Name: an effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury
Uploaded: 2021-07-15T14:45:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury at JoVE.com

En del av arbetet som visas i denna artikel grundades av Center of Integrative Mammalian Research vid Ross University School of Veterinary Medicine (RUSVM), Saint Kitts och Nevis. Det ekonomiska stödet från Institutionen för veterinär biomedicinsk vetenskap vid Long Island University College of Veterinary Medicine uppskattas mycket.

Följande protokoll beskriver en överlevnadsoperation. Därför tillämpas den högsta aseptiska och kirurgiska praxis. Alla djurförsök utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer och godkändes av kommittén för institutionell djurvård och användning. För att eliminera köns- och stambaserade skillnader i IRI-effekter användes endast manliga C57BL6-möss i studien. Alla djur matchades i ålder och vikt för att ge jämförbara resultat.
1. Förberedelse
OBS: En tidslinje för de olika experimentella faserna och interventionerna visas i figur 1A.
<ol><li>Rengör och desinficera operationsbordet före varje ingrepp. Förbered och placera alla nödvändiga material (steriliserade instrument och bomullspinne, steril gasväv och draperier, förspädda anestetika, värmedyna, steriliserad vaskulär klämma, steril saltlösning och hudantiseptika och sutur) på operationsbordet (se materialförteckningen).</li>
	<li>Bedöva manliga C57BL6-möss (åldersintervall 11-13 veckor) genom intraperitoneal injektion av ketamin / xylazin (100 mg / kg respektive 20 mg / kg kroppsvikt, tidigare utspädd i steril saltlösning). OBS: Skicklig djurhantering är avgörande för att minimera stress för djuret, eftersom stressreaktioner kan påverka anestetikas verkan negativt.</li>
	<li>Efter administrering av ketamin/xylazin, raka det kirurgiska området på höger flank med ett rakblad och tvål. OBS: Rakning av huden förbättrar sårläkning såväl som de allmänna resultaten av överlevnadsoperationer.</li>
	<li>Desinficera huden i det kirurgiska området med 70% alkohol först och sedan med povidonjodlösning med en bomullspinne.</li>
	<li>Efter hudberedningen, placera musen på ett värmebord i ett ventralt decubitusläge och stabilisera kroppstemperaturen vid 37 °C (övervakas genom rektala och padsensorprober). OBS: Njurar är lättare att komma åt och kirurgiskt exponerade när de placeras i ventral decubitus snarare än lateral.</li>
	<li>Medan kroppstemperaturen stabiliseras, applicera ögonsalva på musens ögon. OBS: Dissociativa anestetika, såsom ketamin, gör att djurets ögon förblir öppna medan de bedövas.</li>
</ol>2. Kirurgi
<ol><li>När smärtreflexerna är frånvarande (tå klämmer med pincett), utför ett cirka 1 cm dorso-lateralt kirurgiskt snitt på höger flank med hjälp av ett skalpellblad. Starta snittet bakom det sista revbenet och fortsätt kaudalt ca 1 cm parallellt med ländryggens mittlinje.</li>
	<li>Transekt bukmuskulaturen med sax för att visualisera retroperitonealutrymmet. Ta bort de små mängder blod som produceras under sektionering av musklerna med sterila bomullspinne. OBS: Eftersom dorso-lateralmetoden används, nås retroperitoneumet och inte bukhålan med denna procedur.</li>
	<li>Tryck ut höger njure från bukhålan. Använd Graefe-pincett för att exponera njuren försiktigt. OBS: Håll alltid tången stängd för att undvika traumatisk skada på njuren när den placeras på buken och använd den bara för att försiktigt trycka och styra njuren mot det kirurgiska snittet och ut ur det.</li>
	<li>Exponera långsamt den högra njuren och identifiera njurpedikeln. Ta försiktigt bort fettvävnaden runt pedikeln.</li>
	<li>För att inducera ischemi, placera kärlklämman över njurartären och venen som finns i njurpedikeln och undvik att klämma fast den intilliggande urinledaren. Använd en Halsted-Mosquito hemostat för att manipulera kärlklämman. OBS: Ischemi bekräftas av visualiseringen av en förändring i njurens färg från rödrosa till mörklila (Figur 1B).</li>
	<li>Täck den klämda njuren med steril gasbindning blöt i saltlösning för att undvika uttorkning och lämna den i 30 minuter.</li>
	<li>Övervaka anestesidjupet och fuktigheten hos gasbindningen regelbundet under denna tid. OBS: Induktionsdosen av anestesi är tillräcklig för att ge analgesi fram till slutet av den ischemiska händelsen; därför krävs inga ytterligare bedövningsinjektioner.</li>
	<li>Strax före slutet av ischemiperioden, ta bort gasbindningen och avslöja njuren. Håll Halsted-Mosquito hemostat, redo för klämborttagning.</li>
	<li>Vid minut 30, öppna kärlklämman med hemostaten och ta bort den från njurpedikeln för att möjliggöra reperfusion av njurarna. OBS: Reperfusion bekräftas av visualiseringen av en förändring i njurens färg från mörklila till rödrosa (Figur 1C).</li>
	<li>Utför samma procedurer som beskrivs ovan för bluffdjur utan fastspänning av njurpedikeln.</li>
