Name: an effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury
Uploaded: 2021-07-15T14:45:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury at JoVE.com

En del av arbeidet som er vist i denne artikkelen ble grunnlagt av Center of Integrative Mammalian Research ved Ross University School of Veterinary Medicine (RUSVM), Saint Kitts og Nevis. Den økonomiske støtten fra Institutt for veterinær biomedisinske ved Long Island University College of Veterinary Medicine er høyt verdsatt.

Følgende protokoll beskriver en overlevelsesoperasjon. Derfor brukes den høyeste aseptiske og kirurgiske praksisen. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer og godkjent av Institusjonell dyrepleie- og brukskomité. For å eliminere kjønns- og belastningsbaserte forskjeller i IRI-effekter ble bare mannlige C57BL6-mus brukt i studien. Alle dyrene ble matchet i alder og vekt for å gi sammenlignbare resultater.
1. Forberedelse
MERK: En tidslinje over de ulike eksperimentelle fasene og intervensjonene er vist i figur 1A.
<ol><li>Rengjør og desinfiser det kirurgiske bordet før hver prosedyre. Forbered og plasser alle nødvendige materialer (steriliserte instrumenter og bomullspinne, steril gasbind og gardiner, prefortynnet bedøvelse, varmepute, sterilisert vaskulær klemme, steril saltløsning og hudantiseptiske midler og sutur) på operasjonsbordet (se materialtabellen).</li>
	<li>Bedøv mannlige C57BL6-mus (aldersgruppe 11-13 uker) ved intraperitoneal injeksjon av ketamin/xylazin (henholdsvis 100 mg/kg og 20 mg/kg kroppsvekt, tidligere fortynnet i steril saltvann). MERK: Dyktig dyrehåndtering er viktig for å minimere stress for dyret, da stressresponser kan påvirke virkningen av bedøvelse negativt.</li>
	<li>Etter administrering av ketamin/xylazine barberer du det kirurgiske området på høyre flanke med barberblad og såpe. MERK: Barbering av huden forbedrer sårheling samt de generelle resultatene av overlevelsesoperasjoner.</li>
	<li>Desinfiser huden i det kirurgiske området med 70% alkohol først og deretter med povidon jodoppløsning ved hjelp av en bomullspinne.</li>
	<li>Etter hudforberedelsen plasserer du musen på et varmebord i en ventral decubitus-posisjon og stabiliserer kroppstemperaturen ved 37 °C (overvåkes gjennom rektal- og putesensorprober). MERK: Nyrer er lettere tilgjengelig og kirurgisk eksponert når de plasseres i ventral decubitus i stedet for lateral.</li>
	<li>Mens kroppstemperaturen er stabilisert, bruk øyesalve på musens øyne. MERK: Dissosiativbedøvelse, som ketamin, får dyrets øyne til å forbli åpne mens de bedøves.</li>
</ol>2. Kirurgi
<ol><li>Når smerterefleksene er fraværende (tåklemming med pinsett), utfør et ca. 1 cm dorso-lateralt kirurgisk snitt på høyre flanke ved hjelp av et skalpellblad. Start snittet bak den siste ribben og fortsett caudally ca 1 cm parallelt med lumbale midtlinjen.</li>
	<li>Transekter bukmuskulaturen ved hjelp av saks for å visualisere retroperitonealrommet. Fjern de små mengdene blod som produseres under seksjonering av musklene ved hjelp av sterile bomullspinne. MERK: Fordi dorso-lateral tilnærmingen brukes, er retroperitoneum, og ikke bukhulen, tilgjengelig med denne prosedyren.</li>
	<li>Skyv høyre nyre ut av bukhulen. Bruk Graefe tang for å eksponere nyrene nøye. MERK: Hold alltid tang lukket for å unngå traumatisk skade på nyrene når de plasseres på magen, og bruk den bare til å forsiktig skyve og lede nyrene mot kirurgisk snitt og ut av det.</li>
	<li>Eksponer langsomt riktig nyre og identifiser nyreprippet. Fjern forsiktig fettvevet rundt pedicle.</li>
	<li>For å indusere iskemi, plasser den vaskulære klemmen over nyrearterien og venen som er tilstede i nyreprøyten, og unngå å klemme den tilstøtende urinlederen. Bruk en Halsted-Mosquito hemostat for å manipulere den vaskulære klemmen. MERK: Iskemi bekreftes ved visualisering av en endring i fargen på nyrene fra rød-rosa til mørk lilla (figur 1B).</li>
	<li>Dekk den klemmede nyren med steril gasbind gjennomvåt i saltvann for å unngå uttørking og la den stå i 30 minutter.</li>
	<li>Overvåk anestesidybde og fuktighet i gasbindet med jevne mellomrom i løpet av denne tiden. MERK: Induksjonsdosen av anestesi er tilstrekkelig til å gi analgesi til slutten av den iskemiske hendelsen; Derfor er det ikke nødvendig med ytterligere bedøvelsesinjeksjoner.</li>
	<li>Kort før slutten av iskemiperioden, fjern gasbindet og avdekk nyrene. Hold Halsted-Mosquito hemostat, klar for fjerning av klemmer.</li>
	<li>I minutt 30 åpner du den vaskulære klemmen med hemostaten og fjerner den fra nyreprippet for å tillate reperfusjon av nyrene. MERK: Reperfusjon bekreftes ved visualisering av en endring i nyrenes farge fra mørk lilla til rød-rosa (figur 1C).</li>
	<li>Utfør de samme prosedyrene beskrevet ovenfor for sham dyr uten klemming av nyre pedicle.</li>
