Name: rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate at JoVE.com

يشكر المؤلفان زاكاري صن وريتشارد موراي (معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا) على التكرم بتوفير جهاز P_araBAD-gamS، وكيكو كامي (معهد كيوتو للتكنولوجيا) لتكرمهم بتوفير جهاز طرد مركزي عالي السرعة للتبريد. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة ومن برنامج ARO MURI، وتم دعمه جزئيا من قبل المبادرة الرائدة للباحثين الشباب الممتازين، MEXT، اليابان.

1. إعداد الوسائط والمخازن المؤقتة.
<ol><li>إعداد المتوسطة 2xYTPG.<ol>
<li>مزيج 62 غ 2xYT مسحوق، 5.99 غرام فوسفات البوتاسيوم أحادية، 13.93 غرام فوسفات البوتاسيوم ديباسيك، والمياه deionized إلى 2 L.</li>
		<li>الأوتوكلاف على دورة السائل مع وقت التعرض من 30 دقيقة14.</li>
		<li>إلى 400 مل من وسائط 2xYTP من 1.1.2، أضف 7.2 غرا...

<ol>
	<li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+metabolic+engineering:+biomanufacturing+beyond+the+cell.">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+in+proteomics+and+biotechnology.">Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology.</a> New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions.">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. 86, 60-72 (2015).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+circuit+performance+characterization+and+resource+usage+in+a+cell-free+"breadboard".">Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard".</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).</li><li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells.">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027 (2018).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).</li><li>Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+reduce+variability+in+E.+coli-based+cell-free+protein+expression+systems.">Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cell+on+a+chip+integrated+with+protein+degradation.">Artificial cell on a chip integrated with protein degradation.</a> 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).</li><li>Garibaldi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+autoclave+protocols+for+successful+decontamination+of+category+A+medical+waste+generated+from+care+of+patients+with+serious+communicable+diseases.">Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).</li><li>Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Fujiwara, K., Doi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+preparation+of+cell+extract+for+cell-free+protein+synthesis+without+physical+disruption.">Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption.</a> PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).</li></ol>

البروتوكول الموصوف هنا ينتج lysate البكتيرية نشطة للغاية للتعبير الجيني الخالي من الخلايا. المفتاح هو استخدام الخلايا التي تحمل pAD-LyseR البلازميد، الذي يعبر عن لامبدا فاج إندوليسين سيوليكالي. هذه الخلايا هي قوية لlyse أنفسهم عند permeabilization من الغشاء الداخلي، مما يسمح للاندوريسين الوصول إلى جدار ...