	<li>Efter verifiering av njurfärgförändringen, returnera njuren till bukhålan. Stäng magmusklerna med absorberbar sutur 5-0 med ett korsmönster. OBS: En andra injektion av anestetika kan krävas för att upprätthålla analgesi under suturering av muskler och hud. Hälften av den initiala dosen har visat sig vara effektiv för att ge smärtlindring fram till operationens slut.</li>
	<li>Stäng huden med absorberbar sutur 5-0 med ett horisontellt madrassmönster. Rengör såret med en povidonjodlösning med en bomullspinne.</li>
</ol>3. Återhämtning och efter operation
OBS: Eftersom postkirurgisk tid är den faktiska reperfusionstiden är korrekt postkirurgisk vård etiskt obligatorisk och vetenskapligt relevant. Reperfusionstider kan väljas efter behov av forskaren. Reperfusionstider på 4 h, 8 h, 16 h, 1 dag, 2 dagar, 4 dagar och 7 dagar jämförs för att få en sekventiell översikt över patologiska förändringar inducerade av renal IRI.
<ol><li>Håll musen på värmedynan tills den börjar återhämta sig från anestesi. OBS: Det rekommenderas att vänta tills musen börjar röra benen och försöker röra sig. I de fall då ytterligare anestesiinjektioner krävs under operationen är återhämtningstiden längre. Atipamezole, en alfa-2-receptorantagonist, kan administreras i en dos av 0,5 mg/kg kroppsvikt intraperitonealt för att vända xylazineffekterna och förkorta återhämtningsfasen. För smärtlindring administreras buprenorfin (0,1 mg/kg kroppsvikt, intraperitonealt) preoperativt och var 6:e timme under återhämtningsfasen och postkirurgisk fas. Användningen av icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel avråds eftersom flera läkemedel i denna familj inducerar nefrotoxicitet och därför kan förändra resultaten.</li>
	<li>Efter återhämtning från anestesi, placera musen tillbaka i buret med fri tillgång till vatten och mat. OBS: Mosad mat kan tillhandahållas i en petriskål samt material för att gömma och leka (t.ex. pappersark, pappershandduksrör).</li>
	<li>Övervaka musen dagligen för att bedöma sårläkning, mat- och vattenintag, kroppsvikt och beteende. OBS: Sårläkningsstatus bedömdes med hjälp av följande skala: 1, torr; 2, våt; 3, delvis öppnad; 4, öppnade. Snabb sårläkning dokumenterades i denna studie, med mer än 90% av torra sår efter dag 2.</li>
</ol>4. Dödshjälp och provtagning
<ol><li>Avliva mössen med natriumpentobarbital administrerat intraperitonealt i en dos som är dubbelt så stor som bedövningsdosen för möss (100 mg/kg).</li>
	<li>Samla in vätske- och vävnadsprover efter behov. OBS: Båda njurarna, helblod (för blodkroppsantal), serum (för blodbiokemi), urin, hjärta och lungor samlades in. Några mikroliter serum behövs för blodbiokemianalys (blodurea kväve (BUN), kreatinin, elektrolyter). Vid behov, 24 timmar före eutanasi, kan möss placeras i metaboliska burar för att samla en högre urinvolym som möjliggör bestämning av njurfunktionsparametrar.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ray, S. C., Mason, J., O'Connor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+renal+injury:+can+renal+anatomy+and+associated+vascular+congestion+explain+why+the+medulla+and+not+the+cortex+is+where+the+trouble+starts.">Ischemic renal injury: can renal anatomy and associated vascular congestion explain why the medulla and not the cortex is where the trouble starts.</a> Seminars in Nephrology. 39 (6), 520-529 (2019).</li><li>Weight, S. C., Bell, P. R., Nicholson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+ischaemia--reperfusion+injury.">Renal ischaemia--reperfusion injury.</a> The British Journal of Surgery. 83 (2), 162-170 (1996).</li><li>Ratliff, B. B., Abdulmahdi, W., Pawar, R., Wolin, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidant+mechanisms+in+renal+injury+and+disease.">Oxidant mechanisms in renal injury and disease.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 25 (3), 119-146 (2016).</li><li>Schrier, R. W., Wang, W., Poole, B., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure:+definitions,+diagnosis,+pathogenesis,+and+therapy.">Acute renal failure: definitions, diagnosis, pathogenesis, and therapy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114 (1), 5-14 (2004).</li><li>Fern&#225;ndez, A. R., S&#225;nchez-Tarjuelo, R., Cravedi, P., Ochando, J., L&#243;pez-Hoyos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Ischemia+reperfusion+injury-a+translational+perspective+in+organ+transplantation.">Review: Ischemia reperfusion injury-a translational perspective in organ transplantation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8549 (2020).</li><li>Wu, C. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+peroxiredoxin+3+as+a+predictor+of+renal+recovery+from+acute+tubular+necrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">Tubular peroxiredoxin 3 as a predictor of renal recovery from acute tubular necrosis in patients with chronic kidney disease.