Name: an effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury
Uploaded: 2021-07-15T14:45:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury at JoVE.com

Een deel van het werk in dit artikel is opgericht door het Center of Integrative Mammalian Research van Ross University School of Veterinary Medicine (RUSVM), Saint Kitts en Nevis. De financiële hulp van het Department of Veterinary Biomedical Sciences van Long Island University College of Veterinary Medicine wordt zeer op prijs gesteld.

Het volgende protocol beschrijft een overlevingsoperatie. Daarom wordt de hoogste aseptische en chirurgische praktijk toegepast. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee. Om gender- en stamgerelateerde verschillen in IRI-effecten te elimineren, werden alleen mannelijke C57BL6-muizen gebruikt in de studie. Alle dieren werden gematcht in leeftijd en gewicht om vergelijkbare resultaten te produceren.
1. Voorbereiding
OPMERKING: Een tijdlijn van de verschillende experimentele fasen en interventies is weergegeven in figuur 1A.
<ol><li>Reinig en desinfecteer de operatietafel voor elke procedure. Bereid en plaats alle benodigde materialen (gesteriliseerde instrumenten en wattenstaafjes, steriel gaas en gordijnen, vooraf verdunde anesthetica, verwarmingspad, gesteriliseerde vasculaire klem, steriele zoutoplossing en huidantiseptica en hechting) op de operatietafel (zie de materiaaltabel).</li>
	<li>Anesthetie mannelijke C57BL6-muizen (leeftijdscategorie 11-13 weken) door intraperitoneale injectie van ketamine/xylazine (respectievelijk 100 mg/kg en 20 mg/kg lichaamsgewicht, eerder verdund in steriele zoutoplossing). OPMERKING: Vakkundig omgaan met dieren is essentieel om stress voor het dier te minimaliseren, omdat stressreacties de werking van anesthetica negatief kunnen beïnvloeden.</li>
	<li>Scheer na toediening van ketamine/xylazine het operatiegebied op de rechterflank met een scheermesje en zeep. OPMERKING: Het scheren van de huid verbetert de wondgenezing en de algemene resultaten van overlevingsoperaties.</li>
	<li>Desinfecteer de huid in het operatiegebied eerst met 70% alcohol en vervolgens met povidon jodiumoplossing met behulp van een wattenstaafje.</li>
	<li>Plaats de muis na de huidvoorbereiding op een verwarmingstafel in een ventrale decubituspositie en stabiliseer de lichaamstemperatuur bij 37 °C (gecontroleerd door rectale en padsensorsondes). OPMERKING: Nieren zijn gemakkelijker toegankelijk en chirurgisch blootgesteld wanneer ze in ventrale decubitus worden geplaatst in plaats van lateraal.</li>
	<li>Terwijl de lichaamstemperatuur wordt gestabiliseerd, brengt u oogzalf aan op de ogen van de muis. OPMERKING: Dissociatieve anesthetica, zoals ketamine, zorgen ervoor dat de ogen van het dier open blijven tijdens het verdoofd zijn.</li>
</ol>2. Operatie
<ol><li>Zodra de pijnreflexen afwezig zijn (teen knijpen met een pincet), voert u een dorso-laterale chirurgische incisie van ongeveer 1 cm uit op de rechterflank met behulp van een scalpelblad. Start de incisie achter de laatste rib en ga caudaal ongeveer 1 cm parallel aan de lumbale middellijn.</li>
	<li>Transect de buikspieren met behulp van een schaar om de retroperitoneale ruimte te visualiseren. Verwijder de kleine hoeveelheden bloed die worden geproduceerd tijdens het doorsnijden van de spieren met behulp van steriele wattenstaafjes. OPMERKING: Omdat de dorso-laterale benadering wordt gebruikt, wordt het retroperitoneum, en niet de peritoneale holte, toegankelijk met deze procedure.</li>
	<li>Duw de rechter nier uit de buikholte. Gebruik graefe tang om de nier zorgvuldig bloot te stellen. OPMERKING: Houd de tang altijd gesloten om traumatisch letsel aan de nier te voorkomen wanneer deze op de buik wordt geplaatst en gebruik deze alleen om de nier voorzichtig naar de chirurgische incisie en eruit te duwen en te leiden.</li>
	<li>Stel langzaam de rechter nier bloot en identificeer de renale pedikel. Verwijder voorzichtig het vetweefsel rond de pedikel.</li>
	<li>Om ischemie te induceren, plaatst u de vasculaire klem over de nierslagader en ader die aanwezig zijn in de nierpikel, waardoor u de aangrenzende urineleider niet klemt. Gebruik een Halsted-Mosquito hemostat voor het manipuleren van de vasculaire klem. OPMERKING: Ischemie wordt bevestigd door de visualisatie van een verandering in kleur van de nier van roodroze naar donkerpaars (figuur 1B).</li>
	<li>Bedek de geklemde nier met steriel gaas gedrenkt in zoutoplossing om uitdroging te voorkomen en laat het 30 minuten staan.</li>
	<li>Controleer de anesthesiediepte en vochtigheid van het gaas periodiek gedurende deze tijd. OPMERKING: De inductiedosis anesthesie is voldoende om analgesie te bieden tot het einde van de ischemische gebeurtenis; daarom zijn er geen extra anesthetische injecties nodig.</li>
	<li>Verwijder kort voor het einde van de ischemieperiode het gaas en ontdek de nier. Houd de Halsted-Mosquito hemostat vast, klaar voor klemverwijdering.</li>
	<li>Open op minuut 30 de vasculaire klem met de hemostat en verwijder deze uit de nierpedikel om reperfusie van de nier mogelijk te maken. OPMERKING: Reperfusie wordt bevestigd door de visualisatie van een verandering in de kleur van de nier van donkerpaars naar roodroze (figuur 1C).</li>
