Name: an effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury
Uploaded: 2021-07-15T14:45:00
Duration: 5 min 53 s
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Una parte del lavoro mostrato in questo articolo è stata fondata dal Center of Integrative Mammalian Research della Ross University School of Veterinary Medicine (RUSVM), Saint Kitts e Nevis. L'aiuto finanziario fornito dal Dipartimento di Scienze Biomediche Veterinarie del Long Island University College of Veterinary Medicine è molto apprezzato.

Il seguente protocollo descrive un intervento chirurgico di sopravvivenza. Pertanto, viene applicata la più alta pratica asettica e chirurgica. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Per eliminare le differenze di genere e basate sul ceppo negli effetti IRI, nello studio sono stati utilizzati solo topi maschi C57BL6. Tutti gli animali sono stati abbinati per età e peso per produrre risultati comparabili.
1. Preparazione
NOTA: Una cronologia delle diverse fasi sperimentali e degli interventi è mostrata nella Figura 1A.
<ol><li>Pulire e disinfettare il tavolo chirurgico prima di ogni procedura. Preparare e posizionare tutti i materiali necessari (strumenti sterilizzati e tamponi di cotone, garza e teli sterili, anestetici pre-diluiti, termoforo, morsetto vascolare sterilizzato, soluzione salina sterile e antisettici e sutura della pelle) sul tavolo chirurgico (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Anestetizzare topi maschi C57BL6 (fascia di età 11-13 settimane) mediante iniezione intraperitoneale di ketamina/xilazina (rispettivamente 100 mg/kg e 20 mg/kg di peso corporeo, precedentemente diluiti in soluzione salina sterile). NOTA: la manipolazione qualificata degli animali è essenziale per ridurre al minimo lo stress per l'animale, poiché le risposte allo stress possono influire negativamente sull'azione degli anestetici.</li>
	<li>Dopo la somministrazione di ketamina / xilazina, radere l'area chirurgica sul fianco destro usando una lama di rasoio e sapone. NOTA: La rasatura della pelle migliora la guarigione delle ferite e gli esiti generali degli interventi chirurgici di sopravvivenza.</li>
	<li>Disinfettare la pelle nell'area chirurgica con alcool al 70% prima e poi con soluzione di iodio povidone utilizzando un batuffolo di cotone.</li>
	<li>Dopo la preparazione della pelle, posizionare il mouse su un tavolo riscaldante in posizione di decubito ventrale e stabilizzare la temperatura corporea a 37 °C (monitorata tramite sonde rettali e sensori pad). NOTA: i reni sono più facilmente accessibili ed esposti chirurgicamente quando collocati in decubito ventrale piuttosto che laterale.</li>
	<li>Mentre la temperatura corporea è stabilizzata, applicare l'unguento per gli occhi agli occhi del mouse. NOTA: gli anestetici dissociativi, come la ketamina, fanno sì che gli occhi dell'animale rimangano aperti durante l'anestesia.</li>
</ol>2. Chirurgia
<ol><li>Una volta che i riflessi del dolore sono assenti (pizzicamento della punta con una pinzetta), eseguire un'incisione chirurgica dorso-laterale di circa 1 cm sul fianco destro utilizzando una lama di bisturi. Iniziare l'incisione dietro l'ultima costola e continuare caudale per circa 1 cm parallelamente alla linea mediana lombare.</li>
	<li>Transect la muscolatura addominale usando le forbici per visualizzare lo spazio retroperitoneale. Rimuovere le piccole quantità di sangue prodotte durante il sezionamento dei muscoli utilizzando tamponi di cotone sterili. NOTA: poiché viene utilizzato l'approccio dorso-laterale, è possibile accedere al retroperitoneo e non alla cavità peritoneale con questa procedura.</li>
	<li>Spingere il rene destro fuori dalla cavità addominale. Utilizzare pinze Graefe per esporre il rene con attenzione. NOTA: Tenere sempre la pinza chiusa per evitare lesioni traumatiche al rene quando posizionata sull'addome e utilizzarla solo per spingere e guidare con attenzione il rene verso l'incisione chirurgica e fuori di essa.</li>
	<li>Esporre lentamente il rene destro e identificare il peduncolo renale. Rimuovere con cura il tessuto adiposo intorno al peduncolo.</li>
	<li>Per indurre l'ischemia, posizionare il morsetto vascolare sopra l'arteria renale e la vena presenti nel peduncolo renale, evitando di bloccare l'uretere adiacente. Utilizzare un emostato Halsted-Mosquito per manipolare il morsetto vascolare. NOTA: L'ischemia è confermata dalla visualizzazione di un cambiamento di colore del rene dal rosso-rosa al viola scuro (Figura 1B).</li>
