Name: an effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury
Uploaded: 2021-07-15T14:45:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury at JoVE.com

En del af det arbejde, der vises i denne artikel, blev grundlagt af Center of Integrative Mammalian Research of Ross University School of Veterinary Medicine (RUSVM), Saint Kitts og Nevis. Den økonomiske støtte fra Institut for Veterinær Biomedicinsk Videnskab ved Long Island University College of Veterinary Medicine er meget værdsat.

Følgende protokol beskriver en overlevelsesoperation. Derfor anvendes den højeste aseptiske og kirurgiske praksis. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee. For at eliminere køns- og stammebaserede forskelle i IRI-effekter blev kun mandlige C57BL6-mus brugt i undersøgelsen. Alle dyr blev matchet i alder og vægt for at give sammenlignelige resultater.
1. Forberedelse
BEMÆRK: En tidslinje for de forskellige eksperimentelle faser og interventioner er vist i figur 1A.
<ol><li>Rengør og desinficer operationsbordet før hver procedure. Forbered og placer alle nødvendige materialer (steriliserede instrumenter og vatpinde, sterilt gasbind og gardiner, forfortyndede anæstetika, varmepude, steriliseret vaskulær klemme, steril saltopløsning og hudantiseptika og sutur) på operationsbordet (se materialetabellen).</li>
	<li>Bedøve C57BL6-hanmus (aldersgruppe 11-13 uger) ved intraperitoneal injektion af ketamin/xylazin (henholdsvis 100 mg/kg og 20 mg/kg legemsvægt, tidligere fortyndet i steril saltvand). BEMÆRK: Dygtig dyrehåndtering er afgørende for at minimere stress for dyret, da stressresponser kan påvirke virkningen af anæstetika negativt.</li>
	<li>Efter administration af ketamin/xylazin barberes det kirurgiske område på højre flanke med barberblad og sæbe. BEMÆRK: Barbering af huden forbedrer sårheling samt de generelle resultater af overlevelsesoperationer.</li>
	<li>Desinficere huden i det kirurgiske område med 70% alkohol først og derefter med povidon jodopløsning ved hjælp af en vatpind.</li>
	<li>Efter hudforberedelsen anbringes musen på et varmebord i en ventral decubitusposition og stabiliserer kropstemperaturen ved 37 °C (overvåges gennem rektal- og padsensorsonder). BEMÆRK: Nyrer er lettere tilgængelige og kirurgisk udsatte, når de placeres i ventral decubitus snarere end lateral.</li>
	<li>Mens kropstemperaturen er stabiliseret, skal du anvende øjensalve på musens øjne. BEMÆRK: Dissociative anæstetika, såsom ketamin, får dyrets øjne til at forblive åbne, mens de bedøves.</li>
</ol>2. Kirurgi
<ol><li>Når smertereflekserne er fraværende (tåknibning med pincet), skal du udføre et ca. 1 cm dorso-lateralt kirurgisk snit på højre flanke ved hjælp af et skalpelblad. Start snittet bag det sidste ribben og fortsæt caudalt ca. 1 cm parallelt med lændehvirvelens midterlinje.</li>
	<li>Transekt abdominal muskulatur ved hjælp af saks for at visualisere det retroperitoneale rum. Fjern de små mængder blod, der produceres under sektionering af musklerne ved hjælp af sterile vatpinde. BEMÆRK: Fordi den dorso-laterale tilgang anvendes, er retroperitoneum, og ikke peritonealhulen, adgang til med denne procedure.</li>
	<li>Skub den højre nyre ud fra bughulen. Brug Graefe pincet til at udsætte nyren omhyggeligt. BEMÆRK: Hold altid pincet lukket for at undgå traumatisk skade på nyren, når den placeres på maven, og brug den kun til omhyggeligt at skubbe og lede nyren mod det kirurgiske snit og ud af det.</li>
	<li>Udsæt langsomt den højre nyre og identificer nyrepedicleen. Fjern forsigtigt fedtvævet omkring pedicleen.</li>
	<li>For at inducere iskæmi skal du placere vaskulærklemmen over nyrearterien og venen, der er til stede i nyrepedicleen, og undgå at klemme den tilstødende urinleder. Brug en Halsted-Mosquito hæmostat til at manipulere vaskulær klemmen. BEMÆRK: Iskæmi bekræftes ved visualisering af en ændring i nyrernes farve fra rødrosa til mørk lilla (figur 1B).</li>
	<li>Dæk den fastspændte nyre med sterilt gasbind gennemblødt i saltvand for at undgå udtørring og lad det stå i 30 minutter.</li>
	<li>Overvåg anæstesidybden og fugtigheden af gasbindet med jævne mellemrum i løbet af denne tid. BEMÆRK: Induktionsdosis af anæstesi er tilstrækkelig til at give analgesi indtil slutningen af den iskæmiske begivenhed; derfor kræves der ingen yderligere bedøvelsesinjektioner.</li>
	<li>Kort før slutningen af iskæmiperioden skal du fjerne gasbindet og afdække nyrerne. Hold Halsted-Mosquito hæmostat, klar til fjernelse af klemme.</li>
	<li>I minut 30 skal du åbne vaskulærklemmen med hæmostaten og fjerne den fra nyrepedicleen for at tillade reperfusion af nyrerne. BEMÆRK: Reperfusion bekræftes ved visualisering af en ændring i nyrernes farve fra mørk lilla til rødrosa (figur 1C).</li>
	<li>Udfør de samme procedurer, der er beskrevet ovenfor for falske dyr uden fastspænding af nyrepedicleen.</li>