	<li>Etter verifisering av nyrefargeendringen, returner nyrene til bukhulen. Lukk magemusklene med absorberbar sutur 5-0 ved hjelp av et korsbåndmønster. MERK: En annen injeksjon av bedøvelse kan være nødvendig for å opprettholde analgesi under suturering av muskler og hud. Halvparten av den første dosen har vist seg effektiv i å gi analgesi til avslutningen av operasjonen.</li>
	<li>Lukk huden med absorberbar sutur 5-0 ved hjelp av et horisontalt madrassmønster. Rengjør såret med en povidonjodoppløsning ved hjelp av en bomullspinne.</li>
</ol>3. Restitusjon og etterkirurgi
MERK: Siden postkirurgisk tid er selve reperfusjonstiden, er riktig postkirurgisk behandling etisk obligatorisk og vitenskapelig relevant. Reperfusjonstider kan velges etter behov av forskeren. Reperfusjonstider på 4 timer, 8 t, 16 timer, 1 dag, 2 dager, 4 dager og 7 dager sammenlignes med å få en sekvensiell oversikt over patologiske endringer indusert av nyre-IRI.
<ol><li>Hold musen på varmeputen til den begynner å komme seg fra anestesi. MERK: Det anbefales å vente til musen begynner å bevege bena og prøver å bevege seg rundt. I tilfeller der ytterligere bedøvelsesinjeksjoner kreves under operasjonen, er restitusjonstiden lengre. Atipamezole, en alfa-2 reseptorantagonist, kan administreres i en dose på 0,5 mg/kg kroppsvekt intraperitonealt for å reversere xylazineffektene og forkorte utvinningsfasen. For smertebehandling administreres buprenorfin (0,1 mg/kg kroppsvekt, intraperitonealt) preoperativt og hver sjette time under restitusjons- og postkirurgisk fase. Bruken av ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler frarådes da flere stoffer i denne familien induserer nefrotoksisitet og kan derfor endre resultatene.</li>
	<li>Etter utvinning fra anestesi, plasser musen tilbake i buret med fri tilgang til vann og mat. MERK: Moset mat kan leveres i en Petri-tallerken samt materiale for å gjemme seg og leke (f.eks. papirark, papirhåndklerør).</li>
	<li>Overvåk musen daglig for å vurdere sårheling, mat- og vanninntak, kroppsvekt og oppførsel. MERK: Sårhelingsstatus ble vurdert ved hjelp av følgende skala: 1, tørr; 2, våt; 3, delvis åpnet; 4, åpnet. Rask sårtilheling ble dokumentert i denne studien, med mer enn 90% tørre sår etter dag 2.</li>
</ol>4. Eutanasi og prøvesamling
<ol><li>Avlive musene med natrium pentobarbital administrert intraperitonealt i en dose som er dobbelt så stor bedøvelsesdose for mus (100 mg/kg).</li>
	<li>Samle væske- og vevsprøver etter behov. MERK: Både nyrer, fullblod (for blodcelletall), serum (for blodbiokjemi), urin, hjerte og lunger ble samlet inn. Noen få mikroliter serum er nødvendig for blodbiokjemi analyse (blod urea nitrogen (BUN), kreatinin, elektrolytter). Om nødvendig, 24 timer før eutanasi, kan mus plasseres i metabolske bur for å samle et høyere urinvolum som gjør det mulig å bestemme nyrefunksjonsparametere.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ray, S. C., Mason, J., O'Connor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+renal+injury:+can+renal+anatomy+and+associated+vascular+congestion+explain+why+the+medulla+and+not+the+cortex+is+where+the+trouble+starts.">Ischemic renal injury: can renal anatomy and associated vascular congestion explain why the medulla and not the cortex is where the trouble starts.</a> Seminars in Nephrology. 39 (6), 520-529 (2019).</li><li>Weight, S. C., Bell, P. R., Nicholson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+ischaemia--reperfusion+injury.">Renal ischaemia--reperfusion injury.</a> The British Journal of Surgery. 83 (2), 162-170 (1996).</li><li>Ratliff, B. B., Abdulmahdi, W., Pawar, R., Wolin, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidant+mechanisms+in+renal+injury+and+disease.">Oxidant mechanisms in renal injury and disease.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 25 (3), 119-146 (2016).</li><li>Schrier, R. W., Wang, W., Poole, B., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure:+definitions,+diagnosis,+pathogenesis,+and+therapy.">Acute renal failure: definitions, diagnosis, pathogenesis, and therapy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114 (1), 5-14 (2004).</li><li>Fern&#225;ndez, A. R., S&#225;nchez-Tarjuelo, R., Cravedi, P., Ochando, J., L&#243;pez-Hoyos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Ischemia+reperfusion+injury-a+translational+perspective+in+organ+transplantation.">Review: Ischemia reperfusion injury-a translational perspective in organ transplantation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8549 (2020).</li><li>Wu, C. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+peroxiredoxin+3+as+a+predictor+of+renal+recovery+from+acute+tubular+necrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">Tubular peroxiredoxin 3 as a predictor of renal recovery from acute tubular necrosis in patients with chronic kidney disease.