	<li>Coprire il rene bloccato con una garza sterile imbevuta di soluzione salina per evitare l'essiccazione e lasciarlo per 30 minuti.</li>
	<li>Monitorare periodicamente la profondità dell'anestesia e l'umidità della garza durante questo periodo. NOTA: La dose di induzione dell'anestesia è sufficiente a fornire analgesia fino alla fine dell'evento ischemico; quindi, non sono necessarie ulteriori iniezioni di anestetico.</li>
	<li>Poco prima della fine del periodo di ischemia, rimuovere la garza e scoprire il rene. Tenere l'emostato Halsted-Mosquito, pronto per la rimozione del morsetto.</li>
	<li>Al minuto 30, aprire il morsetto vascolare con l'emostato e rimuoverlo dal peduncolo renale per consentire la riperfusione del rene. NOTA: La riperfusione è confermata dalla visualizzazione di un cambiamento nel colore del rene dal viola scuro al rosso-rosa (Figura 1C).</li>
	<li>Eseguire le stesse procedure sopra descritte per gli animali finti senza bloccare il peduncolo renale.</li>
	<li>Dopo la verifica del cambiamento di colore del rene, riportare il rene nella cavità addominale. Chiudere i muscoli addominali con sutura riassorbibile 5-0 usando un motivo crociato. NOTA: Può essere necessaria una seconda iniezione di anestetici per mantenere l'analgesia durante la sutura dei muscoli e della pelle. Metà della dose iniziale si è dimostrata efficace nel fornire analgesia fino alla conclusione dell'intervento chirurgico.</li>
	<li>Chiudere la pelle con sutura riassorbibile 5-0 utilizzando un modello di materasso orizzontale. Pulire la ferita con una soluzione di iodio povidone usando un batuffolo di cotone.</li>
</ol>3. Recupero e post-chirurgia
NOTA: Poiché il tempo post-chirurgico è il tempo effettivo di riperfusione, un'adeguata assistenza post-chirurgica è eticamente obbligatoria e scientificamente rilevante. I tempi di riperfusione possono essere selezionati come richiesto dal ricercatore. I tempi di riperfusione di 4 h, 8 h, 16 h, 1 giorno, 2 giorni, 4 giorni e 7 giorni vengono confrontati per ottenere una panoramica sequenziale dei cambiamenti patologici indotti dall'IRI renale.
<ol><li>Tenere il mouse sulla piastra riscaldante fino a quando non inizia a riprendersi dall'anestesia. NOTA: si consiglia di attendere che il mouse inizi a muovere le gambe e tenti di muoversi. Nei casi in cui sono necessarie ulteriori iniezioni di anestetico durante l'intervento chirurgico, il tempo di recupero è più lungo. L'atipamezolo, un antagonista del recettore alfa-2, può essere somministrato alla dose di 0,5 mg/kg di peso corporeo per via intraperitoneale per invertire gli effetti della xilazina e abbreviare la fase di recupero. Per la gestione del dolore, la buprenorfina (0,1 mg/kg di peso corporeo, per via intraperitoneale) viene somministrata pre-operatoriamente e ogni 6 ore durante la fase di recupero e post-chirurgica. L'uso di farmaci antinfiammatori non steroidei è scoraggiato in quanto diversi farmaci di questa famiglia inducono nefrotossicità e possono, quindi, alterare i risultati.</li>
	<li>Dopo il recupero dall'anestesia, riposizionare il topo nella sua gabbia con libero accesso all'acqua e al cibo. NOTA: il purè di cibo può essere fornito in una capsula di Petri e materiale per nascondersi e giocare (ad esempio, fogli di carta, tubi di carta assorbente).</li>
	<li>Monitorare il topo ogni giorno per valutare la guarigione delle ferite, l'assunzione di cibo e acqua, il peso corporeo e il comportamento. NOTA: lo stato di guarigione delle ferite è stato valutato utilizzando la seguente scala: 1, secco; 2, bagnato; 3, parzialmente aperto; 4, aperto. La guarigione rapida delle ferite è stata documentata in questo studio, con oltre il 90% delle ferite secche dopo il giorno 2.</li>
</ol>4. Eutanasia e raccolta dei campioni
<ol><li>Eutanasia dei topi con pentobarbital di sodio somministrato per via intraperitoneale ad una dose che è il doppio della dose anestetica per i topi (100 mg/kg).</li>