</a> Scientific Reports. 7 (1), 43589 (2017).</li><li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+and+sustained+thioredoxin+analogue+prevents+acute+kidney+injury+and+its-associated+distant+organ+damage+in+renal+ischemia+reperfusion+injury+mice.">Systemic and sustained thioredoxin analogue prevents acute kidney injury and its-associated distant organ damage in renal ischemia reperfusion injury mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 20635 (2020).</li><li>Mishra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+gelatinase-associated+lipocalin+(NGAL)+as+a+biomarker+for+acute+renal+injury+after+cardiac+surgery.">Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a biomarker for acute renal injury after cardiac surgery.</a> Lancet. 365 (9466), 1231-1238 (2005).</li><li>Han, W. K., Bailly, V., Abichandani, R., Thadhani, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+injury+molecule-1+(KIM-1):+A+novel+biomarker+for+human+renal+proximal+tubule+injury.">Kidney injury molecule-1 (KIM-1): A novel biomarker for human renal proximal tubule injury.</a> Kidney International. 62 (1), 237-244 (2002).</li><li>Coca, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+injury+biomarkers+with+clinical+utility:+has+Godot+finally+arrived.">Kidney injury biomarkers with clinical utility: has Godot finally arrived.</a> American Journal of Nephrology. 50 (5), 357-360 (2019).</li><li>Godoy, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment-specific+overexpression+of+redoxins+after+renal+ischemia+and+reperfusion:+protective+roles+of+glutaredoxin+2,+peroxiredoxin+3,+and+peroxiredoxin+6.">Segment-specific overexpression of redoxins after renal ischemia and reperfusion: protective roles of glutaredoxin 2, peroxiredoxin 3, and peroxiredoxin 6.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 51 (2), 552-561 (2011).</li><li>Wei, Q., Dong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+ischemic+acute+kidney+injury:+technical+notes+and+tricks.">Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303 (11), 1487-1494 (2012).</li><li>Gaut, J. P., Liapis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+pathology+and+pathophysiology:+a+retrospective+review.">Acute kidney injury pathology and pathophysiology: a retrospective review.</a> Clinical Kidney Journal. 14 (2), 526-536 (2021).</li><li>Le Clef, N., Verhulst, A., D'Haese, P. C., Vervaet, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+renal+ischemia-reperfusion+as+a+robust+model+for+acute+to+chronic+kidney+injury+in+mice.">Unilateral renal ischemia-reperfusion as a robust model for acute to chronic kidney injury in mice.</a> PLoS One. 11 (3), 0152153 (2016).</li><li>Pelkey, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+physiologic+temperature+variations+during+renal+ischemia+alter+functional+and+morphologic+outcome.">Minimal physiologic temperature variations during renal ischemia alter functional and morphologic outcome.</a> Journal of Vascular Surgery. 15 (4), 619-625 (1992).</li><li>Kennedy, S. E., Erlich, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+renal+ischaemia-reperfusion+injury.">Murine renal ischaemia-reperfusion injury.</a> Nephrology. 13 (5), 390-396 (2008).</li><li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice.">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (78), e50495 (2013).</li><li>Hesketh, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+ischaemia+reperfusion+injury:+a+mouse+model+of+injury+and+regeneration.">Renal ischaemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51816 (2014).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mouse+model+of+chronic+kidney+disease+transitioned+from+ischemic+acute+kidney+injury.">New mouse model of chronic kidney disease transitioned from ischemic acute kidney injury.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 286-295 (2019).</li><li>Basile, D. P., Leonard, E. C., Tonade, D., Friedrich, J. L., Goenka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+on+long-term+function+of+injured+and+contralateral+kidneys+following+unilateral+renal+ischemia-reperfusion.">Distinct effects on long-term function of injured and contralateral kidneys following unilateral renal ischemia-reperfusion.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 302 (5), 625-635 (2012).</li><li>Polichnowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+unilateral+ischemia-reperfusion+injury:+importance+of+renal+counterbalance+and+implications+for+the+AKI-CKD+transition.">Pathophysiology of unilateral ischemia-reperfusion injury: importance of renal counterbalance and implications for the AKI-CKD transition.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (5), 1086-1099 (2020).</li></ol>

Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter angående denna artikel.

Mus renala IRI-modeller är populära inom biomedicinsk forskning på grund av deras relativt låga driftskostnader och tillgången på olika transgena modeller12. Den ensidiga renala IRI-modellen som presenteras här efterliknar karakteristiska patologiska förändringar som observerats vid human renal IRI såsom tubulär dilatation, nekros och fibros13. Dessa resultat baseras på varierande reperfusionstider.
Kritiska steg i detta protokoll inkluderar upprätthållande av konstant kroppstemperatur och korrekt placering av kärlklämman i njurpedikeln. Kroppstemperaturen påverkar djurets ämnesomsättning14, vilket förändrar de experimentella resultaten både på fysiologiska och cellulära nivåer15. I denna modell stabiliserades kroppstemperaturen före operationen med hjälp av rektala och padsensorprober. Dessutom rekommenderas kontinuerlig övervakning av kroppstemperaturen under hela det kirurgiska ingreppet, särskilt innan kärlklämman placeras för att inducera ischemi.
Exponeringen av njuren och korrekt placering av kärlklämman är också avgörande för experimentets framgång. Skador på njurkapseln genom felaktig hantering av tången under exponering av njuren genom det kirurgiska snittet kommer att resultera i perirenal blödning och inflammation. Den vaskulära klämman ska placeras på njurpedikeln som täcker njurartären och njurvenen utan att påverka urinledaren och de suprarenala artärerna. Avgörande för detta steg är den noggranna dissektion av fettvävnaden som omger njurpulum14,16.
Denna modell är kostnads- och tidseffektiv. Anestesiförbrukningen per mus var 156,47 ± 37,88 μl (medelvärde ± SD, n = 17) av en prediluterad ketamin/xylazincocktail (1:10 ketamin, 1:50 xylazin, i saltlösningskoncentration, 100 mg/ml båda). Kirurgi kan utföras på relativt kort tid. Den totala operationstiden per mus var 53 ± 5,23 min (medelvärde ± SD, n = 17). Med utbildad personal kan flera operationer utföras samtidigt. I vår grupp utförde en erfaren forskare operationen tills klämman släpptes från njurpedikeln, medan en andra tog över från sårstängning tills musen återhämtade sig. Med detta tillvägagångssätt kunde vi utföra ett stort antal operationer på en enda dag. I den här modellen använde vi det dorsolaterala tillvägagångssättet, vilket resulterar i mindre trauma och minskad vätske- och värmeförlust från bukhålan jämfört med mittlinjemetoden16.
Tidigare publicerade protokoll har beskrivit njurpedikelspänningstekniken för att inducera akut njurskada hos möss 17,18,19. Men i dessa studier utfördes en kontralateral nefrektomi utöver den ensidiga IRI med ischemiska tider från 15 till 26 min. I detta protokoll inducerade vi ensidig ischemi i 30 minuter samtidigt som vi bevarade den kontralaterala njuren. Detta resulterade i en överlevnad på 100%. Denna modell är emellertid inte lämplig för att inducera azotemisk njurskada delvis på grund av den kompenserande effekten som utövas av den icke-kirurgiskt ingripna kontralaterala njuren. Att hålla en njure opåverkad hos samma djur ger dock fördelen att använda längre ischemitider med högre överlevnad. Utöver detta kan den kontralaterala njuren användas för att bedöma eventuella biverkningar av testläkemedel eller behandlingar som tillämpas under experimentproceduren och för att studera njur-njure-överhörningseffekter20,21. Till exempel har denna modell varit användbar för att visa reaktiva syreartsinducerade förändringar på cellnivå både i IRI och kontralaterala, icke-kirurgiskt ingripna njure11.
Denna modell har en potentiell tillämpning i studier som syftar till att identifiera och karakterisera markörer för ensidig njurskada, renala överhörningseffekter, post-renala IRI-inducerade hemodynamiska förändringar och potentiella nefrotoxiska effekter av läkemedelskandidater som ska användas vid renal IRI. Denna detaljerade beskrivning av de viktigaste patologiska förändringarna fungerar som ett värdefullt verktyg för att välja den lämpligaste tiden för att studera specifika cellulära processer, från inflammation och nekros (4 h till 2 dagar) till regenerering (4 dagar) och fibros (7 dagar och senare).