التعبير الجيني في الخلايا الخالية من الخلايا lysates له العديد من المزايا على استخدام الخلاياالحية1،2،3،4. يمكن تعديل اللسات بسهولة كيميائيا حيوية واستخدامها في ظروف يمكن أن تكون ضارة أو مستحيلة التحقيق في الخلايا الحية. لا يتعين على دوائر التعبير الجيني أن تتنافس أو تتنافس مع العمليات البيولوجية المضيفة، واختبار الدوائر الجينية الجديدة بسيط مثل إضافة الحمض النووي. لهذه الأسباب، وجدت التعبير الجيني الخالي من الخلايا تطبيقات مختلفة، من أجهزة الاستشعارالحيوية 5،6 إلى النماذج الأولية بسرعة دوائر الجينات الاصطناعية7،8 لتطوير الخلايا الاصطناعية9. معظم التعبير الجيني الخالي من الخلايا يستخدم الخلايا الlysates التي تم تجهيزها بشكل كبير، تتطلب عموما بروتوكولات طويلة ومعقدة، والمعدات المتخصصة، و / أو الخطوات الحساسة التي يمكن أن تؤدي إلى اختلاف كبير بين المستخدمين والدفعات10،11.
تصف هذه الورقة طريقة بسيطة وفعالة لإنتاج lysate خالية من الخلايا التي تتطلب الحد الأدنى من المعالجة والخبرة (الشكل 1A)12. تعتمد الطريقة على خلايا الإشريكية القولونية التي تم تصميمها للليس بعد دورة تجميد ذوبان بسيطة. الخلايا تعبر عن انداليسين من لامبدا phage التي تتحلل جدار الخلية. كما تنمو الخلايا, هذا الإندولاسين لا يزال في السيتوبلازم, عزل من جدار الخلية. ومع ذلك ، فإن دورة التجميد والذوبان البسيطة تعطل الغشاء السيتوبلازمي ، وتطلق الإندوريسين في periplasm ، حيث تتحلل جدار الخلية ، مما يؤدي إلى تحلل سريع للخلية. يمكن الانتهاء من البروتوكول مع بضع ساعات فقط من العمل العملي ويتطلب فقط ثلاجة، جهاز طرد مركزي قادر على 30،000 × غرام (للحصول على نتائج مثالية؛ يمكن استخدام سرعات أقل مع مزيد من الرعاية لعدم إزعاج بيليه)، خلاط دوامة، ومحلول عازل بسيط. يمكن حتى أن تنتج lysate وظيفية عن طريق تجميد تجفيف الخلايا وإعادة ترطيب لهم في الموقع. ومع ذلك، تنتج هذه الطريقة lysates مع نشاط أقل، ويفترض أن يرجع ذلك إلى حطام الخلية المتبقية.
الlysates نشطة للغاية للتعبير الجيني الخالي من الخلايا ، ويمكن تعزيزها بطرق مختلفة اعتمادا على الاستخدام النهائي. يمكن زيادة معدل تخليق البروتين عن طريق تركيز اليزيت باستخدام المكثفات الدورانية القياسية. يمكن حماية الحمض النووي الخطي من التدهور عن طريق إضافة بروتين GamS المنقى. يمكن تحقيق تدهور البروتين ، الضروري لديناميكيات الدوائر الأكثر تعقيدا مثل التذبذب ، من خلال التعبير المشترك عن سداسي ClpX في سلالة إنتاج التحلل التلقائي13. وأخيرا، يتم تمكين قراءات البصرية المستندة إلى LacZ باستخدام سلالة autolysate تفتقر إلى lacZ. بشكل عام، ينتج هذا الأسلوب lysate الخالية من الخلايا النشطة للغاية التي تناسب مجموعة واسعة من التطبيقات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT media</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4.85008</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A0166-5G</td>
			<td>or carbenicillin, a more stable variant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>14121</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (dextrose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1749603</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) &#916;lacZ carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>16800</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446075</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1501-100G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473-25G</td>
			<td>for adjusting pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9310500GM</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>23160</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate

التعبير الجيني الخالي من الخلايا يوفر قوة البيولوجيا دون مضاعفات الكائن الحي. على الرغم من وجود العديد من أنظمة التعبير الجيني هذه ، فإن معظمها مكلف للغاية لشراء و / أو تتطلب معدات خاصة وخبرة شحذ بدقة لإنتاج فعال. يصف هذا البروتوكول طريقة لإنتاج ليسات خالية من الخلايا البكتيرية تدعم مستويات عالية من التعبير الجيني ، وذلك باستخدام معدات المختبر القياسية فقط وتتطلب الحد الأدنى من المعالجة. تستخدم الطريقة سلالة الإشريكية القولونية التي تنتج الإندوريسين الذي لا يؤثر على النمو ، ولكنه يقوم بكفاءة بفرز بيليه الخلية المحصودة بعد دورة تجميد ذوبان بسيطة. والمعالجة الإضافية الوحيدة المطلوبة هي حضانة قصيرة يتبعها الطرد المركزي لتطهير الخلايا من الحطام الخلوي. يمكن تحقيق الدوائر الجينية الديناميكية من خلال التعبير عن heterologous من protease ClpX في الخلايا قبل الحصاد. يمكن استخدام سلالة الإشريكية القولونية التي تفتقر إلى جين lacZ لتطبيقات الاستشعار الحيوي عالية الحساسية والخالية من الخلايا باستخدام قراءات ملونة أو فلورية. يتطلب البروتوكول بأكمله ما لا يزيد عن 8-9 ساعات ، مع 1-2 ساعة فقط من العمل العملي من التطعيم إلى الانتهاء. ومن خلال خفض التكلفة والوقت للحصول على ليسات خالية من الخلايا، ينبغي أن تزيد هذه الطريقة من القدرة على تحمل تكاليف التعبير الجيني الخالي من الخلايا لمختلف التطبيقات.