	<li>Voer dezelfde procedures uit die hierboven zijn beschreven voor schijndieren zonder de nier-pedikel te klemmen.</li>
	<li>Na verificatie van de nierkleurverandering, keert u de nier terug naar de buikholte. Sluit de buikspieren met opneembare hechting 5-0 met behulp van een kruispatroon. OPMERKING: Een tweede injectie met anesthetica kan nodig zijn om analgesie te behouden tijdens het hechten van de spieren en de huid. De helft van de aanvangsdosis is effectief gebleken in het verstrekken van analgesie tot het einde van de operatie.</li>
	<li>Sluit de huid met opneembare hechting 5-0 met behulp van een horizontaal matraspatroon. Reinig de wond met een povidon jodiumoplossing met behulp van een wattenstaafje.</li>
</ol>3. Herstel en na de operatie
OPMERKING: Aangezien postoperatieve tijd de werkelijke reperfusietijd is, is goede postoperatieve zorg ethisch verplicht en wetenschappelijk relevant. Reperfusietijden kunnen worden geselecteerd zoals vereist door de onderzoeker. Reperfusietijden van 4 uur, 8 uur, 16 uur, 1 dag, 2 dagen, 4 dagen en 7 dagen worden vergeleken om een sequentieel overzicht te krijgen van pathologische veranderingen geïnduceerd door renale IRI.
<ol><li>Houd de muis op het verwarmingskussen totdat deze begint te herstellen van de anesthesie. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om te wachten totdat de muis zijn poten begint te bewegen en probeert te bewegen. In gevallen waarin extra anesthetische injecties nodig zijn tijdens de operatie, is de hersteltijd langer. Atipamezole, een alfa-2 receptorantagonist, kan intraperitoneaal worden toegediend in een dosis van 0,5 mg/kg lichaamsgewicht om de xylazine-effecten om te keren en de herstelfase te verkorten. Voor pijnbestrijding wordt buprenorfine (0,1 mg/kg lichaamsgewicht, intraperitoneaal) preoperatief en elke 6 uur toegediend tijdens de herstel- en postoperatieve fase. Het gebruik van niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen wordt afgeraden omdat verschillende geneesmiddelen in deze familie nefrotoxiciteit induceren en daarom de resultaten kunnen veranderen.</li>
	<li>Na herstel van de anesthesie plaatst u de muis terug in zijn kooi met vrije toegang tot water en voedsel. OPMERKING: Gepureerd voedsel kan worden verstrekt in een petrischaaltje, evenals materiaal om te verbergen en te spelen (bijv. Papieren vellen, papieren handdoekbuizen).</li>
	<li>Controleer de muis dagelijks om wondgenezing, voedsel- en waterinname, lichaamsgewicht en gedrag te beoordelen. OPMERKING: De wondgenezingsstatus werd beoordeeld met behulp van de volgende schaal: 1, droog; 2, nat; 3, gedeeltelijk geopend; 4, geopend. Snelle wondgenezing werd gedocumenteerd in deze studie, met meer dan 90% van de droge wonden na dag 2.</li>
</ol>4. Euthanasie en monstername
<ol><li>Euthanaseer de muizen met natriumpentobarbital toegediend in een dosis die tweemaal de verdovingsdosis voor muizen is (100 mg / kg).</li>
	<li>Verzamel vloeistof- en weefselmonsters indien nodig. OPMERKING: Zowel nieren, volbloed (voor het aantal bloedcellen), serum (voor bloedbiochemie), urine, het hart en de longen werden verzameld. Een paar microliter serum zijn nodig voor bloedbiochemische analyse (bloedureumstikstof (BUN), creatinine, elektrolyten). Indien nodig kunnen muizen 24 uur voor euthanasie in metabole kooien worden geplaatst om een hoger urinevolume te verzamelen dat de bepaling van nierfunctieparameters mogelijk maakt.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ray, S. C., Mason, J., O'Connor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+renal+injury:+can+renal+anatomy+and+associated+vascular+congestion+explain+why+the+medulla+and+not+the+cortex+is+where+the+trouble+starts.">Ischemic renal injury: can renal anatomy and associated vascular congestion explain why the medulla and not the cortex is where the trouble starts.</a> Seminars in Nephrology. 39 (6), 520-529 (2019).</li><li>Weight, S. C., Bell, P. R., Nicholson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+ischaemia--reperfusion+injury.">Renal ischaemia--reperfusion injury.</a> The British Journal of Surgery. 83 (2), 162-170 (1996).</li><li>Ratliff, B. B., Abdulmahdi, W., Pawar, R., Wolin, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidant+mechanisms+in+renal+injury+and+disease.">Oxidant mechanisms in renal injury and disease.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 25 (3), 119-146 (2016).</li><li>Schrier, R. W., Wang, W., Poole, B., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure:+definitions,+diagnosis,+pathogenesis,+and+therapy.">Acute renal failure: definitions, diagnosis, pathogenesis, and therapy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114 (1), 5-14 (2004).</li><li>Fern&#225;ndez, A. R., S&#225;nchez-Tarjuelo, R., Cravedi, P., Ochando, J., L&#243;pez-Hoyos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Ischemia+reperfusion+injury-a+translational+perspective+in+organ+transplantation.">Review: Ischemia reperfusion injury-a translational perspective in organ transplantation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8549 (2020).