	<li>Raccogliere campioni di liquidi e tessuti secondo necessità. NOTA: Sono stati raccolti entrambi i reni, il sangue intero (per la conta delle cellule del sangue), il siero (per la biochimica del sangue), l'urina, il cuore e i polmoni. Alcuni microlitri di siero sono necessari per l'analisi biochimica del sangue (azoto ureico nel sangue (BUN), creatinina, elettroliti). Se necessario, 24 ore prima dell'eutanasia, i topi possono essere collocati in gabbie metaboliche per raccogliere un volume di urina più elevato che consente la determinazione dei parametri di funzionalità renale.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ray, S. C., Mason, J., O'Connor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+renal+injury:+can+renal+anatomy+and+associated+vascular+congestion+explain+why+the+medulla+and+not+the+cortex+is+where+the+trouble+starts.">Ischemic renal injury: can renal anatomy and associated vascular congestion explain why the medulla and not the cortex is where the trouble starts.</a> Seminars in Nephrology. 39 (6), 520-529 (2019).</li><li>Weight, S. C., Bell, P. R., Nicholson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+ischaemia--reperfusion+injury.">Renal ischaemia--reperfusion injury.</a> The British Journal of Surgery. 83 (2), 162-170 (1996).</li><li>Ratliff, B. B., Abdulmahdi, W., Pawar, R., Wolin, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidant+mechanisms+in+renal+injury+and+disease.">Oxidant mechanisms in renal injury and disease.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 25 (3), 119-146 (2016).</li><li>Schrier, R. W., Wang, W., Poole, B., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure:+definitions,+diagnosis,+pathogenesis,+and+therapy.">Acute renal failure: definitions, diagnosis, pathogenesis, and therapy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114 (1), 5-14 (2004).</li><li>Fern&#225;ndez, A. R., S&#225;nchez-Tarjuelo, R., Cravedi, P., Ochando, J., L&#243;pez-Hoyos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Ischemia+reperfusion+injury-a+translational+perspective+in+organ+transplantation.">Review: Ischemia reperfusion injury-a translational perspective in organ transplantation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8549 (2020).</li><li>Wu, C. -. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment-specific+overexpression+of+redoxins+after+renal+ischemia+and+reperfusion:+protective+roles+of+glutaredoxin+2,+peroxiredoxin+3,+and+peroxiredoxin+6.">Segment-specific overexpression of redoxins after renal ischemia and reperfusion: protective roles of glutaredoxin 2, peroxiredoxin 3, and peroxiredoxin 6.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 51 (2), 552-561 (2011).</li><li>Wei, Q., Dong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+ischemic+acute+kidney+injury:+technical+notes+and+tricks.">Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303 (11), 1487-1494 (2012).</li><li>Gaut, J. P., Liapis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+pathology+and+pathophysiology:+a+retrospective+review.">Acute kidney injury pathology and pathophysiology: a retrospective review.</a> Clinical Kidney Journal. 14 (2), 526-536 (2021).</li><li>Le Clef, N., Verhulst, A., D'Haese, P. C., Vervaet, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+renal+ischemia-reperfusion+as+a+robust+model+for+acute+to+chronic+kidney+injury+in+mice.">Unilateral renal ischemia-reperfusion as a robust model for acute to chronic kidney injury in mice.</a> PLoS One. 11 (3), 0152153 (2016).</li><li>Pelkey, T. 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(88), e51816 (2014).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mouse+model+of+chronic+kidney+disease+transitioned+from+ischemic+acute+kidney+injury.">New mouse model of chronic kidney disease transitioned from ischemic acute kidney injury.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 286-295 (2019).</li><li>Basile, D. P., Leonard, E. C., Tonade, D., Friedrich, J. L., Goenka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+on+long-term+function+of+injured+and+contralateral+kidneys+following+unilateral+renal+ischemia-reperfusion.">Distinct effects on long-term function of injured and contralateral kidneys following unilateral renal ischemia-reperfusion.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 302 (5), 625-635 (2012).</li><li>Polichnowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+unilateral+ischemia-reperfusion+injury:+importance+of+renal+counterbalance+and+implications+for+the+AKI-CKD+transition.">Pathophysiology of unilateral ischemia-reperfusion injury: importance of renal counterbalance and implications for the AKI-CKD transition.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (5), 1086-1099 (2020).</li></ol>

Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse riguardo a questo articolo.