</a> Scientific Reports. 7 (1), 43589 (2017).</li><li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+and+sustained+thioredoxin+analogue+prevents+acute+kidney+injury+and+its-associated+distant+organ+damage+in+renal+ischemia+reperfusion+injury+mice.">Systemic and sustained thioredoxin analogue prevents acute kidney injury and its-associated distant organ damage in renal ischemia reperfusion injury mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 20635 (2020).</li><li>Mishra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+gelatinase-associated+lipocalin+(NGAL)+as+a+biomarker+for+acute+renal+injury+after+cardiac+surgery.">Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a biomarker for acute renal injury after cardiac surgery.</a> Lancet. 365 (9466), 1231-1238 (2005).</li><li>Han, W. K., Bailly, V., Abichandani, R., Thadhani, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+injury+molecule-1+(KIM-1):+A+novel+biomarker+for+human+renal+proximal+tubule+injury.">Kidney injury molecule-1 (KIM-1): A novel biomarker for human renal proximal tubule injury.</a> Kidney International. 62 (1), 237-244 (2002).</li><li>Coca, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+injury+biomarkers+with+clinical+utility:+has+Godot+finally+arrived.">Kidney injury biomarkers with clinical utility: has Godot finally arrived.</a> American Journal of Nephrology. 50 (5), 357-360 (2019).</li><li>Godoy, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment-specific+overexpression+of+redoxins+after+renal+ischemia+and+reperfusion:+protective+roles+of+glutaredoxin+2,+peroxiredoxin+3,+and+peroxiredoxin+6.">Segment-specific overexpression of redoxins after renal ischemia and reperfusion: protective roles of glutaredoxin 2, peroxiredoxin 3, and peroxiredoxin 6.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 51 (2), 552-561 (2011).</li><li>Wei, Q., Dong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+ischemic+acute+kidney+injury:+technical+notes+and+tricks.">Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303 (11), 1487-1494 (2012).</li><li>Gaut, J. P., Liapis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+pathology+and+pathophysiology:+a+retrospective+review.">Acute kidney injury pathology and pathophysiology: a retrospective review.</a> Clinical Kidney Journal. 14 (2), 526-536 (2021).</li><li>Le Clef, N., Verhulst, A., D'Haese, P. C., Vervaet, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+renal+ischemia-reperfusion+as+a+robust+model+for+acute+to+chronic+kidney+injury+in+mice.">Unilateral renal ischemia-reperfusion as a robust model for acute to chronic kidney injury in mice.</a> PLoS One. 11 (3), 0152153 (2016).</li><li>Pelkey, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+physiologic+temperature+variations+during+renal+ischemia+alter+functional+and+morphologic+outcome.">Minimal physiologic temperature variations during renal ischemia alter functional and morphologic outcome.</a> Journal of Vascular Surgery. 15 (4), 619-625 (1992).</li><li>Kennedy, S. E., Erlich, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+renal+ischaemia-reperfusion+injury.">Murine renal ischaemia-reperfusion injury.</a> Nephrology. 13 (5), 390-396 (2008).</li><li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice.">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (78), e50495 (2013).</li><li>Hesketh, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+ischaemia+reperfusion+injury:+a+mouse+model+of+injury+and+regeneration.">Renal ischaemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51816 (2014).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mouse+model+of+chronic+kidney+disease+transitioned+from+ischemic+acute+kidney+injury.">New mouse model of chronic kidney disease transitioned from ischemic acute kidney injury.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 286-295 (2019).</li><li>Basile, D. P., Leonard, E. C., Tonade, D., Friedrich, J. L., Goenka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+on+long-term+function+of+injured+and+contralateral+kidneys+following+unilateral+renal+ischemia-reperfusion.">Distinct effects on long-term function of injured and contralateral kidneys following unilateral renal ischemia-reperfusion.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 302 (5), 625-635 (2012).</li><li>Polichnowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+unilateral+ischemia-reperfusion+injury:+importance+of+renal+counterbalance+and+implications+for+the+AKI-CKD+transition.">Pathophysiology of unilateral ischemia-reperfusion injury: importance of renal counterbalance and implications for the AKI-CKD transition.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (5), 1086-1099 (2020).</li></ol>