Njurarna är bland de högsta perfuserade organen i kroppen och är extremt mottagliga för förändringar i blodperfusion1. Renal ischemi-reperfusionsskada (IRI) är fortfarande den främsta orsaken till akut njursvikt 2,3 och är förknippad med hög sjuklighet och hög dödlighet hos sjukhusvårdade patienter4. Med begränsade terapeutiska alternativ tillgängliga,4,5 renal IRI är för närvarande i fokus för flera forskningsinsatser inom biomedicin 6,7 som syftar till utveckling av nya terapeutiska mål och karakterisering av tidiga och känsliga markörer för njurskada 8,9,10 . Att identifiera en tillförlitlig, tids- och kostnadseffektiv djurmodell anses vara avgörande för att möta dessa behov. Detta dokument presenterar en enkel och effektiv musmodell av ensidig njur-IRI. Ischemi induceras genom fastspänning av höger njurpedikel i 30 min11,12. En avgörande del av denna modell är att välja den lämpligaste reperfusionstiden som kommer att reproducera de patologiska händelserna av intresse, såsom tubulär nekros, polymorfonukleär inflammatorisk cellinfiltration eller fibros. Därför får forskare denna sekventiella översikt över representativa patologiska förändringar som förväntas i IRI-njuren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>PVS8700</td>
			<td>5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>PRMBURPEN22</td>
			<td>0.3 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial euthanasia solution</td>
			<td>various suppliers</td>
			<td>na</td>
			<td>e.g., Euthasol Virbac (sodium pentobarbital 390 mg/mL + sodium phenytoin 50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment Puralube</td>
			<td>Dechra Veterinary Products, KS, USA</td>
			<td>na</td>
			<td>3.5 g (1/8 oz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad RightTempJr</td>
			<td>Kent Scientific, CT, USA</td>
			<td>&#160;RT-JR-20</td>
			<td>Consider the one with two temperature probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>VED1220</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Vascular clamp</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc., Germany</td>
			<td>00398-02</td>
			<td>Jaw dimensions: 5.5 x 1.5 mm; length: 11 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Towel Drapes
</td>
			<td>Kent Scientific, CT, USA 
</td>
			<td>SURGI-5023-3
</td>
			<td>Disposable, individualy packed
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments (Graefe forceps, Halsted-Mosquito hemostat, scissors, etc)</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc., Germany</td>
			<td>Various</td>
			<td>Consider the extra fine straight scissor and the angled Graefe forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl suture</td>
			<td>Ethicon US, LLC</td>
			<td>J493G</td>
			<td>Size 5-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td>
			<td>VAM4821</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury

Ischemi-reperfusionsskada (IRI) är den främsta orsaken till akut njursvikt och är en betydande bidragsgivare till fördröjd transplantatfunktion. Djurmodeller är de enda tillgängliga resurserna som efterliknar komplexiteten i den IRI-associerade skada som uppstått in vivo. Detta dokument beskriver en effektiv musmodell av ensidig renal IRI som levererar mycket reproducerbara data. Ischemi induceras genom att ockludera höger njurpedikel i 30 minuter följt av reperfusion. Förutom det kirurgiska ingreppet kommer en sekventiell översikt över de förväntade fysiologiska och histopatologiska förändringarna efter njur-IRI att tillhandahållas genom att jämföra data från sju olika reperfusionstider (4 h, 8 h, 16 h, 1 dag, 2 dagar, 4 dagar och 7 dagar). Kritiska data för att planera experiment framåt, såsom genomsnittlig kirurgisk tid, genomsnittlig anestesiförbrukning och kroppsviktsförändringar över tid, kommer att delas. Detta arbete kommer att hjälpa forskare att implementera en tillförlitlig njur-IRI-modell och välja lämplig reperfusionstid som överensstämmer med deras avsedda utredningsmål.

Fysiologiska parametrar Möss återhämtade sig från denna ensidiga renala IRI-operation händelselöst; verkade aktiv och alert; och visade normalt ätande, drickande och beteende dagen efter. Vissa möss kan ha viktminskning efter IRI, även om det vanligtvis är mindre än 10% av den ursprungliga kroppsvikten (figur 2). Större viktminskningar (˃10%) kan vara skadliga, och dessa djur bör tas bort från studien. Skenopererade möss visade inte kroppsviktsförändringar efter operationen (mätt 24 timmar efter operationen). De flesta möss återhämtade sin ursprungliga kroppsvikt mellan dag 4 och 7 efter operationen (se IRI 7-dagars grupp, figur 2). Njurfunktionen kan bedömas med hjälp av traditionella markörer som blodurea kväve (BUN) och kreatinin. Dessutom inkluderades elektrolytnivåer i serum (natrium, kalium och klorid) och ett automatiserat differentiellt blodtal i analysen.
Histopatologiska förändringar Bedömning av histopatologiska fynd gjordes med användning av 4% paraformaldehydfixerade, paraffininbäddade hela mitten av sagittala delar av njuren färgade med hematoxylin / eosin (HE), periodisk syra Schiff och Massons trikromfläckar. De mest uppenbara förändringarna som produceras av denna ensidiga renala IRI-modell kan ses vid kortiko-medullär korsning, speciellt i de proximala tubulerna, tjocka stigande lemmar i Henles slinga och distala krökta tubuler, liksom i det rörformiga interstitiumet (se legenden för figur 3). Mikroskopiska bilder som visar de mest karakteristiska lesionerna efter IRI i njuren kan ses i figur 3. En förteckning över de histopatologiska fynden i följd finns i tabell 1.
Ett tubulärt skadepoängsystem utvecklades för att kategorisera skadan över tid (figur 4). I detta bedömdes fem definierade förändringar av tre olika utvärderare: 1) tubulär epiteldämpning; 2) borsta kantförlust; 3) tubulär nekros; 4) lysande obstruktion; och 5) närvaro av proteinhaltig gjutning. En uppgift av "1" indikerar att ändringen är närvarande, "0" att den är frånvarande.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig01.jpg"> Figur 1: Experimentell njur-IRI-modell i mus. Observera förändringarna i färgen på höger njure till mörkröd under ischemi (B) till rosa under reperfusion (C). (D) Makroskopiskt utseende hos IRI höger njure (röd pil) jämfört med den kontralaterala icke-IRI-njuren hos samma djur 24 timmar efter operationen. Röd pil i (B) visar positionen för den hemostatiska klämman. Förkortning: IRI = Ischemi-reperfusionsskada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig02.jpg"> Figur 2: Kroppsvikt hos möss före och efter njur-IRI. Individuella data visas. Förkortningar: IRI = Ischemi-reperfusionsskada; h = timmar; d = dagar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig03.jpg"> Figur 