I modelli IRI renali murini sono popolari nella ricerca biomedica grazie ai loro costi operativi relativamente bassi e alla disponibilità di diversi modelli transgenici12. Il modello IRI renale unilaterale qui presentato imita i cambiamenti patologici caratteristici osservati nell'IRI renale umano come la dilatazione tubulare, la necrosi e la fibrosi13. Questi risultati si basano su tempi di riperfusione variabili.
I passaggi critici di questo protocollo includono il mantenimento di una temperatura corporea costante e il corretto posizionamento del morsetto vascolare nel peduncolo renale. La temperatura corporea influenza il metabolismo dell'animale14, alterando i risultati sperimentali sia a livello fisiologico che cellulare15. In questo modello, la temperatura corporea è stata stabilizzata prima dell'intervento chirurgico utilizzando sonde rettali e sensori pad. Inoltre, il monitoraggio continuo della temperatura corporea durante l'intera procedura chirurgica è altamente raccomandato, soprattutto prima di posizionare il morsetto vascolare per indurre l'ischemia.
Anche l'esposizione del rene e il corretto posizionamento del morsetto vascolare sono fondamentali per il successo dell'esperimento. Il danno alla capsula renale da manipolazione impropria della pinza durante l'esposizione del rene attraverso l'incisione chirurgica comporterà emorragia perirenale e infiammazione. Il morsetto vascolare deve essere posizionato sul peduncolo renale occludendo l'arteria renale e la vena renale senza influenzare l'uretere e le arterie surrenali. Fondamentale per questo passaggio è l'attenta dissezione del tessuto adiposo che circonda l'ilume renale14,16.
Questo modello è conveniente in termini di costi e tempi. Il consumo di anestetici per topo è stato di 156,47 ± 37,88 μL (media ± SD, n = 17) di un cocktail prediluito di ketamina/xilazina (1:10 ketamina, 1:50 xilazina, in soluzione salina; concentrazione di soluzione madre, 100 mg/mL entrambi). La chirurgia può essere eseguita in un periodo relativamente breve. Il tempo totale di intervento chirurgico per topo è stato di 53 ± 5,23 minuti (media ± SD, n = 17). Con personale qualificato, è possibile eseguire diversi interventi chirurgici contemporaneamente. Nel nostro gruppo, un ricercatore esperto ha eseguito l'intervento chirurgico fino a quando il morsetto è stato rilasciato dal peduncolo renale, mentre un secondo ha preso il posto della chiusura della ferita fino al recupero del topo. Con questo approccio, siamo stati in grado di eseguire un numero elevato di interventi chirurgici in un solo giorno. In questo modello, abbiamo utilizzato l'approccio dorsolaterale, che si traduce in meno traumi e ridotta perdita di liquidi e calore dalla cavità addominale rispetto all'approccio della linea mediana16.
Protocolli precedentemente pubblicati hanno descritto la tecnica di bloccaggio del peduncolo renale per indurre un danno renale acuto nei topi 17,18,19. Tuttavia, in questi studi, è stata eseguita una nefrectomia controlaterale in aggiunta all'IRI unilaterale con tempi ischemici che vanno da 15 a 26 min. In questo protocollo, abbiamo indotto ischemia unilaterale per 30 minuti preservando il rene controlaterale. Ciò ha comportato un tasso di sopravvivenza del 100%. Tuttavia, questo modello non è adatto a indurre danno renale azotemico dovuto in parte all'effetto compensatorio esercitato dal rene controlaterale non intervenuto chirurgicamente. Tuttavia, mantenere un rene inalterato nello stesso animale offre il vantaggio di utilizzare tempi di ischemia più lunghi con un tasso di sopravvivenza più elevato. Oltre a questo, il rene controlaterale può essere utilizzato per valutare i possibili effetti collaterali dei farmaci di prova o dei trattamenti applicati durante la procedura sperimentale e per studiare gli effetti della diafonia rene-rene20,21. Ad esempio, questo modello è stato utile nel mostrare alterazioni indotte da specie reattive dell'ossigeno a livello cellulare sia nell'IRI che nel rene11 controlaterale, non intervento chirurgico.