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter angående denne artikkelen.

Mus nyre IRI-modeller er populære i biomedisinsk forskning på grunn av deres relativt lave driftskostnader og tilgjengeligheten av forskjellige transgene modeller12. Den ensidige nyre-IRI-modellen som presenteres her etterligner karakteristiske patologiske endringer observert i human nyre-IRI som rørformet dilatasjon, nekrose og fibrose13. Disse resultatene er basert på varierende reperfusjonstider.
Kritiske trinn i denne protokollen inkluderer vedlikehold av konstant kroppstemperatur og riktig plassering av den vaskulære klemmen i nyreprippet. Kroppstemperatur påvirker dyrets metabolisme14, og endrer de eksperimentelle resultatene både på fysiologiske og cellulære nivåer15. I denne modellen ble kroppstemperaturen stabilisert før operasjonen ved hjelp av rektal- og putesensorsonder. I tillegg anbefales kontinuerlig overvåking av kroppstemperaturen under hele kirurgisk prosedyre, spesielt før du plasserer den vaskulære klemmen for å indusere iskemi.
Eksponeringen av nyrene og riktig plassering av vaskulær klemme er også avgjørende for suksessen til eksperimentet. Skade på nyrekapselen ved feil håndtering av tang under eksponering av nyrene gjennom kirurgisk snitt vil resultere i perirenal blødning og betennelse. Den vaskulære klemmen skal plasseres på nyre pedicle okkludering nyrearterien og nyrevenen uten å påvirke urinlederen og suprarenal arteriene. Kritisk for dette trinnet er forsiktig disseksjon av fettvevet rundt nyre hilum14,16.
Denne modellen er kostnadseffektiv og tidseffektiv. Bedøvelsesforbruk per mus var 156,47 ± 37,88 μL (gjennomsnittlig ± SD, n = 17) av en prefortynnet ketamin/xylazincocktail (1:10 ketamin, 1:50 xylazin, i saltvann; lageroppløsning konsentrasjon, 100 mg/ml begge). Kirurgi kan utføres på relativt kort tid. Den totale operasjonstiden per mus var 53 ± 5,23 min (gjennomsnittlig ± SD, n = 17). Med opplært personell kan flere operasjoner utføres samtidig. I vår gruppe utførte en erfaren forsker operasjonen til klemmen ble frigjort fra nyreprøyten, mens en annen tok over fra sårlukking til gjenvinning av musen. Med denne tilnærmingen var vi i stand til å utføre et høyt antall operasjoner på en enkelt dag. I denne modellen brukte vi den dorsolaterale tilnærmingen, noe som resulterer i mindre traumer og redusert væske- og varmetap fra bukhulen sammenlignet med midtlinjetilnærmingen16.
Tidligere publiserte protokoller har beskrevet nyre pedicle klemme teknikken for å indusere akutt nyreskade hos mus 17,18,19. Men i disse studiene ble det utført en kontralateral nephrektomi i tillegg til den ensidige IRI med iskemiske tider fra 15 til 26 min. I denne protokollen induserte vi ensidig iskemi i 30 minutter mens vi bevarte den kontralaterale nyren. Dette resulterte i en overlevelsesrate på 100%. Denne modellen er imidlertid ikke egnet til å indusere azotemisk nyreskade på grunn av den kompenserende effekten som utøves av den ikke-kirurgisk intervenerte kontralaterale nyren. Å holde en nyre upåvirket i samme dyr gir imidlertid fordelen av å bruke lengre iskemitider med høyere overlevelsesrate. I tillegg til dette kan den kontralaterale nyren brukes til å vurdere mulige bivirkninger av testmedisiner eller behandlinger som brukes under eksperimentell prosedyre og for å studere nyre-nyre krysstale effekter 20,21. For eksempel har denne modellen vært nyttig for å vise reaktive oksygenarter-induserte endringer på cellenivå både i IRI og kontralaterale, ikke-kirurgisk intervenerte nyre11.
Denne modellen har en potensiell anvendelse i studier som tar sikte på å identifisere og karakterisere markører av ensidig nyreskade, nyre krysstale effekter, post-nyre IRI-indusert hemodynamiske endringer, og potensielle nefrotoksiske effekter av narkotika kandidater som skal brukes i nyre IRI. Denne detaljerte beskrivelsen av de viktigste patologiske endringene tjener som et verdifullt verktøy for å velge den mest passende tiden for å studere spesifikke cellulære prosesser, fra betennelse og nekrose (4 timer til 2 dager) til regenerering (4 dager) og fibrose (7 dager og senere).