	<li>Efter verifikation af nyrefarveændringen skal du returnere nyren til bukhulen. Luk mavemusklerne med absorberbar sutur 5-0 ved hjælp af et korsmønster. BEMÆRK: En anden injektion af anæstetika kan være nødvendig for at opretholde analgesi under suturering af muskler og hud. Halvdelen af den indledende dosis har vist sig effektiv til at give analgesi indtil afslutningen af operationen.</li>
	<li>Luk huden med absorberbar sutur 5-0 ved hjælp af et vandret madrasmønster. Rengør såret med en povidonjodopløsning ved hjælp af en vatpind.</li>
</ol>3. Genopretning og efter operationen
BEMÆRK: Da postkirurgisk tid er den faktiske reperfusionstid, er korrekt postkirurgisk pleje etisk obligatorisk og videnskabeligt relevant. Reperfusionstider kan vælges efter behov af forskeren. Reperfusionstider på 4 timer, 8 timer, 16 timer, 1 dag, 2 dage, 4 dage og 7 dage sammenlignes for at opnå et sekventielt overblik over patologiske ændringer induceret af renal IRI.
<ol><li>Hold musen på varmepuden, indtil den begynder at komme sig efter anæstesi. BEMÆRK: Det anbefales at vente, indtil musen begynder at bevæge benene og forsøger at bevæge sig rundt. I tilfælde, hvor der kræves yderligere bedøvelsesinjektioner under operationen, er restitutionstiden længere. Atipamezol, en alfa-2-receptorantagonist, kan administreres i en dosis på 0,5 mg/ kg legemsvægt intraperitonealt for at vende xylazinvirkningerne og forkorte genopretningsfasen. Til smertebehandling administreres buprenorphin (0,1 mg/kg legemsvægt, intraperitonealt) præoperativt og hver 6. time under restitutions- og postkirurgisk fase. Brugen af ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler frarådes, da flere lægemidler i denne familie inducerer nefrotoksicitet og derfor kan ændre resultaterne.</li>
	<li>Efter genopretning fra anæstesi skal du placere musen tilbage i buret med fri adgang til vand og mad. BEMÆRK: Moset mad kan leveres i en petriskål samt materiale til at gemme og lege (f.eks. Papirark, papirhåndklæderør).</li>
	<li>Overvåg musen dagligt for at vurdere sårheling, mad- og vandindtag, kropsvægt og adfærd. BEMÆRK: Sårhelingsstatus blev vurderet ved hjælp af følgende skala: 1, tør; 2, våd; 3, delvist åbnet; 4, åbnet. Hurtig sårheling blev dokumenteret i denne undersøgelse med mere end 90% af tørre sår efter dag 2.</li>
</ol>4. Eutanasi og prøveindsamling
<ol><li>Musene aflives med natriumpentobarbital administreret intraperitonealt i en dosis, der er dobbelt så stor som bedøvelsesdosis for mus (100 mg/kg).</li>
	<li>Saml væske- og vævsprøver efter behov. BEMÆRK: Både nyrer, fuldblod (til blodcelletal), serum (til blodbiokemi), urin, hjertet og lungerne blev indsamlet. Et par mikroliter serum er nødvendige til blodbiokemianalyse (blodurinstofkvælstof (BUN), kreatinin, elektrolytter). Hvis det er nødvendigt, 24 timer før eutanasi, kan mus placeres i metaboliske bure for at opsamle et højere urinvolumen, der muliggør bestemmelse af nyrefunktionsparametre.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ray, S. C., Mason, J., O'Connor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+renal+injury:+can+renal+anatomy+and+associated+vascular+congestion+explain+why+the+medulla+and+not+the+cortex+is+where+the+trouble+starts.">Ischemic renal injury: can renal anatomy and associated vascular congestion explain why the medulla and not the cortex is where the trouble starts.</a> Seminars in Nephrology. 39 (6), 520-529 (2019).</li><li>Weight, S. C., Bell, P. R., Nicholson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+ischaemia--reperfusion+injury.">Renal ischaemia--reperfusion injury.</a> The British Journal of Surgery. 83 (2), 162-170 (1996).</li><li>Ratliff, B. B., Abdulmahdi, W., Pawar, R., Wolin, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidant+mechanisms+in+renal+injury+and+disease.">Oxidant mechanisms in renal injury and disease.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 25 (3), 119-146 (2016).</li><li>Schrier, R. W., Wang, W., Poole, B., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure:+definitions,+diagnosis,+pathogenesis,+and+therapy.">Acute renal failure: definitions, diagnosis, pathogenesis, and therapy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114 (1), 5-14 (2004).</li><li>Fern&#225;ndez, A. R., S&#225;nchez-Tarjuelo, R., Cravedi, P., Ochando, J., L&#243;pez-Hoyos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Ischemia+reperfusion+injury-a+translational+perspective+in+organ+transplantation.">Review: Ischemia reperfusion injury-a translational perspective in organ transplantation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8549 (2020).</li><li>Wu, C. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+peroxiredoxin+3+as+a+predictor+of+renal+recovery+from+acute+tubular+necrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">Tubular peroxiredoxin 3 as a predictor of renal recovery from acute tubular necrosis in patients with chronic kidney disease.