ويمكن ملاحظة النتائج التمثيلية باستخدام autolysate للتعبير عن GFP من البلازميد التعبير التأسيسي، وهنا pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500، وتسجيل مسار زمني من مضان GFP في قارئ لوحة(الشكل 1B). وجدت سلسلة تمييع الحمض النووي البلازميد تعبيرا قويا حتى في الحمض النووي 1 nM. بالمقارنة مع lysate المتاحة تجاريا...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate at JoVE.com

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وبسيطة لإنتاج اليزحات البكتيرية للتعبير الجيني الخالي من الخلايا ، وذلك باستخدام سلالة هندسية من الإشريكية القولونية وتتطلب معدات مختبرية قياسية فقط.

إنتاج سريع وبأسعار معقولة وغير معقد من ليسات خالية من الخلايا البكتيرية

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

وباستخدام هذا البروتوكول، يمكن إنتاج lysates الخلايا البكتيرية عالية الجودة باستخدام معدات المختبر المشتركة المتاحة على نطاق واسع فقط، مما يجعل التعبير الجيني الخالي من الخلايا في متناول معظم الباحثين بسهولة. الجمع بين برنامج التحلل الذاتي الخلوي مع تجميد ذوبان أو تجميد الجافة دورة يسمح خلق نهج عملي، والعمل وفعالة من حيث التكلفة للإنتاج السريع من التحللات البكتيرية للتعبير الجيني خالية من الخلايا. ابدأ باستخدام حلقة تلقيح لتكسير خلايا سلالة E.coli التحلل التلقائي على لوحات أجار LB التي تحتوي على 50 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسلين، ثم احتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.في اليوم التالي، وذلك باستخدام طرف ماصة، واختيار مستعمرة واحدة من لوحة أجار وإضافته إلى أنبوب الثقافة التي تحتوي على LB المتوسطة مع الأمبيسلين. تنمو هذه الثقافة بداية في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، إضافة 400 ميكرولتر من ثقافة المبتدئين في قارورة Erlenmeyer لتر واحد تحتوي على 400 ملليلتر من المتوسط 2xYTPG تكملها 50 ميكروغرام لكل ملليلتر الأمبيسلين.احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 300 دورة في الدقيقة. باستخدام مطياف وcuvette البصرية مع طول مسار سنتيمتر واحد، وقياس دوري الكثافة البصرية للثقافة في 600 نانومتر. عندما تتجاوز الكثافة البصرية واحدة، ابدأ في تمييع الثقافة خمسة أضعاف قبل القياسات لضمان بقاء القياسات ضمن النطاق الخطي لمطياف مختبر نموذجي.بمجرد أن تصل الكثافة البصرية للثقافة المخففة ذات الخمسة أضعاف إلى 0.3 ، قم بإزالة القارورة من الحاضنة وشرع في إعداد الليحات. لإعداد اللستات، احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1، 800 × ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. صب قبالة supernatant وإزالة السائل المتبقي باستخدام ماصة.إضافة 45 ملليلتر من العازلة S30A الباردة إلى بيليه وإعادة إنفاق بيليه عن طريق الدوامة. ثم، وزن أنبوب طرد مركزي فارغ 50 ملليلتر قبل نقل الخلايا إلى الأنبوب. طرد الخلايا مرة أخرى والتخلص من supernatant.يستنشق أي ما تبقى من الناسخة باستخدام ماصة. وزن الأنبوب مرة أخرى وطرح وزن الأنبوب الفارغ من الوزن المعروض للحصول على وزن بيليه. لكل ملليغرام واحد من بيليه الخلية، إضافة اثنين من ميكرولتر من العازلة S30A الباردة تكملها مع اثنين من dithiothreitol ملليمول.ثم، إعادة إنفاق الخلايا عن طريق دوامة قوية. بعد ذلك ، تجميد الخلايا عن طريق وضعها في تجميد سالب 20 أو 80 درجة مئوية سالبة حتى يتم تجميد بيليه تماما ، ثم إذابة الخلايا في حمام الماء درجة حرارة الغرفة ودوامة بقوة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز في 300 دورة في الدقيقة، ثم مسح عينة من الحطام الخلوي الثقيل عن طريق الطرد المركزي في أنابيب الطرد المركزي شفافة في 30،000 × غرام لمدة 45 دقيقة في أربع درجات مئوية.نقل بعناية supernatant إلى أنبوب جديد مع ماصة، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه. إذا كان الناطور المنقول ملوثا بمواد من الكريات ، فتكرر الطرد المركزي. نقل الناطور إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر.والطرد المركزي مرة أخرى في 21، 000 x ز أو السرعة القصوى للطرد المركزي الطاولة لمدة خمس دقائق. Aliquot مسح autolysate في المجلدات المطلوبة وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية حتى الاستخدام. للتعبير الجيني الخالي من الخلايا باستخدام المزج التلقائي، اخلط ثمانية ميكرولترات من التلاء التلقائي و8.9 ميكرولتر من المزيج المسبق على الجليد.إضافة الحمض النووي إلى تركيز النهائي من ثمانية نانومول، أي الكواشف الضرورية الأخرى والمياه للحصول على حجم النهائي من 20 ميكرولتر. أضف التفاعل إلى لوحة صغيرة 384 جيدا واستخدم قارئ لوحة لقياس مسار وقت الفلورسينس ونقاط النهاية. GFP التعبير باستخدام autolysate مع سلسلة تخفيف من الحمض النووي البلازما النتائج في تعبير قوي حتى مع الحمض النووي نانومولار واحد.عند مقارنة التعبير GFP بين lysate المتاحة تجاريا و autolysate، أنتجت autolysate مستويات مماثلة من GFP. كان التباين بين دفعات من اليسات المنتجة في مختبرين مختلفين من قبل باحثين مختلفين ضمن حوالي شقين. المتغيرات الثلاثة الأكثر أهمية هي نسبة بيليه الخلية إلى المخزن المؤقت ، ونقل supernatant خالية من الحطام واستخدام تركيز PEG والمغنيسيوم الأمثل في رد الفعل النهائي.وبمجرد إعداد المستخلص، يمكن استخدام ترسانة كبيرة من البروتوكولات القائمة التي تم تطويرها لأنظمة التعبير الخالي من الخلايا E.coli، مثل التدهور بوساطة ClpXP، أو استشعار النصاب القانوني بوساطة AHL.