Nyrene er blant de høyeste perfused organene i kroppen og er ekstremt utsatt for endringer i blodperfusjon1. Nyre iskemi-reperfusjonsskade (IRI) er fortsatt den ledende årsaken til akutt nyresvikt 2,3 og er forbundet med høy sykelighet og høy dødelighet hos innlagte pasienter4. Med begrensede terapeutiske alternativer tilgjengelig, er 4,5 nyre IRI for tiden fokus for flere forskningsinnsats innen biomedisin 6,7 med sikte på utvikling av nye terapeutiske mål og karakterisering av tidlige og sensitive markører av nyreskade 8,9,10 . Å identifisere en pålitelig, tids- og kostnadseffektiv dyremodell anses som viktig for å møte disse behovene. Dette papiret presenterer en enkel og effektiv musemodell av ensidig nyre-IRI. Iskemi er indusert ved klemming av høyre nyre pedicle i 30 min11,12. En avgjørende del av denne modellen er å velge den mest passende reperfusjonstiden som vil reprodusere de patologiske hendelsene av interesse, for eksempel rørformet nekrose, polymorfoukære inflammatoriske celleinfiltrasjon eller fibrose. Derfor får forskerne denne sekvensielle oversikten over representative patologiske endringer som forventes i IRI-nyrene.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>PVS8700</td>
			<td>5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>PRMBURPEN22</td>
			<td>0.3 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial euthanasia solution</td>
			<td>various suppliers</td>
			<td>na</td>
			<td>e.g., Euthasol Virbac (sodium pentobarbital 390 mg/mL + sodium phenytoin 50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment Puralube</td>
			<td>Dechra Veterinary Products, KS, USA</td>
			<td>na</td>
			<td>3.5 g (1/8 oz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad RightTempJr</td>
			<td>Kent Scientific, CT, USA</td>
			<td>&#160;RT-JR-20</td>
			<td>Consider the one with two temperature probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>VED1220</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Vascular clamp</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc., Germany</td>
			<td>00398-02</td>
			<td>Jaw dimensions: 5.5 x 1.5 mm; length: 11 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Towel Drapes
</td>
			<td>Kent Scientific, CT, USA 
</td>
			<td>SURGI-5023-3
</td>
			<td>Disposable, individualy packed
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments (Graefe forceps, Halsted-Mosquito hemostat, scissors, etc)</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc., Germany</td>
			<td>Various</td>
			<td>Consider the extra fine straight scissor and the angled Graefe forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl suture</td>
			<td>Ethicon US, LLC</td>
			<td>J493G</td>
			<td>Size 5-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>VAM4821</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury

Iskemi-reperfusjonsskade (IRI) er den ledende årsaken til akutt nyresvikt og er en betydelig bidragsyter til forsinket graftfunksjon. Dyremodeller er de eneste tilgjengelige ressursene som etterligner kompleksiteten i den IRI-tilknyttede skaden som oppstår in vivo. Dette dokumentet beskriver en effektiv musemodell av ensidig nyre-IRI som leverer svært reproduserbare data. Iskemi er indusert ved å okkludere riktig nyre pedicle i 30 min etterfulgt av reperfusjon. I tillegg til den kirurgiske prosedyren vil en sekvensiell oversikt over forventede fysiologiske og histopatologiske endringer etter nyre-IRI bli gitt ved å sammenligne data fra syv forskjellige reperfusjonstider (4 timer, 8 timer, 16 timer, 1 dag, 2 dager, 4 dager og 7 dager). Kritiske data for planlegging av eksperimenter fremover, for eksempel gjennomsnittlig kirurgisk tid, gjennomsnittlig bedøvelsesforbruk og endringer i kroppsvekt over tid, vil bli delt. Dette arbeidet vil hjelpe forskere med å implementere en pålitelig nyre-IRI-modell og velge riktig reperfusjonstid som samsvarer med deres tiltenkte undersøkende mål.

Fysiologiske parametere Mus gjenopprettet fra denne ensidige nyre-IRI-operasjonen ueventivt; dukket opp aktiv og våken; og viste normal spising, drikking og oppførsel neste dag. Noen mus kan ha post-IRI kroppsvekt tap, selv om det vanligvis er mindre enn 10% av den opprinnelige kroppsvekten (figur 2). Større kroppsvekt tap (˃10%) kan være skadelig, og disse dyrene bør fjernes fra studien. Sham-opererte mus viste ikke kroppsvektsendringer etter operasjonen (målt 24 timer etter operasjonen). De fleste mus gjenvunnet sin opprinnelige kroppsvekt mellom dag 4 og 7 etter operasjonen (se IRI 7-dagers gruppe, figur 2). Nyrefunksjonen kan vurderes ved hjelp av tradisjonelle markører som blodurea nitrogen (BUN) og kreatinin. I tillegg ble elektrolyttnivåer i serum (natrium, kalium og klorid) og et automatisert differensialblodtall inkludert i analysen.
Histopatologiske endringer Vurdering av histopatologiske funn ble gjort ved hjelp av 4% paraformaldehyd-fast, parafin-innebygd hele midt-sagittal deler av nyrene farget med hematoksylin / eosin (HE), periodisk syre Schiff, og Massons trichrome flekker. De mest tydelige endringene som produseres av denne ensidige nyre-IRI-modellen, kan ses ved kortiko-medullærkrysset, spesielt i de proksimale tubuliene, tykke stigende lemmer av Henles sløyfe og distale konvoluterte tubuli, så vel som i det rørformede interstitiumet (se legenden for figur 3). Mikroskopiske bilder som viser de mest karakteristiske lesjonene etter IRI i nyrene, kan ses i figur 3. En liste over de sekvensielle histopatologiske funnene er gitt i tabell 1.
Et rørformet skadescoringssystem ble utviklet for å kategorisere skaden over tid (figur 4). I dette ble fem definerte endringer vurdert av tre forskjellige evaluatorer: 1) rørformet epiteldemping; 2) tap av børstekant; 3) rørformet nekrose; 4) luminal obstruksjon; og 5) tilstedeværelse av proteinholdig støpt. Et oppdrag på "1" indikerer at endringen er til stede, "0" at den er fraværende.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig01.jpg"> Figur 1: Eksperimentell nyre-IRI-modell i mus. (A) Faser av eksperimenter og intervensjoner (anestesiinduksjon, iskemi og reperfusjon) vises. Vær oppmerksom på endringene i fargen på høyre nyre til mørk rød under iskemi (B) til rosa under reperfusjon (C). (D) Makroskopisk utseende av IRI høyre nyre (rød pil) sammenlignet med den kontralaterale ikke-IRI nyre av samme dyr 24 timer etter operasjonen. Rød pil inn (B) viser posisjonen til hemostatisk klemme. Forkortelse: IRI = Iskemi-reperfusjonsskade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig02.jpg"> Figur 2: Kroppsvekt for mus før og etter nyre-IRI. Individuelle data vises. Forkortelser: IRI = Iskemi-reperfusjonsskade; h = timer; d = dager. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig03.jpg"> Figur 3: Typiske mikroskopiske lesjoner observert i cortex og det kortiko-medullære krysset mellom IR-opererte mus. Sham og forskjellige reperfusjonstider vises (angitt over hvert bilde). (A) Intakte strukturer er vist i skam (forstørrelse 40x; skala bar = 20 μm). Piler i IRI 4 h indikerer tilstedeværelsen av proteinholdig støpt i rørformet lumen (forstørrelse 40x; skalastang = 20 μm). Piler i IRI 8 t viser rørformet dilatasjon (forstørrelse 40x; skalastang = 50 μm). Svart pil i IRI 16 h viser rørformet støpt i medullære segmenter; hvite piler viser områder med cellulær nekrose (forstørrelse 40x; skala bar = 50 μm). Svarte piler i IRI 1 d indikerer rørformet dilatasjon (forstørrelse 10x; skalastang = 100 μm). Svart pil i IRI 2 d viser forstørrede cellekjerner; hvite pilspisser viser områder med lymfocytt og makrofaginfiltrasjon (forstørrelse 40x; skala bar = 50 μm). Hvite pilspisser i IRI 4 d indikerer mititotiske rørformede celler (forstørrelse 40x; skalastang = 50 μm). Svart pil i IRI 7 d viser et område med fokal fibrose; hvit pilspiss viser et regenereringsområde (forstørrelse 20x; skalalinje = 100 μm). (B) PAS-farging som viser nyrebarken til mus under tidlig reperfusjon (4 t, 8 t og 16 timer). Legg merke til den progressive dempingen av penselkantlinjen (piler). Forstørrelser 40x; skalastenger = 50 μm (C) Masson trichrome farging av sham og IRI 7 d mus som viser områder med interstitiell fibrose (hvite piler). Forstørrelse 40x; skalastenger = 50 μm. Forkortelser: IRI = Iskemi-reperfusjonsskade; Glo = glomerulus; PCT = proksimal innviklet tubule; DCT = distal konvolutert tubule; CD = samle rør; PAS = periodisk syre Schiff; d = dag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig04.jpg"> Figur 4: Tubular skade score av sham- og IRI-opererte mus. Skåringssystemskala 1 til 5 for rørformet epiteldemping; tap av penselkantlinje; rørformet nekrose; lysende obstruksjon; og tilstedeværelse av proteinholdig støpt. Et oppdrag på "1" indikerer at endringen er til stede, "0" at den er fraværende. Individuelle verdier vises. Stolper representerer gjennomsnittlig ± SD (n = 4). Forkortelse: IRI = Iskemi-reperfusjonsskade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tid etter IRI</td>
			<td>De viktigste patologiske endringene</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 timer</td>
			<td>Rørformet obstruksjon</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Protein støpt i lumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 timer</td>
			<td>Rørformet dilatasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Begynnende nekrose</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Demping av epitel</td>
		</tr>
<tr>
<td>16 timer</td>
			<td>Cellulær nekrose</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Rørformet støpt</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Nøytrofiltrasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 dag</td>
			<td>Nekrose</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Rørformet dilatasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Nøytrofiltrasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 dager</td>
			<td>Rørformet dilatasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Lymfocytt og makrofaginfiltrasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Forstørret cellekjerner</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 dager</td>
			<td>Fremtredende mititotisk aktivitet i tubuleceller</td>
		</tr>
<tr>
<td>7 dager</td>
			<td>Fokal fibrose</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Områder med regenerering</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: De viktigste patologiske endringene over tid. Diagnostisert basert på mikroskopisk undersøkelse av 4-6 dyr per gruppe.