</li><li>Wu, C. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+peroxiredoxin+3+as+a+predictor+of+renal+recovery+from+acute+tubular+necrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">Tubular peroxiredoxin 3 as a predictor of renal recovery from acute tubular necrosis in patients with chronic kidney disease.</a> Scientific Reports. 7 (1), 43589 (2017).</li><li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+and+sustained+thioredoxin+analogue+prevents+acute+kidney+injury+and+its-associated+distant+organ+damage+in+renal+ischemia+reperfusion+injury+mice.">Systemic and sustained thioredoxin analogue prevents acute kidney injury and its-associated distant organ damage in renal ischemia reperfusion injury mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 20635 (2020).</li><li>Mishra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+gelatinase-associated+lipocalin+(NGAL)+as+a+biomarker+for+acute+renal+injury+after+cardiac+surgery.">Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a biomarker for acute renal injury after cardiac surgery.</a> Lancet. 365 (9466), 1231-1238 (2005).</li><li>Han, W. K., Bailly, V., Abichandani, R., Thadhani, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+injury+molecule-1+(KIM-1):+A+novel+biomarker+for+human+renal+proximal+tubule+injury.">Kidney injury molecule-1 (KIM-1): A novel biomarker for human renal proximal tubule injury.</a> Kidney International. 62 (1), 237-244 (2002).</li><li>Coca, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+injury+biomarkers+with+clinical+utility:+has+Godot+finally+arrived.">Kidney injury biomarkers with clinical utility: has Godot finally arrived.</a> American Journal of Nephrology. 50 (5), 357-360 (2019).</li><li>Godoy, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment-specific+overexpression+of+redoxins+after+renal+ischemia+and+reperfusion:+protective+roles+of+glutaredoxin+2,+peroxiredoxin+3,+and+peroxiredoxin+6.">Segment-specific overexpression of redoxins after renal ischemia and reperfusion: protective roles of glutaredoxin 2, peroxiredoxin 3, and peroxiredoxin 6.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 51 (2), 552-561 (2011).</li><li>Wei, Q., Dong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+ischemic+acute+kidney+injury:+technical+notes+and+tricks.">Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303 (11), 1487-1494 (2012).</li><li>Gaut, J. P., Liapis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+pathology+and+pathophysiology:+a+retrospective+review.">Acute kidney injury pathology and pathophysiology: a retrospective review.</a> Clinical Kidney Journal. 14 (2), 526-536 (2021).</li><li>Le Clef, N., Verhulst, A., D'Haese, P. C., Vervaet, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+renal+ischemia-reperfusion+as+a+robust+model+for+acute+to+chronic+kidney+injury+in+mice.">Unilateral renal ischemia-reperfusion as a robust model for acute to chronic kidney injury in mice.</a> PLoS One. 11 (3), 0152153 (2016).</li><li>Pelkey, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+physiologic+temperature+variations+during+renal+ischemia+alter+functional+and+morphologic+outcome.">Minimal physiologic temperature variations during renal ischemia alter functional and morphologic outcome.</a> Journal of Vascular Surgery. 15 (4), 619-625 (1992).</li><li>Kennedy, S. E., Erlich, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+renal+ischaemia-reperfusion+injury.">Murine renal ischaemia-reperfusion injury.</a> Nephrology. 13 (5), 390-396 (2008).</li><li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice.">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (78), e50495 (2013).</li><li>Hesketh, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+ischaemia+reperfusion+injury:+a+mouse+model+of+injury+and+regeneration.">Renal ischaemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51816 (2014).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mouse+model+of+chronic+kidney+disease+transitioned+from+ischemic+acute+kidney+injury.">New mouse model of chronic kidney disease transitioned from ischemic acute kidney injury.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 286-295 (2019).</li><li>Basile, D. P., Leonard, E. C., Tonade, D., Friedrich, J. L., Goenka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+on+long-term+function+of+injured+and+contralateral+kidneys+following+unilateral+renal+ischemia-reperfusion.">Distinct effects on long-term function of injured and contralateral kidneys following unilateral renal ischemia-reperfusion.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 302 (5), 625-635 (2012).</li><li>Polichnowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+unilateral+ischemia-reperfusion+injury:+importance+of+renal+counterbalance+and+implications+for+the+AKI-CKD+transition.">Pathophysiology of unilateral ischemia-reperfusion injury: importance of renal counterbalance and implications for the AKI-CKD transition.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (5), 1086-1099 (2020).</li></ol>