Questo modello ha una potenziale applicazione in studi volti a identificare e caratterizzare marcatori di danno renale unilaterale, effetti crosstalk renali, cambiamenti emodinamici indotti da IRI post-renale e potenziali effetti nefrotossici di farmaci candidati da utilizzare nell'IRI renale. Questa descrizione dettagliata dei principali cambiamenti patologici serve come prezioso strumento per selezionare il momento più adatto per studiare specifici processi cellulari, dall'infiammazione e necrosi (da 4 h a 2 giorni) alla rigenerazione (4 giorni) e alla fibrosi (7 giorni e successivi).

I reni sono tra i più alti organi perfusi nel corpo e sono estremamente suscettibili ai cambiamenti nella perfusione di sangue1. Il danno da ischemia-riperfusione renale (IRI) rimane la principale causa di insufficienza renale acuta 2,3 ed è associato ad alta morbilità e alta mortalità nei pazienti ospedalizzati4. Con limitate opzioni terapeutiche disponibili,4,5 l'IRI renale è attualmente al centro di diversi sforzi di ricerca in biomedicina 6,7 volti allo sviluppo di nuovi bersagli terapeutici e alla caratterizzazione di marcatori precoci e sensibili di danno renale 8,9,10 . Identificare un modello animale affidabile, efficiente in termini di tempo e di costi è considerato essenziale per soddisfare queste esigenze. Questo documento presenta un modello murino semplice ed efficace di IRI renale unilaterale. L'ischemia è indotta dal bloccaggio del peduncolo renale destro per 30 min 11,12. Una parte cruciale di questo modello è la scelta del tempo di riperfusione più adatto che riprodurrà gli eventi patologici di interesse, come la necrosi tubulare, l'infiltrazione di cellule infiammatorie polimorfonucleate o la fibrosi. Pertanto, ai ricercatori viene fornita questa panoramica sequenziale dei cambiamenti patologici rappresentativi attesi nel rene IRI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>PVS8700</td>
			<td>5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>PRMBURPEN22</td>
			<td>0.3 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial euthanasia solution</td>
			<td>various suppliers</td>
			<td>na</td>
			<td>e.g., Euthasol Virbac (sodium pentobarbital 390 mg/mL + sodium phenytoin 50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment Puralube</td>
			<td>Dechra Veterinary Products, KS, USA</td>
			<td>na</td>
			<td>3.5 g (1/8 oz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad RightTempJr</td>
			<td>Kent Scientific, CT, USA</td>
			<td>&#160;RT-JR-20</td>
			<td>Consider the one with two temperature probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>VED1220</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Vascular clamp</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc., Germany</td>
			<td>00398-02</td>
			<td>Jaw dimensions: 5.5 x 1.5 mm; length: 11 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Towel Drapes
</td>
			<td>Kent Scientific, CT, USA 
</td>
			<td>SURGI-5023-3
</td>
			<td>Disposable, individualy packed
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments (Graefe forceps, Halsted-Mosquito hemostat, scissors, etc)</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc., Germany</td>
			<td>Various</td>
			<td>Consider the extra fine straight scissor and the angled Graefe forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl suture</td>
			<td>Ethicon US, LLC</td>
			<td>J493G</td>
			<td>Size 5-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>VAM4821</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury

Il danno da ischemia-riperfusione (IRI) è la principale causa di insufficienza renale acuta ed è un contributo significativo al ritardo della funzione dell'innesto. I modelli animali sono le uniche risorse disponibili che imitano le complessità dei danni associati all'IRI incontrati in vivo. Questo documento descrive un modello murino efficace di IRI renale unilaterale che fornisce dati altamente riproducibili. L'ischemia è indotta dall'occlusione del peduncolo renale destro per 30 minuti seguito da riperfusione. Oltre alla procedura chirurgica, verrà fornita una panoramica sequenziale dei cambiamenti fisiologici e istopatologici attesi a seguito dell'IRI renale confrontando i dati di sette diversi tempi di riperfusione (4 h, 8 h, 16 h, 1 giorno, 2 giorni, 4 giorni e 7 giorni). Saranno condivisi i dati critici per pianificare gli esperimenti in anticipo, come il tempo chirurgico medio, il consumo medio di anestetici e le variazioni di peso corporeo nel tempo. Questo lavoro aiuterà i ricercatori a implementare un modello IRI renale affidabile e selezionare il tempo di riperfusione appropriato che si allinea con i loro obiettivi investigativi previsti.