3: Typiska mikroskopiska lesioner observerade i cortex och kortiko-medullär korsning av IR-opererade möss. Sham och olika reperfusionstider visas (anges ovanför varje bild). (A) Intakta strukturer visas i bluff (förstoring 40x; skalstreck = 20 μm). Pilar i IRI 4 h indikerar närvaron av proteinhaltig gjutning i den rörformiga lumen (förstoring 40x; skalstång = 20 μm). Pilar i IRI 8 h visar rörformig dilatation (förstoring 40x; skalstreck = 50 μm). Svart pil i IRI 16 h visar rörformig gjutning i medullära segment; vita pilar visar områden med cellulär nekros (förstoring 40x; skalstreck = 50 μm). Svarta pilar i IRI 1 d indikerar rörformig dilatation (förstoring 10x; skalstreck = 100 μm). Svart pil i IRI 2 d visar förstorade cellkärnor; vita pilspetsar visar områden med lymfocytinfiltration och makrofaginfiltration (förstoring 40x; skalstreck = 50 μm). Vita pilspetsar i IRI 4 d indikerar mitotiska rörformiga celler (förstoring 40x; skalstreck = 50 μm). Svart pil i IRI 7 d visar ett område med fokal fibros; vit pilspets visar ett regenereringsområde (förstoring 20x; skalstreck = 100 μm). (B) PAS-färgning som visar njurbarken hos möss under tidig reperfusion (4 timmar, 8 timmar och 16 timmar). Observera den progressiva dämpningen av penselkanten (pilar). Förstoringar 40x; skalstreck = 50 μm (C) Masson trikrom färgning av bluff och IRI 7 d möss som visar områden med interstitiell fibros (vita pilar). Förstoring 40x; skalstänger = 50 μm. Förkortningar: IRI = Ischemi-reperfusionsskada; Glo = glomerulus; PCT = proximal krökt tubuli; DCT = distal krökt tubuli; CD = uppsamlingskanal; PAS = periodisk syra Schiff; d = dag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig04.jpg"> Figur 4: Tubulär skadepoäng för bluff- och IRI-opererade möss. Poängsystem skala 1 till 5 för tubulär epiteldämpning; borstgränsförlust; tubulär nekros; lysande obstruktion; och närvaro av proteinhaltig gjutning. En uppgift av "1" indikerar att ändringen är närvarande, "0" att den är frånvarande. Individuella värden visas. Staplar representerar medelvärdet ± SD (n = 4). Förkortning: IRI = Ischemi-reperfusionsskada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tid efter IRI</td>
			<td>De mest signifikanta patologiska förändringarna</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 timmar</td>
			<td>Rörformig obstruktion</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Protein gjutet i lumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 timmar</td>
			<td>Tubulär dilatation</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Begynnande nekros</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Dämpning av epitel</td>
		</tr>
<tr>
<td>16 timmar</td>
			<td>Cellulär nekros</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Rörformig gjutning</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Neutrofil infiltration</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 dag</td>
			<td>Nekros</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Tubulär dilatation</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Neutrofil infiltration</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 dagar</td>
			<td>Tubulär dilatation</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Lymfocyt- och makrofaginfiltration</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Förstorade cellkärnor</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 dagar</td>
			<td>Framträdande mitotisk aktivitet i tubuliceller</td>
		</tr>
<tr>
<td>7 dagar</td>
			<td>Fokal fibros</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Områden för förnyelse</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: De mest signifikanta patologiska förändringarna över tid. Diagnostiserad baserat på mikroskopisk undersökning av 4-6 djur per grupp.