</a> Scientific Reports. 7 (1), 43589 (2017).</li><li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+and+sustained+thioredoxin+analogue+prevents+acute+kidney+injury+and+its-associated+distant+organ+damage+in+renal+ischemia+reperfusion+injury+mice.">Systemic and sustained thioredoxin analogue prevents acute kidney injury and its-associated distant organ damage in renal ischemia reperfusion injury mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 20635 (2020).</li><li>Mishra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+gelatinase-associated+lipocalin+(NGAL)+as+a+biomarker+for+acute+renal+injury+after+cardiac+surgery.">Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a biomarker for acute renal injury after cardiac surgery.</a> Lancet. 365 (9466), 1231-1238 (2005).</li><li>Han, W. K., Bailly, V., Abichandani, R., Thadhani, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+injury+molecule-1+(KIM-1):+A+novel+biomarker+for+human+renal+proximal+tubule+injury.">Kidney injury molecule-1 (KIM-1): A novel biomarker for human renal proximal tubule injury.</a> Kidney International. 62 (1), 237-244 (2002).</li><li>Coca, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+injury+biomarkers+with+clinical+utility:+has+Godot+finally+arrived.">Kidney injury biomarkers with clinical utility: has Godot finally arrived.</a> American Journal of Nephrology. 50 (5), 357-360 (2019).</li><li>Godoy, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment-specific+overexpression+of+redoxins+after+renal+ischemia+and+reperfusion:+protective+roles+of+glutaredoxin+2,+peroxiredoxin+3,+and+peroxiredoxin+6.">Segment-specific overexpression of redoxins after renal ischemia and reperfusion: protective roles of glutaredoxin 2, peroxiredoxin 3, and peroxiredoxin 6.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 51 (2), 552-561 (2011).</li><li>Wei, Q., Dong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+ischemic+acute+kidney+injury:+technical+notes+and+tricks.">Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303 (11), 1487-1494 (2012).</li><li>Gaut, J. P., Liapis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+pathology+and+pathophysiology:+a+retrospective+review.">Acute kidney injury pathology and pathophysiology: a retrospective review.</a> Clinical Kidney Journal. 14 (2), 526-536 (2021).</li><li>Le Clef, N., Verhulst, A., D'Haese, P. C., Vervaet, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+renal+ischemia-reperfusion+as+a+robust+model+for+acute+to+chronic+kidney+injury+in+mice.">Unilateral renal ischemia-reperfusion as a robust model for acute to chronic kidney injury in mice.</a> PLoS One. 11 (3), 0152153 (2016).</li><li>Pelkey, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+physiologic+temperature+variations+during+renal+ischemia+alter+functional+and+morphologic+outcome.">Minimal physiologic temperature variations during renal ischemia alter functional and morphologic outcome.</a> Journal of Vascular Surgery. 15 (4), 619-625 (1992).</li><li>Kennedy, S. E., Erlich, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+renal+ischaemia-reperfusion+injury.">Murine renal ischaemia-reperfusion injury.</a> Nephrology. 13 (5), 390-396 (2008).</li><li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice.">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (78), e50495 (2013).</li><li>Hesketh, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+ischaemia+reperfusion+injury:+a+mouse+model+of+injury+and+regeneration.">Renal ischaemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51816 (2014).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mouse+model+of+chronic+kidney+disease+transitioned+from+ischemic+acute+kidney+injury.">New mouse model of chronic kidney disease transitioned from ischemic acute kidney injury.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 286-295 (2019).</li><li>Basile, D. P., Leonard, E. C., Tonade, D., Friedrich, J. L., Goenka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+on+long-term+function+of+injured+and+contralateral+kidneys+following+unilateral+renal+ischemia-reperfusion.">Distinct effects on long-term function of injured and contralateral kidneys following unilateral renal ischemia-reperfusion.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 302 (5), 625-635 (2012).</li><li>Polichnowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+unilateral+ischemia-reperfusion+injury:+importance+of+renal+counterbalance+and+implications+for+the+AKI-CKD+transition.">Pathophysiology of unilateral ischemia-reperfusion injury: importance of renal counterbalance and implications for the AKI-CKD transition.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (5), 1086-1099 (2020).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter vedrørende denne artikel.