Parametri fisiologici I topi si sono ripresi da questo intervento chirurgico IRI renale unilaterale senza problemi; apparso attivo e vigile; e ha mostrato un normale mangiare, bere e comportarsi entro il giorno seguente. Alcuni topi possono avere una perdita di peso corporeo post-IRI, anche se di solito è inferiore al 10% del peso corporeo iniziale (Figura 2). Maggiori perdite di peso corporeo (˃10%) possono essere dannose e quegli animali dovrebbero essere rimossi dallo studio. I topi operati da Sham non hanno mostrato cambiamenti di peso corporeo post-operatorio (misurati 24 ore dopo l'intervento chirurgico). La maggior parte dei topi ha recuperato il peso corporeo iniziale tra i giorni 4 e 7 post-operatorio (vedi gruppo IRI a 7 giorni, Figura 2). La funzionalità renale può essere valutata utilizzando marcatori tradizionali come l'azoto ureico nel sangue (BUN) e la creatinina. Inoltre, i livelli di elettroliti nel siero (sodio, potassio e cloruro) e un esame emocromo differenziale automatizzato sono stati inclusi nell'analisi.
Cambiamenti istopatologici La valutazione dei risultati istopatologici è stata effettuata utilizzando sezioni intere del rene del rene con paraformaldeide fissate e incorporate in paraffina, colorate con ematossilina / eosina (HE), acido periodico Schiff e macchie tricrome di Masson. I cambiamenti più evidenti prodotti da questo modello IRI renale unilaterale possono essere osservati alla giunzione cortico-midollare, in particolare nei tubuli prossimali, negli arti ascendenti spessi dell'ansa di Henle e nei tubuli contorti distali, così come nell'interstizio tubulare (vedi la legenda per la Figura 3). Immagini microscopiche che mostrano le lesioni più caratteristiche dopo IRI nel rene possono essere viste nella Figura 3. Un elenco dei risultati istopatologici sequenziali è fornito nella Tabella 1.
È stato sviluppato un sistema di punteggio delle lesioni tubulari per classificare il danno nel tempo (Figura 4). In questo, cinque alterazioni definite sono state valutate da tre diversi valutatori: 1) attenuazione epiteliale tubulare; 2) perdita del bordo del pennello; 3) necrosi tubulare; 4) ostruzione luminale; e 5) presenza di colata proteica. Un'assegnazione di "1" indica che l'alterazione è presente, "0" che è assente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig01.jpg"> Figura 1: Modello sperimentale di IRI renale nel topo. (A) Vengono mostrate le fasi degli esperimenti e degli interventi (induzione dell'anestesia, ischemia e riperfusione). Si prega di notare i cambiamenti nel colore del rene destro in rosso scuro durante l'ischemia (B) al rosa durante la riperfusione (C). (D) Aspetto macroscopico del rene destro IRI (freccia rossa) rispetto al rene controlaterale non IRI dello stesso animale 24 ore dopo l'intervento chirurgico. La freccia rossa in (B) mostra la posizione del morsetto emostatico. Abbreviazione: IRI = Ischemia-reperfusion injury. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig02.jpg"> Figura 2: Peso corporeo dei topi prima e dopo l'IRI renale. Vengono mostrati i dati individuali. Abbreviazioni: IRI = Danno da ischemia-riperfusione; h = ore; d = giorni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig03.jpg"> Figura 3: Lesioni microscopiche tipiche osservate nella corteccia e nella giunzione cortico-midollare di topi operati da IR. Vengono mostrati tempi di riperfusione sham e diversi (indicati sopra ogni immagine). (A) Le strutture intatte sono mostrate in finto (ingrandimento 40x; barra della scala = 20 μm). Le frecce in IRI 4 h indicano la presenza di colata proteica nel lume tubolare (ingrandimento 40x; scala bar = 20 μm). Le frecce in IRI 8 h mostrano la dilatazione tubulare (ingrandimento 40x; barra della scala = 50 μm). Freccia nera in IRI 16 h mostra calco tubolare in segmenti midollari; le frecce bianche mostrano aree di necrosi cellulare (ingrandimento 40x; barra della scala = 50 μm). Le frecce nere in IRI 1 d indicano