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn met betrekking tot dit artikel.

Renale IRI-modellen bij muizen zijn populair in biomedisch onderzoek vanwege hun relatief lage operationele kosten en de beschikbaarheid van diverse transgene modellen12. Het hier gepresenteerde unilaterale renale IRI-model bootst karakteristieke pathologische veranderingen na die zijn waargenomen bij humane renale IRI, zoals tubulaire dilatatie, necrose en fibrose13. Deze resultaten zijn gebaseerd op wisselende reperfusietijden.
Kritieke stappen van dit protocol omvatten het handhaven van een constante lichaamstemperatuur en de juiste plaatsing van de vasculaire klem in de nierpedikel. De lichaamstemperatuur beïnvloedt het metabolisme van het dier14, waardoor de experimentele resultaten zowel op fysiologisch als op cellulair niveau veranderen15. In dit model werd de lichaamstemperatuur vóór de operatie gestabiliseerd met behulp van rectale en padsensorsondes. Bovendien wordt continue controle van de lichaamstemperatuur tijdens de hele chirurgische procedure ten zeerste aanbevolen, vooral voordat de vasculaire klem wordt geplaatst om ischemie te induceren.
De blootstelling van de nier en de juiste plaatsing van de vasculaire klem zijn ook van cruciaal belang voor het succes van het experiment. Schade aan de niercapsule door onjuiste behandeling van de tang tijdens blootstelling van de nier door de chirurgische incisie zal leiden tot perirenale bloeding en ontsteking. De vasculaire klem moet op de nierpedikel worden geplaatst die de nierslagader en de nierader afsluit zonder de urineleider en de suprarenale slagaders te beïnvloeden. Cruciaal voor deze stap is de zorgvuldige dissectie van het vetweefsel rond het nier hilum14,16.
Dit model is kosten- en tijdbesparend. De anesthesieconsumptie per muis was 156,47 ± 37,88 μL (gemiddelde ± SD, n = 17) van een voorverwijde ketamine/xylazinecocktail (1:10 ketamine, 1:50 xylazine, in zoutoplossing; concentratie van de stamoplossing, beide 100 mg/ml). Chirurgie kan in een relatief korte periode worden uitgevoerd. De totale operatietijd per muis was 53 ± 5,23 min (gemiddelde ± SD, n = 17). Met getraind personeel kunnen meerdere operaties tegelijkertijd worden uitgevoerd. In onze groep voerde een ervaren onderzoeker de operatie uit totdat de klem uit de nierpedikel werd losgelaten, terwijl een tweede het overnam van het sluiten van de wond tot het herstel van de muis. Met deze aanpak waren we in staat om een groot aantal operaties op één dag uit te voeren. In dit model gebruikten we de dorsolaterale benadering, wat resulteert in minder trauma en minder vocht- en warmteverlies uit de buikholte in vergelijking met de middellijnbenadering16.
Eerder gepubliceerde protocollen hebben de renale pedikelklemtechniek beschreven om acute nierschade bij muizen te induceren 17,18,19. In die studies werd echter een contralaterale nefrectomie uitgevoerd naast de unilaterale IRI met ischemische tijden variërend van 15 tot 26 min. In dit protocol hebben we unilaterale ischemie gedurende 30 minuten geïnduceerd met behoud van de contralaterale nier. Dit resulteerde in een overlevingskans van 100%. Dit model is echter niet geschikt om azotemische nierschade op te wekken, deels als gevolg van het compenserende effect dat wordt uitgeoefend door de niet-chirurgisch ingegrepen contralaterale nier. Het onaangetast houden van één nier bij hetzelfde dier biedt echter het voordeel van het gebruik van langere ischemietijden met een hogere overlevingskans. Daarnaast kan de contralaterale nier worden gebruikt om mogelijke bijwerkingen van testgeneesmiddelen of behandelingen die tijdens de experimentele procedure worden toegepast te beoordelen en om nier-nieroverspraakeffecten te bestuderen20,21. Dit model is bijvoorbeeld nuttig geweest bij het aantonen van reactieve zuurstofsoort-geïnduceerde veranderingen op cellulair niveau, zowel in de IRI als in de contralaterale, niet-chirurgisch ingegrepen nier11.
Dit model heeft een potentiële toepassing in studies die gericht zijn op het identificeren en karakteriseren van markers van unilaterale nierschade, renale overspraakeffecten, post-renale IRI-geïnduceerde hemodynamische veranderingen en potentiële nefrotoxische effecten van kandidaat-geneesmiddelen voor gebruik bij renale IRI. Deze gedetailleerde beschrijving van de belangrijkste pathologische veranderingen dient als een waardevol hulpmiddel om de meest geschikte tijd te selecteren om specifieke cellulaire processen te bestuderen, van ontsteking en necrose (4 uur tot 2 dagen) tot regeneratie (4 dagen) en fibrose (7 dagen en later).