Muse renale IRI-modeller er populære inden for biomedicinsk forskning på grund af deres relativt lave driftsomkostninger og tilgængeligheden af forskellige transgene modeller12. Den ensidige renale IRI-model, der præsenteres her, efterligner karakteristiske patologiske ændringer observeret i human renal IRI, såsom tubulær dilatation, nekrose og fibrose13. Disse resultater er baseret på varierende reperfusionstider.
Kritiske trin i denne protokol omfatter opretholdelse af konstant kropstemperatur og korrekt placering af vaskulærklemmen i nyrepedicleen. Kropstemperatur påvirker dyrets stofskifte14 og ændrer de eksperimentelle resultater både på fysiologisk og cellulært niveau15. I denne model blev kropstemperaturen stabiliseret før operationen ved hjælp af rektale og padsensorprober. Derudover anbefales kontinuerlig overvågning af kropstemperaturen under hele den kirurgiske procedure stærkt, især inden den vaskulære klemme placeres for at inducere iskæmi.
Eksponeringen af nyrerne og den korrekte placering af vaskulærklemmen er også afgørende for eksperimentets succes. Skader på nyrekapslen ved ukorrekt håndtering af tangen under eksponering af nyren gennem det kirurgiske snit vil resultere i perirenal blødning og betændelse. Den vaskulære klemme skal placeres på nyrepedicleen, der okkluderer nyrearterien og nyrevenen uden at påvirke urinlederen og de suprarenale arterier. Afgørende for dette trin er den omhyggelige dissektion af fedtvævet omkring renal hilum14,16.
Denne model er omkostnings- og tidseffektiv. Bedøvelsesforbruget pr. mus var 156,47 ± 37,88 μL (gennemsnitlig ± SD, n = 17) af en forfortyndet ketamin/xylazincocktail (1:10 ketamin, 1:50 xylazin, i saltvand; stamopløsningskoncentration, 100 mg/ml begge). Kirurgi kan udføres i en relativt kort periode. Den samlede operationstid pr. mus var 53 ± 5,23 min (gennemsnitlig ± SD, n = 17). Med uddannet personale kan flere operationer udføres på samme tid. I vores gruppe udførte en erfaren forsker operationen, indtil klemmen blev frigivet fra nyrepediklen, mens en anden overtog fra sårlukning indtil musens genopretning. Med denne tilgang var vi i stand til at udføre et stort antal operationer på en enkelt dag. I denne model brugte vi den dorsolaterale tilgang, hvilket resulterer i mindre traumer og reduceret væske- og varmetab fra bughulen sammenlignet med midterlinjetilgangen16.
Tidligere offentliggjorte protokoller har beskrevet nyrepedikelfastspændingsteknikken til at inducere akut nyreskade hos mus 17,18,19. I disse undersøgelser blev der imidlertid udført en kontralateral nefrektomi ud over den ensidige IRI med iskæmiske tider fra 15 til 26 minutter. I denne protokol inducerede vi ensidig iskæmi i 30 minutter, samtidig med at vi bevarede den kontralaterale nyre. Dette resulterede i en overlevelsesrate på 100%. Denne model er imidlertid ikke egnet til at fremkalde azoterm nyreskade, delvis på grund af den kompenserende virkning, der udøves af den ikke-kirurgisk intervenerede kontralaterale nyre. Men at holde en nyre upåvirket i det samme dyr giver fordelen ved at bruge længere iskæmitider med en højere overlevelsesrate. Ud over dette kan den kontralaterale nyre anvendes til at vurdere mulige bivirkninger af testlægemidler eller behandlinger, der anvendes under den eksperimentelle procedure, og til at studere nyre-nyre krydstalevirkninger20,21. For eksempel har denne model været nyttig til at vise reaktive iltartsinducerede ændringer på celleniveau både i IRI og kontralateral, ikke-kirurgisk interveneret nyre11.
Denne model har en potentiel anvendelse i undersøgelser, der sigter mod at identificere og karakterisere markører for ensidig nyreskade, nyrekrydstaleeffekter, post-renale IRI-inducerede hæmodynamiske ændringer og potentielle nefrotoksiske virkninger af lægemiddelkandidater, der skal anvendes i renal IRI. Denne detaljerede beskrivelse af de vigtigste patologiske ændringer tjener som et værdifuldt værktøj til at vælge det mest passende tidspunkt til at studere specifikke cellulære processer, fra inflammation og nekrose (4 timer til 2 dage) til regenerering (4 dage) og fibrose (7 dage og senere).