Watch this Scientific Journal Video about An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury at JoVE.com

An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury

Renal ischemi-reperfusionsskada är förknippad med hög sjuklighet och dödlighet hos sjukhuspatienter. Här presenterar vi en enkel och effektiv musmodell av ensidig njurischemi-reperfusionsskada och ger en sekventiell översikt över representativa patologiska förändringar som observerats i njuren.

En effektiv musmodell av ensidig njurischemi-reperfusionsskada

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models ...

Renal ischemi-reperfusionsskada är den främsta orsaken till akut njursvikt. Denna modell är till stor hjälp för att förstå de patofysiologiska förändringar som uppstår i njurarna efter en ischemisk förolämpning. Denna modell är tids- och kostnadseffektiv och levererar mycket reproducerbara data.Utöver detta tillåter denna ensidiga njurischemimodell forskaren att arbeta med längre ischemiska tider samtidigt som en hög överlevnad upprätthålls. Till att börja med placerar du den bedövade musen på operationsbordet. Efter sterilisering av det kirurgiska området, använd ett skalpellblad för att göra ett cirka en centimeter dorsal lateralt kirurgiskt snitt på höger flank bakom revbenet och fortsätt att krama ungefär en centimeter parallellt med ländryggens mittlinje.Transekt bukmuskulaturen med sax för att visualisera retroperitonealutrymmet. Använd en steril bomullspinne för att ta bort de små mängder blod som produceras under sektionering av musklerna. Tryck sedan ut höger njure från bukhålan.Långsamt och försiktigt exponera njuren med grå pincett och identifiera njurpedikeln. Ta sedan försiktigt bort fettvävnaden runt pedikeln. Använd en Halsted Mosquito Hemostat för att manipulera kärlklämman.För att inducera ischemin, placera kärlklämman över njurartären och venen som finns i njurpedikeln och undvik att klämma fast den intilliggande urinledaren. Täck den klämda njuren med steril gasbindning som blötläggs i saltlösning för att undvika uttorkning. Lämna njurarna på gasbindningen i 30 minuter och övervaka anestesidjupet och fuktigheten hos gasbindningen regelbundet.Strax före slutet av ischemiperioden, avslöja njuren och håll Halsted Mosquito Hemostat, redo för klämborttagning. Vid slutet av ischemiperioden öppnar du kärlklämman med hemostaten och tar bort klämman för att tillåta perfusion av njurarna. För skenkontrolldjur, utför den demonstrerade operationen utan fastspänning av njurpedikeln.Efter att ha verifierat njurfärgförändringen, återför njuren till bukhålan. Stäng magmusklerna i ett korsmönster med absorberbar sutur 5-0. Stäng huden i ett horisontellt madrassmönster med absorberbar sutur 5-0.Rengör såret med povidon-jodlösning. Efter ischemiperfusionsskadan sågs viktminskning hos vissa möss med mindre än 10% av den ursprungliga kroppsvikten. De flesta möss återhämtade dock sin ursprungliga kroppsvikt mellan dag 4 och 7 efter uppväxt.Kontrollmössen visade inga kroppsviktsförändringar efter operationen. Flera förändringar i njurmorfologin efter operationen identifierades med användning av hematoxylin-eosin, periodisk syra-Schiff och Massons Trichrome-färgning. Närvaron av proteinhaltig gjutning i den rörformiga lumen observerades efter fyra timmar.Tubulär dilatation detekterades vid åtta timmar och tubulär gjutning samt cellulär nekros i medullära segment märktes vid 16 timmar efter IRI-operationen. Efter 24 timmar efter operationen observerades tubulär dilatation. Infiltration av lymfocyter och makrofager och förstorade cellkärnor detekterades efter 48 timmar.Vid dag 4 observerades mitotiska rörformiga celler och vid dag 7 efter IRI-kirurgi upptäcktes fokal fibros. Njurbarken hos mössen under tidig reperfusion övervakades med PAS-färgning och progressiv dämpning av borstgränsen var synlig. Områdena för interstitiell fibros vid dag 7 efter operationen visualiserades med Massons Trichome-färgning.Ett rörformigt skadepoängsystem utvecklades för att kategorisera skadan över tid. De högsta tubulära skadepoängen erhölls mellan 8 timmar och 24 timmar efter renal IRI. Några av de mest kritiska stegen är korrekt placering av kärlklämman i njurpedikeln och upprätthållande av en konstant kroppstemperatur under operationen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury

Normothermic hjärtstopp och hjärt-lungräddning: en musmodell av ischemi-reperfusion skada

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischemi-reperfusion modell av akut Kidneyskadan och efter skada Fibros i möss

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Renal Ischaemia Reperfusion Injury: A Mouse Model of Injury and Regeneration

Renal Ischemi Reperfusionsskada: En musmodell av skada och Regeneration

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Syre Glukos Deprivation och ny syresättning som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischemi-reperfusion skada modell för att studera blodhjärnbarriären dysfunktion

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Murina Modell av Intestinal ischemi-reperfusionsskada

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

En musmodell av retinal ischemi-reperfusion skada genom Elevation av det intraokulära trycket

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

Two-vessel Occlusion Mouse Model of Cerebral Ischemia-reperfusion

Två-fartyget ocklusion musmodell av Cerebral ischemi-reperfusion

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Utvärdering av Koronarflödesreserv efter myokardischemi Refusion hos råttor

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

En preklinisk råtta modell för studiet av ischemia-reperfusion skada i rekonstruktiv microsurgery

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

Fördröjd Intramyokardiell leverans av stamceller efter Ischemia Reperfusion Skada i en Murine Modell

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...