De nieren behoren tot de hoogste geperfuseerde organen in het lichaam en zijn extreem gevoelig voor veranderingen in bloedperfusie1. Renale ischemie-reperfusieletsel (IRI) blijft de belangrijkste oorzaak van acuut nierfalen 2,3 en wordt geassocieerd met hoge morbiditeit en hoge mortaliteit bij gehospitaliseerde patiënten4. Met beperkte beschikbare therapeutische opties,4,5 is renale IRI momenteel de focus van verschillende onderzoeksinspanningen in de biogeneeskunde 6,7 gericht op de ontwikkeling van nieuwe therapeutische doelen en de karakterisering van vroege en gevoelige markers van nierbeschadiging 8,9,10 . Het identificeren van een betrouwbaar, tijd- en kosteneffectief diermodel wordt als essentieel beschouwd om aan deze behoeften te voldoen. Dit artikel presenteert een eenvoudig en effectief muismodel van unilaterale renale IRI. Ischemie wordt geïnduceerd door het klemmen van de rechter nierpedicula gedurende 30 min11,12. Een cruciaal onderdeel van dit model is het kiezen van de meest geschikte reperfusietijd die de pathologische gebeurtenissen van belang zal reproduceren, zoals tubulaire necrose, polymorfonucleaire ontstekingscelinfiltratie of fibrose. Daarom krijgen onderzoekers dit sequentiële overzicht van representatieve pathologische veranderingen die in de IRI-nier worden verwacht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>PVS8700</td>
			<td>5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>PRMBURPEN22</td>
			<td>0.3 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial euthanasia solution</td>
			<td>various suppliers</td>
			<td>na</td>
			<td>e.g., Euthasol Virbac (sodium pentobarbital 390 mg/mL + sodium phenytoin 50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment Puralube</td>
			<td>Dechra Veterinary Products, KS, USA</td>
			<td>na</td>
			<td>3.5 g (1/8 oz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad RightTempJr</td>
			<td>Kent Scientific, CT, USA</td>
			<td>&#160;RT-JR-20</td>
			<td>Consider the one with two temperature probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>VED1220</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Vascular clamp</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc., Germany</td>
			<td>00398-02</td>
			<td>Jaw dimensions: 5.5 x 1.5 mm; length: 11 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Towel Drapes
</td>
			<td>Kent Scientific, CT, USA 
</td>
			<td>SURGI-5023-3
</td>
			<td>Disposable, individualy packed
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments (Graefe forceps, Halsted-Mosquito hemostat, scissors, etc)</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc., Germany</td>
			<td>Various</td>
			<td>Consider the extra fine straight scissor and the angled Graefe forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl suture</td>
			<td>Ethicon US, LLC</td>
			<td>J493G</td>
			<td>Size 5-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>VAM4821</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury

Ischemie-reperfusieletsel (IRI) is de belangrijkste oorzaak van acuut nierfalen en levert een belangrijke bijdrage aan vertraagde transplantaatfunctie. Diermodellen zijn de enige beschikbare middelen die de complexiteit van de IRI-geassocieerde schade in vivo nabootsen. Dit artikel beschrijft een effectief muismodel van unilaterale renale IRI dat zeer reproduceerbare gegevens levert. Ischemie wordt geïnduceerd door de rechter nierpedicula gedurende 30 minuten af te sluiten, gevolgd door reperfusie. Naast de chirurgische ingreep zal een sequentieel overzicht van de verwachte fysiologische en histopathologische veranderingen na renale IRI worden verstrekt door gegevens van zeven verschillende reperfusietijden (4 h, 8 h, 16 h, 1 dag, 2 dagen, 4 dagen en 7 dagen) te vergelijken. Kritieke gegevens voor het vooruit plannen van experimenten, zoals de gemiddelde chirurgische tijd, het gemiddelde anesthesieverbruik en veranderingen in het lichaamsgewicht in de loop van de tijd, zullen worden gedeeld. Dit werk zal onderzoekers helpen een betrouwbaar nier-IRI-model te implementeren en de juiste reperfusietijd te selecteren die overeenkomt met hun beoogde onderzoeksdoelen.

Fysiologische parameters Muizen herstelden zonder problemen van deze unilaterale renale IRI-operatie; actief en alert verscheen; en vertoonde de volgende dag normaal eten, drinken en gedrag. Sommige muizen kunnen post-IRI lichaamsgewicht verliezen, hoewel het meestal minder dan 10% van het oorspronkelijke lichaamsgewicht is (figuur 2). Grotere gewichtsverlies (˃10%) kan schadelijk zijn en die dieren moeten uit het onderzoek worden verwijderd. Schijngeoperatiede muizen vertoonden geen veranderingen in het lichaamsgewicht na de operatie (gemeten 24 uur na de operatie). De meeste muizen herstelden hun oorspronkelijke lichaamsgewicht tussen dag 4 en 7 na de operatie (zie IRI 7-daagse groep, figuur 2). De nierfunctie kan worden beoordeeld met behulp van traditionele markers zoals bloedureumstikstof (BUN) en creatinine. Bovendien werden elektrolytspiegels in serum (natrium, kalium en chloride) en een geautomatiseerd differentieel bloedbeeld in de analyse opgenomen.
Histopathologische veranderingen Beoordeling van histopathologische bevindingen werd gedaan met behulp van 4% paraformaldehyde-gefixeerde, paraffine-ingebedde hele mid-sagittale delen van de nier gekleurd met hematoxyline / eosine (HE), periodiek zuur Schiff en Masson's trichrome vlekken. De meest duidelijke veranderingen die door dit unilaterale renale IRI-model worden geproduceerd, zijn te zien op de cortico-medullaire overgang, met name in de proximale tubuli, dikke oplopende ledematen van Henle's lus en distale convoluted tubuli, evenals in het buisvormige interstitium (zie de legenda voor figuur 3). Microscopische beelden met de meest karakteristieke laesies na IRI in de nier zijn te zien in figuur 3. Een lijst van de opeenvolgende histopathologische bevindingen is opgenomen in tabel 1.
Er werd een buisvormig letselscoresysteem ontwikkeld om de schade in de loop van de tijd te categoriseren (figuur 4). Hierin werden vijf gedefinieerde veranderingen beoordeeld door drie verschillende beoordelaars: 1) tubulaire epitheliale verzwakking; 2) verlies van borstelrand; 3) tubulaire necrose; 4) luminale obstructie; en 5) aanwezigheid van eiwithoudende cast. Een toewijzing van "1" geeft aan dat de wijziging aanwezig is, "0" dat deze afwezig is.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig01.jpg"> Figuur 1: Experimenteel nier-IRI-model bij muizen. (A) Fasen van experimenten en interventies (anesthesie-inductie, ischemie en reperfusie) worden getoond. Let op de veranderingen in de kleur van de rechter nier naar donkerrood tijdens ischemie (B) naar roze tijdens reperfusie (C). (D) Macroscopisch uiterlijk van de IRI-rechternier (rode pijl) in vergelijking met de contralaterale niet-IRI-nier van hetzelfde dier 24 uur na de operatie. Rode pijl in (B) toont de positie van de hemostatische klem. Afkorting: IRI = Ischemie-reperfusieletsel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig02.jpg"> Figuur 2: Lichaamsgewicht van