Nyrerne er blandt de højeste perfunderede organer i kroppen og er ekstremt modtagelige for ændringer i blodperfusion1. Nyreiskæmi-reperfusionsskade (IRI) er fortsat den hyppigste årsag til akut nyresvigt 2,3 og er forbundet med høj sygelighed og høj dødelighed hos indlagte patienter4. Med begrænsede terapeutiske muligheder til rådighed,4,5 renal IRI er i øjeblikket fokus for flere forskningsindsatser inden for biomedicin 6,7 med henblik på udvikling af nye terapeutiske mål og karakterisering af tidlige og følsomme markører for nyreskade 8,9,10 . At identificere en pålidelig, tids- og omkostningseffektiv dyremodel anses for at være afgørende for at opfylde disse behov. Dette papir præsenterer en enkel og effektiv musemodel af ensidig renal IRI. Iskæmi induceres ved fastspænding af højre nyrepedikel i 30 min11,12. En afgørende del af denne model er at vælge den mest egnede reperfusionstid, der vil reproducere de patologiske hændelser af interesse, såsom tubulær nekrose, polymorfonukleær inflammatorisk celleinfiltration eller fibrose. Derfor får forskerne denne sekventielle oversigt over repræsentative patologiske ændringer, der forventes i IRI-nyrerne.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>PVS8700</td>
			<td>5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>PRMBURPEN22</td>
			<td>0.3 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial euthanasia solution</td>
			<td>various suppliers</td>
			<td>na</td>
			<td>e.g., Euthasol Virbac (sodium pentobarbital 390 mg/mL + sodium phenytoin 50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment Puralube</td>
			<td>Dechra Veterinary Products, KS, USA</td>
			<td>na</td>
			<td>3.5 g (1/8 oz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad RightTempJr</td>
			<td>Kent Scientific, CT, USA</td>
			<td>&#160;RT-JR-20</td>
			<td>Consider the one with two temperature probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>VED1220</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Vascular clamp</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc., Germany</td>
			<td>00398-02</td>
			<td>Jaw dimensions: 5.5 x 1.5 mm; length: 11 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Towel Drapes
</td>
			<td>Kent Scientific, CT, USA 
</td>
			<td>SURGI-5023-3
</td>
			<td>Disposable, individualy packed
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments (Graefe forceps, Halsted-Mosquito hemostat, scissors, etc)</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc., Germany</td>
			<td>Various</td>
			<td>Consider the extra fine straight scissor and the angled Graefe forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl suture</td>
			<td>Ethicon US, LLC</td>
			<td>J493G</td>
			<td>Size 5-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>VAM4821</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury

Iskæmi-reperfusionsskade (IRI) er den førende årsag til akut nyresvigt og er en væsentlig bidragyder til forsinket transplantatfunktion. Dyremodeller er de eneste tilgængelige ressourcer, der efterligner kompleksiteten af de IRI-associerede skader, der opstår in vivo. Dette papir beskriver en effektiv musemodel af ensidig renal IRI, der leverer meget reproducerbare data. Iskæmi induceres ved at okkludere den højre nyrepedikel i 30 minutter efterfulgt af reperfusion. Ud over den kirurgiske procedure vil der blive givet en sekventiel oversigt over de forventede fysiologiske og histopatologiske ændringer efter renal IRI ved at sammenligne data fra syv forskellige reperfusionstider (4 timer, 8 timer, 16 timer, 1 dag, 2 dage, 4 dage og 7 dage). Kritiske data til planlægning af eksperimenter forude, såsom gennemsnitlig kirurgisk tid, gennemsnitligt bedøvelsesforbrug og kropsvægtændringer over tid, vil blive delt. Dette arbejde vil hjælpe forskere med at implementere en pålidelig renal IRI-model og vælge den passende reperfusionstid, der stemmer overens med deres tilsigtede undersøgelsesmål.

Fysiologiske parametre Mus kom sig efter denne ensidige nyre-IRI-operation begivenhedsløst; syntes aktiv og opmærksom; og viste normal spisning, drikke og adfærd den følgende dag. Nogle mus kan have post-IRI vægttab, selv om det normalt er mindre end 10% af den oprindelige kropsvægt (figur 2). Større vægttab (˃10%) kan være skadeligt, og disse dyr bør fjernes fra undersøgelsen. Sham-opererede mus viste ikke ændringer i kropsvægt efter operationen (målt 24 timer efter operationen). De fleste mus genvandt deres oprindelige kropsvægt mellem dag 4 og 7 efter operationen (se IRI 7-dages gruppe, figur 2). Nyrefunktionen kan vurderes ved hjælp af traditionelle markører såsom blodurinstofkvælstof (BUN) og kreatinin. Derudover blev elektrolytniveauer i serum (natrium, kalium og chlorid) og et automatiseret differentielt blodtal inkluderet i analysen.
Histopatologiske ændringer Vurdering af histopatologiske fund blev udført ved anvendelse af 4% paraformaldehydfikseret, paraffinindlejret hele midt-sagittale sektioner af nyren farvet med hæmatoxylin / eosin (HE), periodisk syre Schiff og Massons trikrome pletter. De mest tydelige ændringer, der produceres af denne ensidige renale IRI-model, kan ses ved det kortiko-medullære kryds, specifikt i de proksimale rør, tykke stigende lemmer af Henles løkke og distale indviklede rør såvel som i det rørformede interstitium (se legenden for figur 3). Mikroskopiske billeder, der viser de mest karakteristiske læsioner efter IRI i nyrerne, kan ses i figur 3. En liste over de sekventielle histopatologiske fund findes i tabel 1.
Et rørformet skadesscoringssystem blev udviklet til at kategorisere skaden over tid (figur 4). I dette blev fem definerede ændringer vurderet af tre forskellige evaluatorer: 1) rørformet epiteldæmpning; 2) tab af børstegrænse; 3) rørformet nekrose; 4) luminal obstruktion; og 5) tilstedeværelse af proteinholdig støbning. En tildeling af "1" angiver, at ændringen er til stede, "0", at den er fraværende.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig01.jpg"> Figur 1: Eksperimentel renal IRI-model i mus. (A) Faser af eksperimenter og interventioner (anæstesi induktion, iskæmi og reperfusion) er vist. Bemærk ændringerne i farven på højre nyre til mørk rød under iskæmi (B) til lyserød under reperfusion (C). (D) Makroskopisk udseende af IRI højre nyre (rød pil) sammenlignet med den kontralaterale ikke-IRI nyre af samme dyr 24 timer efter operationen. Rød pil i (B) viser placeringen af den hæmostatiske klemme. Forkortelse: IRI = Iskæmi-reperfusionsskade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig02.jpg"> Figur 2: Musenes kropsvægt før og efter renal IRI. Individuelle data vises. Forkortelser: IRI = Iskæmi-reperfusionsskade; h = timer d = dage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig03.jpg"> Figur 3: Typiske mikroskopiske læsioner observeret i cortex og det kortiko-medullære kryds af IR-opererede mus. Sham og forskellige reperfusionstider vises (angivet over hvert billede). (A) Intakte strukturer er vist i sham (forstørrelse 40x; skala bar = 20 μm). Pile i IRI 4 h angiver tilstedeværelsen af proteinholdig støbt i det rørformede lumen (forstørrelse 40x; skalabjælke = 20 μm). Pile i IRI 8 h viser rørformet dilatation (forstørrelse 40x; skalabjælke = 50 μm). Sort pil i IRI 16 h viser rørformet støbt i medullære segmenter; hvide pile viser områder med cellulær nekrose (forstørrelse 40x; skalabjælke = 50 μm). Sorte pile i IRI 1 d angiver rørformet dilatation (forstørrelse 10x; skalalinje = 100 μm). Sort pil i IRI 2 d viser forstørrede cellekerner; hvide pilespidser viser områder med lymfocyt- og makrofaginfiltration (forstørrelse 40x; skalabjælke = 50 μm). Hvide pilespidser i IRI 4 d angiver mitotiske rørformede celler (forstørrelse 40x; skalalinje = 50 μm). Sort pil i IRI 7 d viser et område med fokal fibrose; hvid pilespids viser et regenereringsområde (forstørrelse 20x; skalabjælke = 100 μm). (B) PAS-farvning, der viser musens nyrebark under tidlig reperfusion (4 timer, 8 timer og 16 timer). Bemærk den progressive dæmpning af penselkanten (pile). Forstørrelser 40x; skalastænger = 50 μm (C) Masson trikrom farvning af sham og IRI 7 d mus, der viser områder med interstitiel fibrose (hvide pile). Forstørrelse 40x; skalastænger = 50 μm. Forkortelser: IRI = Iskæmi-reperfusionsskade; Glo = glomerulus; PCT = proximal indviklet rør; DCT = distal indviklet rør; CD = opsamlingskanal; PAS = periodisk syre Schiff; d = dag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig04.jpg"> Figur 4: Tubular skade score af sham- og IRI-opererede mus. Scoringssystem skala 1 til 5 for rørformet epiteldæmpning; børste grænse tab; rørformet nekrose; luminal obstruktion; og tilstedeværelse af proteinholdig støbning. En tildeling af "1" angiver, at ændringen er til stede, "0", at den er fraværende. Individuelle værdier vises. Søjler repræsenterer middel ± SD (n = 4). Forkortelse: IRI = Iskæmi-reperfusionsskade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tid efter IRI</td>
			<td>Mest betydningsfulde patologiske ændringer</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 timer</td>
			<td>Rørformet obstruktion</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Protein støbt i lumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 timer</td>
			<td>Rørformet dilatation</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Begyndende nekrose</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Dæmpning af epitel</td>
		</tr>
<tr>
<td>16 timer</td>
			<td>Cellulær nekrose</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Rørformet støbning</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Neutrofil infiltration</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 dag</td>
			<td>Nekrose</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Rørformet dilatation</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Neutrofil infiltration</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 dage</td>
			<td>Rørformet dilatation</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Lymfocyt- og makrofaginfiltration</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Forstørrede cellekerner</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 dage</td>
			<td>Fremtrædende mitotisk aktivitet i tubuliceller</td>
		</tr>
<tr>
<td>7 dage</td>
			<td>Fokal fibrose</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Områder med regenerering</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Mest betydningsfulde patologiske ændringer over tid. Diagnosticeret baseret på mikroskopisk undersøgelse af 4-6 dyr pr. Gruppe.