la dilatazione tubulare (ingrandimento 10x; barra della scala = 100 μm). La freccia nera in IRI 2 d mostra nuclei cellulari ingranditi; le punte di freccia bianche mostrano aree di infiltrazione di linfociti e macrofagi (ingrandimento 40x; barra della scala = 50 μm). Le punte di freccia bianche in IRI 4 d indicano cellule tubolari mitotiche (ingrandimento 40x; barra di scala = 50 μm). La freccia nera in IRI 7 d mostra un'area di fibrosi focale; la punta di freccia bianca mostra un'area di rigenerazione (ingrandimento 20x; barra della scala = 100 μm). (B) Colorazione PAS che mostra la corteccia renale dei topi durante la riperfusione precoce (4 h, 8 h e 16 h). Osservate l'attenuazione progressiva del bordo del pennello (frecce). Ingrandimenti 40x; barre di scala = 50 μm (C) colorazione tricroma di Masson di topi sham e IRI 7 d che mostrano aree di fibrosi interstiziale (frecce bianche). Ingrandimento 40x; barre di scala = 50 μm. Abbreviazioni: IRI = Danno da ischemia-riperfusione; Glo = glomerulo; PCT = tubulo contorto prossimale; DCT = tubulo contorto distale; CD = condotto di raccolta; PAS = acido periodico Schiff; d = giorno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig04.jpg"> Figura 4: Punteggio di lesioni tubolari di topi operati da sham e IRI. Scala del sistema di punteggio da 1 a 5 per l'attenuazione epiteliale tubulare; perdita del bordo del pennello; necrosi tubulare; ostruzione luminale; e presenza di cast proteico. Un'assegnazione di "1" indica che l'alterazione è presente, "0" che è assente. Vengono visualizzati i singoli valori. Le barre rappresentano la media ± SD (n = 4). Abbreviazione: IRI = Ischemia-reperfusion injury. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tempo dopo l'IRI</td>
			<td>Cambiamenti patologici più significativi</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ore</td>
			<td>Ostruzione tubolare</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Proteina colata nel lume</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 ore</td>
			<td>Dilatazione tubolare</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Necrosi incipiente</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Attenuazione dell'epitelio</td>
		</tr>
<tr>
<td>16 ore</td>
			<td>Necrosi cellulare</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Fusione tubolare</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Infiltrazione dei neutrofili</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 giorno</td>
			<td>Necrosi</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Dilatazione tubolare</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Infiltrazione dei neutrofili</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 giorni</td>
			<td>Dilatazione tubolare</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Infiltrazione di linfociti e macrofagi</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Nuclei cellulari ingrossati</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 giorni</td>
			<td>Attività mitotica prominente nelle cellule tubulari</td>
		</tr>
<tr>
<td>7 giorni</td>
			<td>Fibrosi focale</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Aree di rigenerazione</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Cambiamenti patologici più significativi nel tempo. Diagnosticato sulla base dell'esame microscopico di 4-6 animali per gruppo.

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An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury

La lesione da ischemia-riperfusione renale è associata ad alta morbilità e mortalità nei pazienti ospedalizzati. Qui, presentiamo un modello murino semplice ed efficace di danno unilaterale da ischemia-riperfusione renale e forniamo una panoramica sequenziale dei cambiamenti patologici rappresentativi osservati nel rene.

Un modello murino efficace di danno unilaterale da ischemia-riperfusione renale

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models ...