muizen voor en na renale IRI. Individuele gegevens worden getoond. Afkortingen: IRI = Ischemie-reperfusieletsel; h = uren; d = dagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig03.jpg"> Figuur 3: Typische microscopische laesies waargenomen in de cortex en de cortico-medullaire junctie van IR-geopereerde muizen. Sham en verschillende reperfusietijden worden getoond (aangegeven boven elke foto). (A) Intacte structuren worden in sham weergegeven (vergroting 40x; schaalbalk = 20 μm). Pijlen in IRI 4 h geven de aanwezigheid van eiwitrijk gips in het buisvormige lumen aan (vergroting 40x; schaalbalk = 20 μm). Pijlen in IRI 8 h tonen buisvormige dilatatie (vergroting 40x; schaalbalk = 50 μm). Zwarte pijl in IRI 16 h toont buisvormig gips in medullaire segmenten; witte pijlen tonen gebieden van cellulaire necrose (vergroting 40x; schaalbalk = 50 μm). Zwarte pijlen in IRI 1 d geven buisdilatatie aan (vergroting 10x; schaalbalk = 100 μm). Zwarte pijl in IRI 2 d toont vergrote celkernen; witte pijlpunten tonen gebieden van lymfocyten en macrofaaginfiltratie (vergroting 40x; schaalbalk = 50 μm). Witte pijlpunten in IRI 4 d geven mitotische buiscellen aan (vergroting 40x; schaalbalk = 50 μm). Zwarte pijl in IRI 7 d toont een gebied van focale fibrose; witte pijlpunt toont een gebied van regeneratie (vergroting 20x; schaalbalk = 100 μm). (B) PAS-kleuring die de nierschors van muizen laat zien tijdens vroege reperfusie (4 h, 8 h en 16 h). Let op de geleidelijke verzwakking van de penseelrand (pijlen). Vergrotingen 40x; schaalstaven = 50 μm (C) Masson trichrome kleuring van sham en IRI 7 d muizen met gebieden van interstitiële fibrose (witte pijlen). Vergroting 40x; schaalstaven = 50 μm. Afkortingen: IRI = Ischemie-reperfusieletsel; Glo = glomerulus; PCT = proximale convoluted tubulus; DCT = distale convoluted tubulus; CD = opvangkanaal; PAS = periodiek zuur Schiff; d = dag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig04.jpg"> Figuur 4: Tubulaire letselscore van schijn- en IRI-geopereerde muizen. Scoresysteem schaal 1 tot 5 voor buisvormige epitheliale demping; verlies van borstelranden; tubulaire necrose; luminale obstructie; en aanwezigheid van eiwithoudende cast. Een toewijzing van "1" geeft aan dat de wijziging aanwezig is, "0" dat deze afwezig is. Individuele waarden worden weergegeven. Balken vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD (n = 4). Afkorting: IRI = Ischemie-reperfusieletsel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tijd na IRI</td>
			<td>Belangrijkste pathologische veranderingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 u</td>
			<td>Buisvormige obstructie</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Eiwit gegoten in lumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 u</td>
			<td>Buisvormige dilatatie</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Beginnende necrose</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Verzwakking van epitheel</td>
		</tr>
<tr>
<td>16 u</td>
			<td>Cellulaire necrose</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Buisvormig gietstuk</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Neutrofiele infiltratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 dag</td>
			<td>Necrose</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Buisvormige dilatatie</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Neutrofiele infiltratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 dagen</td>
			<td>Buisvormige dilatatie</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Lymfocyten- en macrofaaginfiltratie</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Vergrote celkernen</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 dagen</td>
			<td>Prominente mitotische activiteit in tubuluscellen</td>
		</tr>
<tr>
<td>7 dagen</td>
			<td>Focale fibrose</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Regeneratiegebieden</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Belangrijkste pathologische veranderingen in de loop van de tijd. Gediagnosticeerd op basis van microscopisch onderzoek van 4-6 dieren per groep.