Watch this Scientific Journal Video about An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury at JoVE.com

An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury

Renal iskæmi-reperfusionsskade er forbundet med høj sygelighed og dødelighed hos indlagte patienter. Her præsenterer vi en enkel og effektiv musemodel af ensidig nyreisk iskæmi-reperfusionsskade og giver et sekventielt overblik over repræsentative patologiske ændringer observeret i nyrerne.

En effektiv musemodel af ensidig nyreiskæmi-reperfusionsskade

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models ...

Nyreiskæmi-reperfusionsskade er den førende årsag til akut nyresvigt. Denne model er meget nyttig til at forstå de patofysiologiske ændringer, der opstår i nyrerne efter en iskæmisk fornærmelse. Denne model er tids- og omkostningseffektiv og leverer meget reproducerbare data.Ud over dette giver denne ensidige renale iskæmimodel forskeren mulighed for at arbejde med længere iskæmiske tider, samtidig med at der opretholdes en høj overlevelsesrate. Til at begynde med skal du placere den bedøvede mus på operationsbordet. Efter sterilisering af det kirurgiske område skal du bruge et skalpelblad til at lave et cirka en centimeter dorsal lateralt kirurgisk snit på højre flanke bag ribben og fortsætte coddley cirka en centimeter parallelt med lændehvirvelens midterlinje.Transekt abdominal muskulatur ved hjælp af saks for at visualisere det retroperitoneale rum. Brug en steril vatpind til at fjerne de små mængder blod, der produceres under sektionering af musklerne. Skub derefter den højre nyre ud fra bukhulen.Udsæt langsomt og omhyggeligt nyren med grå tang og identificer nyrepedicleen. Fjern derefter forsigtigt fedtvævet omkring pedicleen. Brug en Halsted Mosquito Hemostat til at manipulere vaskulær klemmen.For at inducere iskæmi skal du placere vaskulærklemmen over nyrearterien og venen, der er til stede i nyrepediklen, undgå at klemme den tilstødende urinleder. Dæk den fastspændte nyre med sterilt gasbind gennemblødt i saltvand for at undgå udtørring. Lad nyrerne være på gasbindet i 30 minutter og overvåg anæstesidybden og fugtigheden af gasbindet med jævne mellemrum.Kort før afslutningen af iskæmiperioden skal du afdække nyren og holde Halsted Mosquito Hemostat, klar til fjernelse af klemme. I slutningen af iskæmiperioden skal du åbne vaskulærklemmen med hæmostaten og fjerne klemmen for at tillade perfusion af nyrerne. For falske kontroldyr skal du udføre den demonstrerede operation uden fastspænding af nyrepediklen.Efter at have verificeret nyrefarveændringen, skal du returnere nyren til bukhulen. Luk mavemusklerne i et korsmønster med absorberbar sutur 5-0. Luk huden i et vandret madrasmønster med absorberbar sutur 5-0.Rengør såret med povidon-jodopløsning. Efter iskæmiperfusionsskaden blev kropsvægtreduktion set hos nogle mus med mindre end 10% af den oprindelige kropsvægt. De fleste mus genvandt dog deres oprindelige kropsvægt mellem dag 4 og 7 efter operationen.Kontrolmusene viste ingen ændringer i kropsvægt efter operationen. Flere ændringer i nyremorfologien efter operationen blev identificeret ved anvendelse af hæmatoxylin-eosin, periodisk syre-Schiff og Massons trikrome farvning. Tilstedeværelsen af proteinholdig støbt i det rørformede lumen blev observeret efter fire timer.Tubulær udvidelse blev detekteret efter otte timer, og rørformet støbning såvel som cellulær nekrose i de medullære segmenter blev bemærket 16 timer efter IRI-operationen. Efter 24 timer efter operationen blev rørformet udvidelse observeret. Infiltration af lymfocytter og makrofager og forstørrede cellekerner blev påvist efter 48 timer.På dag 4 blev mitotiske rørformede celler observeret, og på dag 7 efter IRI-kirurgi blev fokal fibrose detekteret. Musenes nyrebark under tidlig reperfusion blev overvåget ved hjælp af PAS-farvning, og progressiv dæmpning af børstekanten var synlig. Områderne med interstitiel fibrose på dag 7 efter operationen blev visualiseret ved hjælp af Massons Trichome-farvning.Et rørformet skadesscoringssystem blev udviklet til at kategorisere skaden over tid. De højeste tubulære skadescorer blev opnået mellem 8 timer og 24 timer efter Renal IRI. Nogle af de mest kritiske trin er den korrekte placering af vaskulærklemmen i nyrepediklen og opretholdelse af en konstant kropstemperatur under operationen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Iskæmireperfusion Model akut nyreskade og Post Injury Fibrose i mus

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Renal Ischaemia Reperfusion Injury: A Mouse Model of Injury and Regeneration

Renal Iskæmi reperfusionskade: en musemodel af Skade og Regeneration

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ilt-Glucose afsavn og reoxygenering som en<em&gt; In vitro</em&gt; Iskæmireperfusion Skade Model for studere blod-hjerne barrieren dysfunktion

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Murin model af intestinal iskæmi-reperfusionsskade

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

En mus Model of retinaiskæmi-reperfusionsskade Gennem Elevation af intraokulært tryk

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

Two-vessel Occlusion Mouse Model of Cerebral Ischemia-reperfusion

To-fartøj okklusion musemodel af Cerebral iskæmi-reperfusion

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Evaluering af koronar flow reserve efter myokardieiskæmi reperfusion hos rotter

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

En præklinisk rotte model for studiet af iskæmi-reperfusion skade i rekonstruktiv mikrokirurgi

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

Forsinket Intramyokardie levering af stamceller efter Iskæmi Reperfusion Skade i en Murine Model

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...