Research

JoVE Journal

Biology

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

الحفاظ على الولبخية في الخلية خالية متوسطة

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

يعاير Proteasomal تدهور في نظام خالية من الخلايا في النباتات

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Construction of an Affordable and Easy-to-Build Zebrafish Facility

بناء على بناء سهلة لمرفق الزرد بأسعار معقولة و

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

هجين طريقة استخراج الحمض النووي للتقييم النوعي والكمي للمجتمعات البكتيرية من عينات الدواجن الإنتاج

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

نظم هيلا خلية استنادا حرية التعبير للتعبير عن<em&gt; المتصورة</em&gt; المقيرع البروتينات

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

التصور النوعي والكمي للطبقة خالية من الخلايا في الشرايين من العضلات الفئران المشمرة

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

الإنتاج والتصور جدارها البكتيرية وبروتوبلاستس لتميز التعريب الببتيد مضادات الميكروبات

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

جمع الحيوانات المنوية وتحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر في نموذج Teleost اليابانية Medaka (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

تحليل السكان والخلية المفردة لاستمرار المضادات الحيوية في الإشريكية القولونية

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

Embedding CFPS Reactions in a Variety of Hydrogel Matrices

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

A Novel Approach for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Hydrogels (Video) | JoVE

طرق تضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا في الهلاميات المائية على نطاق واسع

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...