Il danno da ischemia-riperfusione renale è la principale causa di insufficienza renale acuta. Questo modello è molto utile per comprendere i cambiamenti fisiopatologici che si verificano nel rene dopo un insulto ischemico. Questo modello è efficiente in termini di tempo e costi e fornisce dati altamente riproducibili.Oltre a questo, questo modello di ischemia renale unilaterale consente al ricercatore di lavorare con tempi ischemici più lunghi mantenendo un alto tasso di sopravvivenza. Per cominciare, posizionare il mouse anestetizzato sul tavolo delle operazioni. Dopo aver sterilizzato l'area chirurgica, utilizzare una lama di bisturi per eseguire un'incisione chirurgica laterale dorsale di circa un centimetro sul fianco destro dietro la costola e continuare il coddley di circa un centimetro parallela alla linea mediana lombare.Transect la muscolatura addominale usando le forbici per visualizzare lo spazio retroperitoneale. Utilizzare un batuffolo di cotone sterile per rimuovere le piccole quantità di sangue prodotte durante il sezionamento dei muscoli. Quindi, spingere il rene destro fuori dalla cavità addominale.Esporre lentamente e con attenzione il rene con una pinza grigia e identificare il peduncolo renale. Quindi rimuovere con cura il tessuto adiposo intorno al peduncolo. Utilizzare un Halsted Mosquito Hemostat per manipolare il morsetto vascolare.Per indurre l'ischemia, posizionare il morsetto vascolare sopra l'arteria renale e la vena presenti nel peduncolo renale evitando di bloccare l'uretere adiacente. Coprire il rene bloccato con una garza sterile imbevuta di soluzione salina per evitare l'essiccazione. Lasciare i reni sulla garza per 30 minuti e monitorare periodicamente la profondità e l'umidità dell'anestesia della garza.Poco prima della fine del periodo di ischemia, scoprire il rene e tenere l'Halsted Mosquito Hemostat, pronto per la rimozione del morsetto. Alla fine del periodo di ischemia, aprire il morsetto vascolare con l'emostato e rimuovere il morsetto per consentire la perfusione del rene. Per gli animali di controllo fittizi, eseguire l'intervento chirurgico dimostrato senza bloccare il peduncolo renale.Dopo aver verificato il cambiamento di colore del rene, riportare il rene nella cavità addominale. Chiudere i muscoli addominali in uno schema crociato con sutura riassorbibile 5-0. Chiudere la pelle in un modello di materasso orizzontale con sutura riassorbibile 5-0.Pulire la ferita con la soluzione di povidone-iodio. Dopo la lesione da perfusione da ischemia, la riduzione del peso corporeo è stata osservata in alcuni topi con meno del 10% del peso corporeo iniziale. Tuttavia, la maggior parte dei topi ha recuperato il loro peso corporeo iniziale tra i giorni 4 e 7 dopo l'intervento chirurgico.I topi di controllo non hanno mostrato alcun cambiamento di peso corporeo dopo l'intervento chirurgico. Diversi cambiamenti nella morfologia renale post-operatoria sono stati identificati utilizzando ematossilina-eosina, acido periodico Schiff e colorazione Trichrome di Masson. La presenza di colata proteica nel lume tubulare è stata osservata dopo quattro ore.La dilatazione tubulare è stata rilevata a otto ore e il calco tubulare e la necrosi cellulare nei segmenti midollari sono stati notati a 16 ore dopo l'intervento chirurgico IRI. Dopo 24 ore dall'intervento chirurgico, è stata osservata una dilatazione tubulare. L'infiltrazione di linfociti e macrofagi e nuclei cellulari ingrossati sono stati rilevati dopo 48 ore.Entro il giorno 4, sono state osservate cellule tubulari mitotiche e al giorno 7 dopo l'intervento chirurgico IRI è stata rilevata la fibrosi focale. La corteccia renale dei topi durante la riperfusione precoce è stata monitorata utilizzando la colorazione PAS e la progressiva attenuazione del bordo del pennello era visibile. Le aree della fibrosi interstiziale al giorno 7 post-operatorio sono state visualizzate utilizzando la colorazione del tricomi di Masson.È stato sviluppato un sistema di punteggio delle lesioni tubolari per classificare il danno nel tempo. I punteggi più alti di lesioni tubulari sono stati ottenuti tra 8 ore e 24 ore dopo l'IRI renale. Alcuni dei passaggi più critici sono il corretto posizionamento del morsetto vascolare nel peduncolo renale e il mantenimento di una temperatura corporea costante durante l'intervento chirurgico.

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