska bilderna visade en progressiv fördelning av glutamatergic nervceller över microfluidic enheter.När BT35 och UW479 lades till kulturen observerades att de flytande cellerna var närvarande efter glioma cell seedning på den 21: a dagen, som gradvis försvann fram till den 23: e dagen och blev anhängare i enheten. Procentandelarna av livskraftiga celler för BT35 och UW479 var jämförbara och antydde att patient-härledda cellinjer kunde användas på lämpligt sätt. Spike upptäckt och raster plot på den 23: e dagen av kultur visade ökad elektrisk aktivitet efter att ha lagt till pediatrisk hög kvalitet gliom celler.För att övervaka synkroniciteten i neurala nätverk verksamhet, registrerades den momentana avfyrning hastigheten i BT35 eller glutamatergic nervceller. Skillnaden i elektrisk aktivitet mellan de individuellt odlade och samkulturerade glutamatergiska nervceller var betydande på den 23: e dagen. Ytterligare metodutveckling kan omfatta funktionell bedömning av nätverket med burst-analys och särskilda tidsmässiga korrelationer av nätverket.Nu har forskare ett lovande verktyg för att utforska interaktioner och farmakologisk inriktning av pediatriska höggradiga gliomtumörlinjer och höga PSC-neuroner. Flera tumör linjer och flera neuron typer kan användas.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantation av sebrafiskpediatriska hjärntumörer till immunkompetenta värdar för långvarig studie av tumörcellsbeteende och drogrespons

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattande protokoll till prov och processen benmärg för att mäta mätbara kvarvarande sjukdom och leukemiska stamceller i akut myeloisk leukemi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymala stamceller isolering från massa vävnad och samtidig kultur med cancerceller för att studera deras interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Utvärdering av biomarkörer i gliom av immunohistokemi på Paraffin-inbäddat 3D gliom Neurosphere kulturer

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Mätning av benremodeling och återskapa tumör-ben mikromiljö med Calvaria Co-kultur och Histomorphometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Samkultur av Glioblastoma stamliknande celler på mönstrade nervceller för att studera migration och cellulära interaktioner

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Ett snabbt screeningarbetsflöde för att identifiera potentiell kombinationsterapi för GBM med hjälp av patientbaserade Glioma-stamceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Live-3D-cell immunocytokemi analyser av pediatriskt diffust mittlinjegliom

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generering och odling av höggradig serös äggstockscancer patient-derived organoider

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Optimering av prestandaparametrar för TAGGG-telomerlängdanalysen

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...