Watch this Scientific Journal Video about An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury at JoVE.com

An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury

Nyre iskemi-reperfusjonsskade er forbundet med høy sykelighet og dødelighet hos innlagte pasienter. Her presenterer vi en enkel og effektiv musemodell av ensidig nyre iskemi-reperfusjonsskade og gir en sekvensiell oversikt over representative patologiske endringer observert i nyrene.

En effektiv musemodell av ensidig nyre iskemi-reperfusjonsskade

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models ...

Nyre iskemi-reperfusjonsskade er den ledende årsaken til akutt nyresvikt. Denne modellen er veldig nyttig for å forstå de patofysiologiske endringene som oppstår i nyrene etter en iskemisk fornærmelse. Denne modellen er tids- og kostnadseffektiv og leverer svært reproduserbare data.I tillegg til dette tillater denne unilaterale nyre iskemimodellen forskeren å jobbe med lengre iskemiske tider samtidig som den opprettholder en høy overlevelsesrate. Til å begynne med plasserer du den bedøvede musen på operasjonstabellen. Etter sterilisering av operasjonsområdet, bruk et skalpellblad for å lage et omtrent en centimeter dorsal lateralt kirurgisk snitt på høyre flanke bak ribben og fortsett coddley omtrent en centimeter parallelt med lumbale midtlinjen.Transekter bukmuskulaturen ved hjelp av saks for å visualisere retroperitonealrommet. Bruk en steril bomullspinne for å fjerne de små mengdene blod som produseres under delen av musklene. Skyv deretter høyre nyre ut fra bukhulen.Sakte og forsiktig utsette nyrene med grå tang og identifisere nyre pedicle. Fjern deretter fettvevet forsiktig rundt pedicle. Bruk en Halsted Mosquito Hemostat for å manipulere den vaskulære klemmen.For å indusere iskemien, plasser den vaskulære klemmen over nyrearterien og venen som er tilstede i nyrepionen, og unngå å klemme den tilstøtende urinlederen. Dekk den klemmede nyren med steril gasbind gjennomvåt i saltvann for å unngå uttørking. La nyrene stå på gasbindet i 30 minutter og overvåk anestesidybden og fuktigheten til gasbindet med jevne mellomrom.Kort tid før slutten av iskemiperioden, avdekk nyrene og hold Halsted Mosquito Hemostat, klar for klemmefjerning. På slutten av iskemiperioden åpner du den vaskulære klemmen med hemostaten og fjerner klemmen for å tillate perfusjon av nyrene. For sham kontroll dyr, utføre demonstrert kirurgi uten klemming av nyre pedicle.Etter å ha bekreftet nyrefargeendringen, returner nyrene til bukhulen. Lukk magemusklene i et korsbåndmønster med absorberbar sutur 5-0. Lukk huden i et horisontalt madrassmønster med absorberbar sutur 5-0.Rengjør såret med povidon-jodoppløsning. Etter iskemiperfusjonsskaden ble kroppsvektreduksjon sett hos noen mus med mindre enn 10% av den opprinnelige kroppsvekten. Imidlertid gjenvunnet de fleste mus sin opprinnelige kroppsvekt mellom dag 4 og 7 postsurgery.Kontrollmusene viste ingen kroppsvektendringer etter operasjonen. Flere endringer i nyremorfologien etter operasjonen ble identifisert ved hjelp av hematoksylin-eosin, periodisk syre-Schiff og Massons Trichrome-farging. Tilstedeværelsen av proteinholdig støpt i rørformet lumen ble observert etter fire timer.Rørformet dilatasjon ble oppdaget på åtte timer og rørformet støpt samt cellulær nekrose i medullære segmenter ble lagt merke til ved 16 timer etter IRI-kirurgi. Etter 24 timer etter operasjonen ble rørformet dilatasjon observert. Infiltrasjon av lymfocytter og makrofager og forstørrede cellekjerner ble oppdaget etter 48 timer.Ved dag 4 ble mitotiske rørformede celler observert, og på dag 7 etter IRI-kirurgi ble fokal fibrose oppdaget. Musenes nyrebark under tidlig reperfusjon ble overvåket ved hjelp av PAS-farging og progressiv demping av børstegrensen var synlig. Områdene mellomliggende fibrose på dag 7 etter operasjonen ble visualisert ved hjelp av Massons Trichome-farging.Et rørformet skadescoringssystem ble utviklet for å kategorisere skaden over tid. De høyeste rørformede skadepoengene ble oppnådd mellom 8 timer og 24 timer etter Renal IRI. Noen av de mest kritiske trinnene er riktig plassering av den vaskulære klemmen i nyreprippet og opprettholder en konstant kroppstemperatur under operasjonen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Iskemi-reperfusjon Modell av akutt nyreskade og Post Injury fibrose i Mus

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Renal Ischaemia Reperfusion Injury: A Mouse Model of Injury and Regeneration

Nedsatt Ischemi reperfusjonssykdommer: A Mouse Model of Injury and Regeneration

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glukose deprivasjon og reoksygenering som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Iskemi-reperfusjonskade modell for å studere blod-hjernebarrieren Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Murine modell av intestinal iskemi-reperfusjon Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

En musemodell av retinal iskemi-reperfusjonsskade Gjennom Heving av intraokulært trykk

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

Two-vessel Occlusion Mouse Model of Cerebral Ischemia-reperfusion

To-fartøy okklusjon musemodell av Cerebral iskemi-reperfusion

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Evaluering av koronar Flow Reserve etter hjerteinfarkt ischemia reperfusion i rotter

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

En pre-klinisk rotte modell for studier av ischemia-reperfusion skade i rekonstruktiv mikrokirurgi

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

Forsinket intramyokarell levering av stamceller etter iskemi reperfusjonsskade i en Murine-modell

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...