Watch this Scientific Journal Video about An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury at JoVE.com

An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury

Renale ischemie-reperfusie letsel is geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit bij gehospitaliseerde patiënten. Hier presenteren we een eenvoudig en effectief muismodel van unilaterale renale ischemie-reperfusieletsel en geven we een sequentieel overzicht van representatieve pathologische veranderingen waargenomen in de nier.

Een effectief muismodel van unilaterale renale ischemie-reperfusieletsel

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models ...

Renale ischemie-reperfusie letsel is de belangrijkste oorzaak van acuut nierfalen. Dit model is zeer nuttig voor het begrijpen van de pathofysiologische veranderingen die optreden in de nier na een ischemische belediging. Dit model is tijd- en kosteneffectief en levert zeer reproduceerbare gegevens.Daarnaast stelt dit unilaterale renale ischemiemodel de onderzoeker in staat om met langere ischemische tijden te werken met behoud van een hoge overlevingskans. Plaats om te beginnen de verdoofde muis op de operatietafel. Gebruik na het steriliseren van het chirurgische gebied een scalpelblad om een dorsale laterale chirurgische incisie van ongeveer een centimeter op de rechterflank achter de rib te maken en ongeveer een centimeter parallel aan de lumbale middellijn voort te zetten.Transect de buikspieren met behulp van een schaar om de retroperitoneale ruimte te visualiseren. Gebruik een steriel wattenstaafje om de kleine hoeveelheden bloed te verwijderen die worden geproduceerd tijdens het doorsnijden van de spieren. Duw vervolgens de rechter nier uit de buikholte.Stel de nier langzaam en voorzichtig bloot met een grijze tang en identificeer de nierpedikel. Verwijder vervolgens voorzichtig het vetweefsel rond de pedikel. Gebruik een Halsted Mosquito Hemostat voor het manipuleren van de vasculaire klem.Voor het induceren van de ischemie, plaatst u de vasculaire klem over de nierslagader en ader die aanwezig zijn in de nierpikel en vermijdt u het klemmen van de aangrenzende urineleider. Bedek de geklemde nier met steriel gaas gedrenkt in zoutoplossing om uitdroging te voorkomen. Laat de nieren gedurende 30 minuten op het gaas en controleer periodiek de anesthesiediepte en vochtigheid van het gaas.Kort voor het einde van de ischemieperiode, onthul de nier en houd de Halsted Mosquito Hemostat, klaar voor klemverwijdering. Aan het einde van de ischemieperiode opent u de vasculaire klem met de hemostaat en verwijdert u de klem om perfusie van de nier mogelijk te maken. Voor schijncontroledieren, voer de aangetoonde operatie uit zonder de nierpedicula te klemmen.Na het verifiëren van de nierkleurverandering, keert u de nier terug naar de buikholte. Sluit de buikspieren in een kruispatroon met opneembare hechting 5-0. Sluit de huid in een horizontaal matraspatroon met opneembare hechting 5-0.Reinig de wond met povidon-jodiumoplossing. Na de ischemie perfusie verwonding werd vermindering van het lichaamsgewicht gezien bij sommige muizen met minder dan 10% van het oorspronkelijke lichaamsgewicht. De meeste muizen herstelden echter hun oorspronkelijke lichaamsgewicht tussen dag 4 en 7 postoperatie.De controlemuizen vertoonden geen veranderingen in het lichaamsgewicht na de operatie. Verschillende veranderingen in de renale morfologie na de operatie werden geïdentificeerd met behulp van hematoxyline-eosine, periodiek zuur-Schiff en Masson's Trichrome-kleuring. De aanwezigheid van eiwitrijk gips in het buisvormige lumen werd na vier uur waargenomen.Tubulaire dilatatie werd na acht uur gedetecteerd en tubulair gips en cellulaire necrose in de medullaire segmenten werden opgemerkt 16 uur na IRI-chirurgie. Na 24 uur na de operatie werd tubulaire dilatatie waargenomen. Infiltratie van lymfocyten en macrofagen en vergrote celkernen werden na 48 uur gedetecteerd.Op dag 4 werden mitotische tubulaire cellen waargenomen en op dag 7 na de IRI-operatie werd focale fibrose gedetecteerd. De renale cortex van de muizen tijdens vroege reperfusie werd gecontroleerd met behulp van PAS-kleuring en progressieve verzwakking van de borstelrand was zichtbaar. De gebieden van interstitiële fibrose op dag 7 na de operatie werden gevisualiseerd met behulp van Masson's Trichome-kleuring.Er werd een buisvormig letselscoresysteem ontwikkeld om de schade in de loop van de tijd te categoriseren. De hoogste scores voor tubulair letsel werden verkregen tussen 8 uur en 24 uur na renale IRI. Enkele van de meest kritieke stappen zijn de juiste plaatsing van de vasculaire klem in de nierpedikel en het handhaven van een constante lichaamstemperatuur tijdens de operatie.

Research

JoVE Journal

Medicine

Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury

Normotherme hartstilstand en cardiopulmonale reanimatie: een muismodel van ischemie-reperfusie schade

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischemie-reperfusie model van Acute Kidney Injury en Post Letsel Fibrosis in Muizen

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Renal Ischaemia Reperfusion Injury: A Mouse Model of Injury and Regeneration

Renale ischemie reperfusie schade: een muismodel van letsel en Regeneratie

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Zuurstof-Glucose beroving en reoxygenatie als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischemie-reperfusie letsel model voor de studie bloed-hersenbarrière Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Muizenmodel van Intestinale ischemie-reperfusie schade

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Een muismodel van retinale ischemie-reperfusie letsel door misbruik van intra-oculaire druk

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

Two-vessel Occlusion Mouse Model of Cerebral Ischemia-reperfusion

Muismodel van twee-schip occlusie van cerebrale ischemie-reperfusie

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Evaluatie van coronaire stroom reserve na myocardiale ischemie reperfusie bij ratten

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

Een pre-klinische rat model voor de studie van ischemie-reperfusie letsel in reconstructieve microchirurgie

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

Vertraagde intramyocardial levering van stamcellen na Ischemie Reperfusie Letsel in een Murine Model

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...